木薯MYB轉錄因子基因MeMYB60表達特征分析及其互作蛋白篩選

徐子寅 于曉玲 鄒良平 趙平娟 李文彬 耿夢婷,* 阮孟斌,*

木薯MYB轉錄因子基因表達特征分析及其互作蛋白篩選

徐子寅1于曉玲2,3鄒良平2,3趙平娟2,3李文彬2,3耿夢婷1,*阮孟斌2,3,*

1海南大學熱帶作物學院, 海南?？?570228;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 / 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室, 海南海口 571101;3海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院 / 海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用重點實驗室, 海南?？?571101

Myeloblastosis (MYB)類轉錄因子在植物對非生物脅迫的響應過程中起重要調控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成員表達模式的基礎上, 篩選并克隆到了一個R2R3-MYB轉錄因子基因?；虮磉_特性分析表明, 該基因在葉片特異表達, 受干旱、低溫負調控, 同時對ABA處理也有響應。啟動子活性分析發(fā)現(xiàn),可以在保衛(wèi)細胞表達, 預示著該轉錄因子基因的表達可能與木薯氣孔開閉調節(jié)有關。編碼蛋白主要定位于細胞核中, 具有轉錄激活活性, 其轉錄激活結構域在蛋白C端第194～343氨基酸殘基范圍內(nèi)。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸殘基片段為誘餌, 從干旱脅迫后木薯葉片的cDNA文庫中篩選到18種可能與MeMYB60互作的蛋白, 酵母雙雜確定了MeCatlase1和MeCatalase2分別與MeMYB60存在互作關系。本研究為深入研究轉錄因子MeMYB60在木薯響應非生物脅迫過程中的功能并解析其調控網(wǎng)絡奠定了基礎。

木薯; 非生物脅迫; MYB轉錄因子; 表達特征; 互作蛋白篩選

MYB轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一, 其家族成員在植物中具有多樣化的功能。MYB轉錄因子的MYB結構域可與相應的DNA順式作用元件結合, 許多功能基因的啟動子區(qū)域都含有可被MYB轉錄因子識別并結合的順式作用元件, 但不同的MYB轉錄因子識別的順式作用元件在序列上存在差異[1]。通過調控下游基因的轉錄, MYB轉錄因子在植物中廣泛參與了基本和次生代謝、細胞命運分化、細胞發(fā)育過程以及響應脅迫的信號傳導過程中[1-7]。

在模式植物中及主要農(nóng)作物中, 針對非生物脅迫相關MYB轉錄因子功能及調控機制的研究持續(xù)受到關注。為挖掘木薯非生物脅迫相關MYB轉錄因子基因, 本實驗室利用PFAM數(shù)據(jù)庫中的MYB保守結構域PF00249 (myb-like DNA-binding domain)對木薯基因組進行BLAST分析(http://www.phytozome. net/), 獲得318個具有完整開放閱讀框的MYB類基因序列[8]。另外, 部分R2R3-MYB轉錄因子基因與干旱脅迫條件下木薯葉片的脫落有關[9]。通過全基因組關聯(lián)分析, 研究人員發(fā)現(xiàn)木薯基因可能與木薯葉片寬度有關[10]。隨后, 通過目標基因重測序及關聯(lián)分析證實了與木薯抗旱性顯著相關, 是一個潛在的、可用于木薯遺傳改良的候選基因[11]?；诨虮磉_分析結果, 本實驗室在轉基因木薯中驗證了轉錄因子的抗逆功能,發(fā)現(xiàn)該轉錄因子基因負調控木薯對干旱和低溫的耐受性[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)負調控木薯葉片失水率, 并且可以與氣孔開閉調節(jié)相關蛋白互作[12]。

氣孔是陸地植物與外界環(huán)境之間進行氣體和水分交換的主要結構, 氣孔密度及開閉調節(jié)是植物應對干旱脅迫的重要調控方式[13]。模式植物中的研究表明, MYB轉錄因子在氣孔發(fā)育及開閉調節(jié)過程中均起著重要的作用[1]。例如, 擬南芥MYB類轉錄因子GTL1可以與啟動子區(qū)上的GT順式作用元件結合, 抑制基因的轉錄, 從而控制氣孔的發(fā)育, 影響氣孔密度[14-16]。最近, 有研究者發(fā)現(xiàn)擬南芥的表達直接影響到氣孔的分布[17]。MYB轉錄因子除在氣孔發(fā)育過程起重要調控作用以外, 在氣孔運動調節(jié)過程中也起著關鍵作用。例如, 擬南芥可特異在保衛(wèi)細胞中表達, 通過調控脂氧化物的合成參與氣孔開閉調節(jié), 影響植物抗旱性[18-20]。擬南芥也可以在保衛(wèi)細胞中表達, 過表達該基因的擬南芥葉片氣孔孔徑明顯縮小, 對ABA誘導的氣孔關閉更加敏感[21]。在干旱脅迫條件下, 擬南芥參與ABA信號傳導, 通過調控氣孔關閉和表皮臘質合成影響植株的抗旱性[22-23]。

木薯(Crantz)是一種重要的熱帶作物, 其塊根的碳水化合物含量可達38%, 并且含有多種維生素, 是全球近10億人口的主要營養(yǎng)來源[24]。木薯在幼苗期易受干旱和低溫等環(huán)境危害, 提高栽培品種的抗逆能力是保障木薯產(chǎn)量和品質的重要前提, 挖掘木薯抗逆基因可為通過遺傳改良培育抗逆木薯新品種提供基因資源和改良策略。本文利用同源比對法克隆了木薯基因, 分析了該基因在木薯不同組織中的特異表達模式以及對干旱、低溫和ABA處理的響應。通過啟動子特性分析發(fā)現(xiàn)可以在保衛(wèi)細胞特異表達。具有明顯的轉錄激活功能, 其編碼蛋白主要定位于細胞核中。本文通過酵母雙雜系統(tǒng)從木薯葉片cDNA文庫中篩選到部分可能與MeMYB60互作的候選蛋白, 并初步驗證了MeMYB60與2個過氧化氫酶的互作關系。研究結果為進一步研究的功能及分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型煙草(本生煙)、野生型擬南芥(Col-0)、木薯品種cv.60444均由本實驗室保存。將木薯成熟莖桿分成約30 cm的莖段, 扦插于裝滿基質(沙土∶營養(yǎng)土∶蛭石)的花盆中置于玻璃溫室中培養(yǎng), 萌發(fā)后生長60 d的盆栽苗用作試驗材料。以停水的方式對木薯盆栽苗進行干旱處理, 以正常供水的盆栽苗為對照。監(jiān)測土壤相對含水量, 澆水當天土壤相對含水量為25%～35%之間, 澆水后的第4天選取土壤相對含水量為10%左右的盆栽苗繼續(xù)進行干旱處理, 2 d后取土壤相對含水量為2.5%左右的盆栽苗進行取樣。分別收集對照和處理植株的成熟葉片, 選擇從頂芽開始往下的第4、第5、第6三片成熟葉片于液氮中速凍,-80℃保存?zhèn)溆?。將盆栽苗移入控溫培養(yǎng)箱, 以8～10℃的溫度對盆栽苗進行低溫處理, 處理12 h后收集成熟葉片; 以100 μmol L–1的ABA溶液噴施成熟葉片, 以水噴施葉片作為對照, 處理12 h后收集葉。各處理的樣品在采樣時放入液氮速凍, –80℃保存?zhèn)溆?。啟動子分析所用的轉基因擬南芥通過花序侵染法[25]轉化野生型擬南芥獲得。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司(目錄號: DP441); 反轉錄試劑盒(目錄號: D2639A)和qRT-PCR所用的SYBR Premix ExII Kit (目錄號: DRR081A)購自寶生物有限公司; 各種引物合成以及載體測序由上海生工生物工程有限公司完成; 2′PCR反應體系購自天根生化科技(北京)有限公司(目錄號: KT201-02); PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(目錄號: DR02)、質粒提取試劑盒(目錄號: PL03)購自艾德萊生物有限公司; 大腸桿菌DH5a、農(nóng)桿菌GV3101和酵母Y2HGold感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術有限公司; Clontech酵母雙雜交試劑盒(目錄號: 630489)及酵母培養(yǎng)基購自寶生物有限公司; 植物表達載體由本實驗室改造保存。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取各凍存材料的總RNA。按反轉錄試劑盒操作說明合成cDNA作為PCR反應的模板。

1.3 MeMYB60基因克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein)中木薯XP_021622445.1編碼基因的序列信息, 設計了相應的PCR引物, 用于克隆基因全長片段, 具體引物信息見表1。以木薯cv.60444盆栽苗成熟葉片的cDNA為模板, 以_I_R I_5'和H I_3￠為引物, 通過PCR克隆了開放閱讀框的全長, 并測序驗證了全長序列的準確性。

1.4 生物信息學分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein)中下載了包括擬南芥在內(nèi)的其他21種植物的MYB60蛋白序列, 以MEGA7 (V7.0.14)軟件對蛋白的氨基酸序列進行分析, 利用Neighbor-Joining法構建了系統(tǒng)進化樹。利用VectorNTI (V10.3.0)軟件包中的AlignX分析了木薯XP_021622445.1與MeMYB2以及橡膠樹、擬南芥、蓖麻中MYB60蛋白氨基酸序列的同源性。

1.5 MeMYB60基因表達模式分析

根據(jù)從木薯cv.60444中獲得基因全長序列信息設計qRT-PCR引物_QP1和_QP2 (表1), 以Phytozome數(shù)據(jù)庫中木薯()為內(nèi)參基因, 設計引物_QP1和_QP2 (表1)。以各材料的cDNA為模板, 先通過半定量PCR確定基因在木薯葉片、葉柄和根的組織表達特異性, 再通過qRT-PCR分析不同處理條件下基因在木薯葉片中的表達差異。qRT-PCR反應按寶生物公司SYBR Premix ExII Kit (目錄號: DRR081A)操作說明書進行?；蛳鄬Ρ磉_量以2–DDCt來計算。以GraphPad Prism 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行計算分析并作圖。

表1 PCR引物名稱及序列

1.6 亞細胞定位

通過I和H I內(nèi)切酶位點將基因全長片段分別與植物表達載體上的融合, 構建植物表達載體, 測序正確的質粒轉化農(nóng)桿菌GV3101, 以載體為對照, 經(jīng)鑒定后的農(nóng)桿菌工程菌用于按照煙草瞬時轉化的方法注射煙草葉片下表皮, 注射3 d后觀察綠色熒光蛋白的亞細胞定位。

1.7 啟動子活性分析

在Phytozome木薯基因組數(shù)據(jù)庫(https:// phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)中查詢(Manes.09G135700.1)序列信息, 以其編碼區(qū)起始密碼ATG上游1500 bp片段為啟動子區(qū), 設計相應引物(表1)。以木薯cv.60444基因組DNA為模板, 利用_Promoter_5'和HI3'引物, 通過PCR方法克隆包括編碼區(qū)DNA片段和起始密碼ATG上游1500 bp的基因組DNA片段, 測序驗證序列的準確性。利用MeMYB60_promoter_I_5'和MeMYB60_ promoter_I_3'為引物克隆啟動子, 通過I和I內(nèi)切酶位點將測序正確后的啟動子片段替換植物表達載體上的CMV 35S啟動子, 構建載體。經(jīng)測序正確質粒轉化農(nóng)桿菌GV3101, 隨后轉化野生擬南芥, 在含潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上篩選轉化后的種子以獲得陽性植株, 將后代分離比符合3∶1的植株用于啟動子活性分析。通過觀察GFP蛋白的綠色熒光定位來分析啟動子轉錄調控的組織特異性。

1.8 轉錄自激活活性分析

通過R I和H I內(nèi)切酶位點將基因編碼區(qū)全長片段插入酵母表達載體中, 構建載體為了確定MeMYB60轉錄激活結構域所在位置, 利用PCR對基因3￠端進行部分刪除, 獲得一系列3￠端刪除片段, 利用R I和H I內(nèi)切酶位點分別將不同的截短片段插入載體, 構建、和載體。以上測序正確的質粒分別轉化酵母Y187菌株。分別挑取經(jīng)鑒定后的轉化酵母菌株以0.9%的NaCl溶液重懸并稀釋不同濃度后點在SD/-Trp/AbA/ X-α-Gal培養(yǎng)基上, 根據(jù)是否形成藍色菌斑判斷相應插入片段是否具有轉錄自激活活性, 以此推斷MeMYB60轉錄激活結構域所在位置。

1.9 酵母雙雜篩選MeMYB60互作蛋白

以無轉錄自激活活性的MeMYB60-194為誘餌蛋白, 利用本試驗已建好的木薯葉片cDNA文庫篩選可能與MeMYB60互作的蛋白。篩選方法按酵母雙雜交試劑盒說明書進行。

根據(jù)和基因的編碼序列設計了相應的引物, 通過PCR對木薯cv.60444成熟葉片的cDNA進行擴增, 將測序驗證后的和基因片段分別插入和載體, 構建、、、載體, 測序驗證; 將基因全長插入, 構建載體, 測序驗證。將已構建好的、以及空載體分別與成對共轉化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞; 將、空載體分別與成對共轉化酵母Y2HGold感受態(tài)細胞。在DDO (SD/-Trp-Leu)酵母培養(yǎng)基上篩選陽性單菌落, 分別以和載體上的通用引物進行菌落PCR以鑒定共轉化的陽性菌株。經(jīng)鑒定的陽性菌落以0.9%的NaCl溶液重懸并點在QDO/A/X (SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-a-Gal)培養(yǎng)基上培養(yǎng)至藍色菌斑出現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 MeMYB60基因克隆

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)木薯中與擬南芥AtMYB60 (AT1G08810)蛋白序列同源性較高的MYB蛋白有2個(XP_021622445.1和XP_021619967.1), 對XP_021619967.1 (MeMYB2)的功能進行了研究[8,12]。本文基于XP_021622445.1 (MeMYB60)編碼基因的序列設計了用于克隆基因編碼區(qū)全長的引物, 以木薯cv.60444成熟葉片的cDNA為模板進行PCR擴增, 獲得編碼區(qū)全長大小約1000 bp (圖1)。測序結果表明該PCR片段全長1035 bp, 包含了完整的開放閱讀框, 與木薯基因組數(shù)據(jù)庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)中編號為的基因序列完全一致。

2.2 MeMYB60蛋白進化樹及序列比對分析

將木薯MeMYB60蛋白與其他21種植物的MYB60蛋白進行進化樹分析發(fā)現(xiàn), 木薯MeMYB60蛋白與橡膠樹()、楊樹()和蓖麻()的親緣關系最近, 其氨基酸序列的一致性分別達到了76.1% (橡膠樹)、69.7% (楊樹)和64.3% (蓖麻)。而與玉米()和大豆()的親緣關系最遠, 其氨基酸序列的一致性分別為41.0% (玉米)、43.8% (大豆) (圖2)。

將木薯MeMYB60與MeMYB2以及擬南芥、橡膠樹、蓖麻MYB60蛋白的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn), MYB60在其蛋白的N端120個氨基酸殘基內(nèi)有很高的相似性, 這部分氨基酸殘基主要是MYB類轉錄因子的R2和R3保守結構域。在MeMYB60蛋白第177到第198氨基酸殘基有一段22個氨基酸殘基的片段在不同的植物中高度保守(圖3), 這段高度保守的序列可能與MYB60的功能密切相關。

圖1 木薯葉片RNA及MeMYB60基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖3 木薯MeMYB60與其他植物的同源蛋白氨基酸序列比對

黑色區(qū)塊: 氨基酸一致性為100%。Black blocks: the amino acid identity is 100%.

2.3 MeMYB60基因表達分析

利用RT-PCR對基因在木薯cv.60444植株不同組織中的表達情況進行分析發(fā)現(xiàn),基因主要在木薯葉片(leaf)和葉柄(petiol)中優(yōu)勢表達, 而在根部(root)的表達量極低(圖4-A)。利用qRT-PCR分析對不同環(huán)境脅迫處理的響應發(fā)現(xiàn), 在干旱、低溫和ABA處理下, 該基因在木薯成熟葉片中的表達量均顯著下調(圖4-B)。

2.4 MeMYB60蛋白亞細胞定位

通過瞬時轉化煙草的方法分析MeMYB60蛋白的亞細胞定位。將攜帶質粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片下表皮, 3 d后取注射部位周邊直徑1 cm范圍內(nèi)的葉片, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片下表皮細胞中綠色熒光蛋白的定位。以細胞核熒光染料Hoechst33342 (ThermoFisher公司, 目錄號: 62249)對表皮細胞的細胞核進行染色。結果如圖5所示, 綠色熒光信號與藍色熒光信號位置重疊, 表明MeMYB60:eGFP融合蛋白主要集中在細胞核中。

圖4 木薯MeMYB60表達的組織特異性分析(A)及其在葉片中對不同脅迫的響應分析(B)

內(nèi)參基因為。**表示不同處理樣品與對照樣品(Control)相比差異極顯著(< 0.01)。誤差線為每組處理的標準誤差(= 3)。

was used as a home keeping gene. ** indicates significant differences at< 0.01 in samples for different treatments compared to the sample of control. Error bar represents the standard error of each sample (= 3).

圖5 MeMYB60-eGFP融合蛋白的亞細胞定位

2.5 MeMYB60啟動子特異性分析

研究表明, 擬南芥的基因可以在保衛(wèi)細胞中特異表達[18]。為了進一步明確木薯基因的表達特性, 本文通過PCR從木薯cv.60444基因組DNA中擴增了起始密碼子ATG上游1500 bp的片段, 構建了植物表達載體。通過農(nóng)桿菌介導轉化野生型擬南芥(Col-0), 獲得轉基因植株后在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉基因擬南芥葉片下表皮中綠色熒光蛋白的定位。綠色熒光蛋白的定位結果顯示,啟動子可以驅動融合基因在擬南芥保衛(wèi)細胞中表達(圖6), 表明基因有可能是在木薯保衛(wèi)細胞中特異表達。

2.6 MeMYB60蛋白序列及轉錄激活結構域分析

蛋白序列分析結果表明木薯MeMYB60屬于R2R3-MYB亞家族成員, 具有2個保守的DNA結合結構域(圖7-A)。MeMYB60全長蛋白(MeMYB60-full)具有明顯的轉錄自激活能力, 在酵母Y187菌株中可以激活報告基因的表達, 從而在SD/-Trp/ A/X酵母培養(yǎng)上生長并形成藍色菌斑(圖7-B)。按圖7-A所示, 通過PCR獲得了一系列MeMYB60蛋白C末端刪除片段, 構建了酵母表達載體并轉化Y187菌株, 在SD/ -Trp/A/X培養(yǎng)基上對MeMYB60蛋白截短片段的轉錄激活功能進行分析。在SD/-Trp培養(yǎng)基上, MeMYB60蛋白全長及各截短蛋白片段相關載體轉化的酵母與空載體轉化的酵母生長能力一致(圖7-B), 說明MeMYB60蛋白不影響酵母的正常生長, 對酵母細胞沒有毒性。如圖7所示, MeMYB60-234蛋白片段可以激活報告基因的表達, 在SD/-Trp/A/X培養(yǎng)基上形成藍色菌斑; 而MeMYB60-194片段不能激活報告基因的表達, 無法在SD/-Trp/A/X培養(yǎng)基上形成藍色菌斑。表明, MeMYB60的轉錄激活結構域在第194至234氨基酸殘基范圍內(nèi)。

2.7 MeMYB60互作蛋白篩選

轉錄激活結構域分析試驗表明, MeMYB60-194蛋白片段對酵母細胞沒有毒性, 且該片段無轉錄激活功能。為了篩選MeMYB60的互作蛋白, 本文以MeMYB60-194蛋白片段為誘餌, 通過酵母雙雜交系統(tǒng)從木薯cv.60444成熟葉片cDNA文庫中篩選可能與MeMYB60互作的部分蛋白。酵母雙雜獲得的陽性克隆經(jīng)2次劃線純化后, 以酵母表達載體上的通用引物對不同的單克隆進行菌落PCR。將條帶單一且片段在500 bp以上的PCR產(chǎn)物回收并測序。從測序結果中篩選具有完整開放閱讀框的序列, 通過BLAST在木薯基因組(https:// phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)進行比對和注釋, 部分結果見表2。從結果中發(fā)現(xiàn), 可能與MeMYB60-194片段互作的蛋白包括2個不同的過氧化氫酶(Catalase), 基因登錄號分別為Manes.05G130500.1 (MeCAT1)和Manes.02G113300.1 (MeCAT2)。

圖6 MeMYB60:eGFP融合基因在MeMYB60啟動子驅動下的表達分析

圖7 MeMYB60蛋白序列及轉錄激活結構域分析

2.8 MeMYB60與過氧化氫酶互作驗證

利用酵母雙雜系統(tǒng), 通過點對點的方式對MeMYB60與過氧化氫酶(MeCAT1和MeCAT2)蛋白之間的互作關系進行驗證。由圖8可知, 轉化MeCAT1 + MeMYB60-194、MeCAT2 + MeMYB60- 194 的酵母可以在QDO/A/X平板上長出藍色菌斑; 通過交換載體以進一步確認MeMYB60完整蛋白是否可以與MeCAT1和MeCAT2互作, 發(fā)現(xiàn)轉化MeMYB60-full + MeCAT1、MeMYB60-full + MeCAT2的酵母可以在QDO/A/X平板上長出藍色菌斑, 而共轉化單個基因和空載體的酵母均未能在形成藍色菌斑。以上結果進一步說明MeCAT1和MeCAT2可能與MeMYB60存在蛋白互作關系。

表2 MeMYB60酵母cDNA文庫篩選結果

圖8 酵母雙雜驗證MeMYB60與木薯過氧化氫酶的蛋白互作關系

3 討論

已有的研究表明MYB類轉錄因子在植物響應非生物脅迫的過程中起重要作用。木薯基因組以及大量重測序數(shù)據(jù)的公布[26-29], 為進一步挖掘木薯抗逆功能基因奠定了重要的基礎。本實驗室在前期的研究中篩選到多個非生物脅迫相關的MYB類轉錄因子[8], 為進一步研究木薯MYB類轉錄因子的抗逆功能提供參考依據(jù)。本文著重對木薯中擬南芥的同源基因的表達特性和互作蛋白進行了分析, 為進一步研究該基因的功能和調控機制奠定基礎。

氣孔運動調控對于植物響應干旱等非生物脅迫有重要的意義, 研究表明, 擬南芥基因在葉片優(yōu)勢表達, 在花和根部的表達量極低[18-19]。另外, 海島棉的基因也是在葉片優(yōu)勢表達, 并且其在葉片中的表達對多種非生物脅迫均有明顯的響應[30]。RT-PCR結果表明, 木薯基因同樣在葉片(包括葉柄)的優(yōu)勢表達, 而在根部的表達量極低(圖4-A)。在干旱及ABA處理條件下, 擬南芥基因的表達量明顯下降[18-19], 本文qRT-PCR的結果顯示, 干旱、低溫和ABA等處理負調控基因在木薯成熟葉片中的表達(圖4-B)。以上試驗結果表明, 木薯與擬南芥在非生物脅迫條件下有相似的表達調控模式。結合木薯啟動子可以驅動報告基因在保衛(wèi)細胞中表達的試驗結果(圖6), 暗示著基因可能參與了非生物脅迫條件下木薯氣孔的開閉調節(jié)。我們前期的研究表明, 木薯中擬南芥的另一個同源基因負調控木薯葉片的失水率, 從而影響轉基因木薯的干旱耐受性[12]。本文中的是否確實參與木薯氣孔運動調節(jié)并影響木薯抗逆性, 還需要通過制備相應的轉基因木薯來進一步驗證其功能。

轉錄因子在植物非生物脅迫響應調控中的功能和機制研究持續(xù)受到關注。近期, 我們實驗室報道了木薯干旱脅迫相關的SPL (SQUAMOSA promoter binding protein-like)轉錄因子MeSPL9在轉錄水平上負調控茉莉酸、脯氨酸和花青素等干旱逆境響應相關的代謝物關鍵合成酶基因的表達, 以此影響木薯抗旱性[31]。亞細胞定位及轉錄自激活試驗結果(圖4和圖7)顯示,編碼蛋白主要定位于細胞核中, 具有明顯的轉錄自激活活性, 表明該基因編碼的蛋白可能是一個轉錄因子。多數(shù)MYB轉錄因子可以與序列為CAACTGG的DNA順式作用元件結合, 我們前期的研究發(fā)現(xiàn), 木薯MeMYB2可以與上述DNA順式作用元件結合, 而MeMYB60卻不能與該順式作用元件結合[8]。因此, 木薯MeMYB60所識別并結合的DNA順式作用元件還需要通過進一步的試驗來確定。

脅迫相關轉錄因子常與其互作蛋白協(xié)同調控木薯對非生物脅迫的響應。利用病毒介導的基因沉默系統(tǒng), 研究人員發(fā)現(xiàn)木薯MeCIPK23蛋白通過與轉錄因子互作, 調控脫落酸(ABA)合成并影響木薯的抗旱性[32]。另外, 我們還發(fā)現(xiàn)木薯MeGRXC3通過在細胞核中與TGA轉錄因子互作調控轉基因擬南芥對滲透脅迫的耐受性和體內(nèi)活性氧的累積[33]。此外, 木薯轉錄因子MeRAV5可與過氧化物酶MePOD和肉桂醇脫氫酶MeCAD15互作, 調控過氧化氫(H2O2)和木質素的累積, 從而影響木薯抗旱性[34]?？梢? 篩選互作蛋白是研究轉錄因子功能和分子調控機制的重要前提。本文通過酵母雙雜系統(tǒng), 從木薯cv.60444成熟葉片cDNA文庫中篩選到了部分可能與MeMYB60互作的蛋白, 并且初步驗證了MeMYB60與過氧化氫酶MeCAT1和MeCAT2之間的互作關系(圖8), 為進一步研究MeMYB60的功能奠定了基礎。

過氧化氫酶是細胞內(nèi)清除活性氧的主要酶類之一, 其活性與植物的抗逆性有密切關聯(lián)。協(xié)同過表達SOD和CAT的轉基因木薯, 其細胞內(nèi)清除活性氧的能力明顯提高, 從而導致轉基因木薯對干旱和低溫的耐受性明顯提高[35]。最近, 研究人員發(fā)現(xiàn)木薯熱激蛋白MeHSP90可以招募轉錄因子MeWRKY20和過氧化氫酶MeCAT1來影響細胞內(nèi)活性氧水平并調控木薯的抗旱性[36]?；钚匝踉诒Ｐl(wèi)細胞產(chǎn)生并累積對于氣孔的關閉是非常重要[37], 本文的試驗結果顯示, MeMYB60與過氧化氫酶之間存在蛋白互作關系, 這可能意味著MeMYB60參與了保衛(wèi)細胞中活性氧的平衡調節(jié)過程, 并以此影響氣孔開閉。

4 結論

本文克隆到了一個在木薯葉片優(yōu)勢表達的R2R3-MYB轉錄因子基因。干旱、低溫以及ABA處理抑制該基因在木薯成熟葉片中的表達, 且啟動子可以驅動報告基因在保衛(wèi)細胞中表達。MeMYB60蛋白主要定位于細胞核中, 其轉錄激活結構域在第194～234氨基酸殘基之間。MeMYB60可能通過與過氧化氫酶互作來調控保衛(wèi)細胞內(nèi)的活性氧信號。

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Expression pattern analysis and interaction protein screening of cassava MYB transcription factor

XU Zi-Yin1, YU Xiao-Ling2,3, ZOU Liang-Ping2,3, ZHAO Ping-Juan2,3, LI Wen-Bin2,3, GENG Meng-Ting1,*, and RUAN Meng-Bin2,3,*

1College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, Hainan, China;2Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, Hainan, China;3Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Haikou 571101, Hainan, China

Myeloblastosis (MYB) transcription factors widely involve in a variety of physiological and biochemical processes in plants, and play important regulatory roles in response to abiotic stress in plant. Based on the expression pattern of MYB members in cassava cultivars, an R2R3-MYB transcription factor, namely MeMYB60 was screened and cloned. Gene expression characteristics showed thatwas specifically expressed in leaves of cassava, and negatively regulated by drought stress and low temperature. Moreover, this gene was also responded to ABA treatment in leaves of cassava. Promoter activity analysis showed thatcould be expressed in guard cells, indicating that the expression of this transcription factor gene may be related to stomatal movement regulation in cassava. MeMYB60 protein was predominately located in the nucleus and had transcriptional activation activity. Its transcriptional activation domain was in the range of 194th–343rd amino acid residues at the C-terminal of the protein. The cDNA library of drought stressed cassava leaves was screened by using the 1st–194th amino acid residues at the N-terminal of MeMYB60 protein as bait. Subsequently, 18 proteins had been that may interact with MeMYB60. Yeast-two-hybrid analysis determined that MeCatlase1 and MeCataase2 are potential interactors of MeMYB60, respectively. These results lay a foundation for further functional study ofin cassava in response to abiotic stress and are helpful for the regulatory network investigation of.

cassava; the abiotic stress; MYB transcription factor; the relative expression pattern; the interaction protein screening

10.3724/SP.J.1006.2023.24089

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD1000501), 海南省重大科技計劃項目(ZDKJ2021012)和中央級公益科研院所基本科研業(yè)務費專項(1630052022036)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD1000501), the Major Science and Technology Plan of Hainan Province (ZDKJ2021012), and the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (1630052022036).

阮孟斌, E-mail: ruanmengbin@itbb.org.cn; 耿夢婷, E-mail: mengtinggeng8908@163.com

E-mail: 670307392@qq.com

2022-04-10;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1427.006.html

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