天麻不同提取部位抗缺血性腦卒中作用比較 Δ

許春萍，楊茜，孟慶婷，顏明麗，寧瓏，孫航，何芳雁 （云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500）

缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是我國腦血管疾病中發(fā)病率最高的病種，具有致殘率高、病死率高、復(fù)發(fā)率高等特點，其已成為我國成人致殘、致死的首要病因[1]。該病的病理生理變化過程涉及多個環(huán)節(jié)，腦缺血時神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及微血管組成的血管神經(jīng)單元均受損；IS的早期以炎癥、神經(jīng)元凋亡表現(xiàn)為主，后期以神經(jīng)再生、血管新生表現(xiàn)為主[2―4]。早先的研究由于忽略了腦缺血后神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞之間的腦組織結(jié)構(gòu)功能的整體性和聯(lián)系，導(dǎo)致目前溶栓藥和神經(jīng)保護劑靶點單一、療效不佳，因此，目前藥物治療的目標轉(zhuǎn)變?yōu)閷κ軗p的腦組織進行多方位、多途徑的全面保護[5―7]，強調(diào)干預(yù)腦缺血后病理過程的多個環(huán)節(jié)。

天麻（Gastrodia elata Bl.）為云南省道地藥材。本課題組前期在對天麻抗IS作用的藥效學(xué)及物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，天麻酚性成分對IS過程中炎癥發(fā)生、神經(jīng)凋亡、血管新生等病理環(huán)節(jié)均有干預(yù)作用[8―11]。已有研究表明，腦血栓的形成是造成腦缺血的重要原因，臨床彌漫性腦血栓是造成IS的主要原因之一[12]?；诖耍狙芯坎捎脧浡阅X血栓大鼠模型[13]，以腦組織中伊文思藍（Evans blue，EB）含量為評價指標，比較天麻不同提取部位的抗IS作用，以篩選出天麻抗IS的有效部位，為IS的中藥新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、NVC-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA株式會社）、1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Angilent Technologies公司）、KA-1000型臺式低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、QL-861型旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、Infinite M200 PRO型酶標儀（瑞士Tecan公司）、AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 主要藥品與試劑

天麻藥材購自云南省昭通市彝良縣原生態(tài)天麻種植專業(yè)合作社，經(jīng)昭通天麻研究所陳順芳鑒定為真品。阿司匹林（批號MKBT1587V，純度99%）和EB染料（批號MKBTQ3656V）均購自美國Sigma公司；阿托品注射液（批號130404，規(guī)格10 mg/支）購自上海禾豐制藥有限公司；天麻素（批號J1516031，純度98%）購自美國Alladdin公司；無水乙醇（批號20160310，分析純）和乙酸乙酯（批號20161020，分析純）均購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；花生四烯酸（arachidonic acid，AA；批號XKN3C-JG，規(guī)格50 mg/支）購自東京化成工業(yè)株式會社。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量250～300 g，6～8周齡，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有大鼠飼養(yǎng)在溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～65%，12 h晝夜交替的環(huán)境中，自由進食與飲水。動物實驗方案經(jīng)本單位實驗動物倫理委員會審批通過（編號為R-062019LH001）。

2 方法

2.1 天麻不同提取部位的制備

2.1.1 天麻醇提取物和醇提取殘渣 取天麻藥材粉碎物過2號篩，取100 g用3倍生藥量的70%乙醇溶液回流提取3次，提取時間分別為3、2、1 h，合并濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，得醇提取物（得率為11.57%）和醇提取殘渣（得率為87.92%）。

2.1.2 天麻乙酸乙酯提取物和乙酸乙酯提取殘渣 取天麻醇提取物適量，用3倍水進行溶解，以等體積的乙酸乙酯溶液連續(xù)萃取6次，合并濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙酸乙酯、濃縮，得乙酸乙酯提取物（得率為2.13%）和乙酸乙酯提取殘渣（得率為9.45%）。

2.2 給藥溶液的制備

依據(jù)預(yù)實驗，精密稱取天麻醇提取物、天麻醇提取殘渣、天麻乙酸乙酯提取物、天麻乙酸乙酯提取殘渣各適量，分別加入聚山梨酯-80適量，使完全溶解后用蒸餾水定容，制成所需質(zhì)量濃度后，于4 ℃密封保存，備用。

2.3 大鼠彌漫性腦血栓模型的建立

參照文獻方法，建立大鼠彌漫性腦血栓模型[13]。用異氟烷吸入麻醉大鼠，并肌內(nèi)注射治療劑量的阿托品，使右側(cè)頸部皮下筋膜暴露，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈，并結(jié)扎頸外動脈分支和頸總動脈近心端，在其遠心端用動脈夾夾緊，顯微剪在頸總動脈游離端剪一個小口，插入導(dǎo)管，去除動脈夾。將0.5 mg/kg AA經(jīng)導(dǎo)管注入頸總動脈，后結(jié)扎遠心端動脈，進行縫合。實驗過程中使大鼠仰臥于加熱墊上，保持肛溫恒定在37 ℃[12，14]。假手術(shù)組鈍性分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸外動脈后即可進行縫合，不注入AA。

2.4 分組與給藥

根據(jù)前期天麻藥效學(xué)實驗結(jié)果，在保證天麻藥材量一致的情況下按提取率折算大鼠天麻生粉和各提取部位等的給藥劑量：天麻生粉為1.740 g/kg，天麻醇提取物為0.843 g/kg，天麻醇提取殘渣為1.610 g/kg，天麻乙酸乙酯提取物為0.155 g/kg，天麻乙酸乙酯提取殘渣為0.689 g/kg，天麻素為0.026 g/kg[15]。將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、阿司匹林組（陽性對照藥，0.100 g/kg[11]）、天麻生粉組、天麻醇提取物組、天麻醇提取殘渣組、天麻乙酸乙酯提取物組、天麻乙酸乙酯提取殘渣組、天麻素組，每組8只。各組大鼠均按每100 g體質(zhì)量灌胃相應(yīng)藥液1 mL，每日1次，連續(xù)7 d，末次給藥1 h后按“2.3”項下方法建立大鼠彌漫性腦血栓模型。

2.5 缺血側(cè)腦組織EB滲出及EB含量測定

2.5.1 EB滲出情況觀察 大鼠AA注入5 min后立即注入0.2%EB（每100 g體質(zhì)量注入0.5 mL），5 min后立即斷頭處死，取大腦，稱取腦濕重后，沿腦橋上界面切斷，去除嗅球。由前向后做連續(xù)冠狀切片，共5片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點，第2刀在視交叉處，第3刀在漏斗柄處，第4刀在漏斗柄與后葉尾極之間[13]。觀察各組大鼠腦組織切片中EB染色情況并拍照。

2.5.2 EB含量測定 腦組織切片拍照后，放入勻漿器中，加入5 mL 0.5%硫酸鈉及丙酮混合液（3∶7，V/V）制成勻漿液，密封靜置60 min以上，3 000 r/min離心10 min，取上清液在620 nm波長處測定吸光度（A）。以缺血側(cè)的A值與腦濕重之比表示EB的含量，以此反映腦血栓的嚴重程度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠腦組織EB滲出情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織可觀察到有明顯的EB滲出情況；與模型組比較，阿司匹林組、天麻醇提取物組、天麻乙酸乙酯提取物組大鼠缺血側(cè)腦組織的EB滲出情況明顯減輕，天麻生粉組大鼠缺血側(cè)腦組織EB滲出情況稍有減輕，天麻醇提取殘渣組、天麻乙酸乙酯提取殘渣組、天麻素組大鼠缺血側(cè)腦組織的EB滲出情況無明顯變化。腦組織形態(tài)圖見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織EB滲出情況的切片形態(tài)圖

3.2 大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿司匹林組、天麻醇提取物、天麻乙酸乙酯提取物組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量均顯著降低（P＜0.05），天麻生粉組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），天麻醇提取殘渣組、天麻乙酸乙酯提取殘渣組、天麻素組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量均幾乎無變化。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量比較（±s，n＝8）

表1 各組大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量比較（±s，n＝8）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組阿司匹林組天麻生粉組天麻醇提取物組天麻醇提取殘渣組天麻乙酸乙酯提取物組天麻乙酸乙酯提取殘渣組天麻素組EB含量0.16±0.03 0.25±0.10a 0.16±0.12b 0.22±0.06 0.19±0.04b 0.25±0.07 0.18±0.05b 0.25±0.05 0.24±0.12給藥劑量/（g/kg）0.100 1.740 0.843 1.610 0.155 0.689 0.026

4 討論

由于天麻中含有較多的淀粉，水煎煮液黏稠不利于有效成分的擴散、溶出，且大多有效成分屬于脂溶性酚性成分[16―17]。有研究顯示，采用70%乙醇進行提取的天麻總提取物得率最高，并且天麻素提取更完全[18]。故本研究采用溶解性強的乙醇作為溶劑對天麻進行提取。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，天麻乙酸乙酯提取物中含有酚性成分，為了驗證天麻乙酸乙酯提取物的抗IS作用，本研究還采用乙酸乙酯對天麻進行提取。

腦血栓的形成是造成腦缺血的重要原因，AA可誘導(dǎo)大鼠彌漫性腦血栓模型，此模型在損傷后幾分鐘即可發(fā)生血腦屏障功能的改變，從而導(dǎo)致腦缺血發(fā)生[12]。EB是一種偶氮基熒光染料，入血后幾乎全部與血漿白蛋白結(jié)合，正常情況下不能透過血腦屏障，只有當血腦屏障被破壞，通透性升高時，才可透過血腦屏障。隨腦損傷程度的加大導(dǎo)致血腦屏障通透性不斷升高，則EB的透過量越多，腦組織的染藍程度越明顯，因此檢測腦組織中EB的含量可以有效判斷腦損傷的程度[19]。本研究選擇頸內(nèi)注射AA，能誘發(fā)大鼠同側(cè)腦半球彌漫性腦血栓的形成，對于對側(cè)腦半球影響較小，同時在建模過程中，對頸外動脈進行結(jié)扎，使AA與EB全都流入顱內(nèi)，保證了模型的可靠性[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，彌漫性腦血栓模型大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量顯著高于假手術(shù)組，經(jīng)天麻醇提取物或天麻乙酸乙酯提取物干預(yù)后，模型大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量均顯著降低；經(jīng)天麻生粉干預(yù)后，模型大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量有降低趨勢；經(jīng)天麻素或天麻醇提取殘渣或天麻乙酸乙酯提取殘渣干預(yù)后，模型大鼠缺血側(cè)腦組織中EB含量均幾乎無變化。這表明天麻醇提取物和天麻乙酸乙酯提取物均具有抗IS作用，且作用強于天麻生粉，而天麻素、天麻醇提取殘渣、天麻乙酸乙酯提取殘渣均沒有抗IS作用。