長鏈非編碼RNA GAS5 在缺血性腦卒中及相關疾病中的研究進展

楊梅柳 虞武 解燕昭 趙景茹 董立朋 陳彥霞

1 衡水學院生命科學學院 河北省衡水市 053000

2 衡水學院校醫(yī)院 河北省衡水市 053000

3 河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 河北省石家莊市 050000

4 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 河北省石家莊市 050000

缺血性腦卒中是全世界致殘、致死的主要原因之一[1]，腦組織血流中斷后缺血缺氧導致神經(jīng)功能受損，腦梗死后遺留的偏癱、失語、認知障礙等癥狀給家庭和社會帶來沉重的負擔，雖然目前預防和治療缺血性腦卒中的方法取得了重大進展，但效果仍然欠佳，因此對腦梗死發(fā)病機制的深入研究迫在眉睫。缺血性腦卒中病理過程復雜，主要包括動脈粥樣硬化作用下內(nèi)皮功能障礙和微血管壁的改變[2]，涉及炎癥、氧化應激、血腦屏障功能障礙、腦水腫及神經(jīng)元凋亡等一系列病理分子過程[3]，長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA,lncRNA）參與了多個過程[4]，lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，是近年來研究比較深入的RNA 分子之一，在細胞的凋亡、細胞周期、增殖、細胞分化等生物過程中發(fā)揮調控作用[5]，越來越多的研究證實lncRNA 在缺血性腦卒中發(fā)病機制中也發(fā)揮重要功能。盡管lncRNA 在缺血性腦卒中的研究有限，但預測lncRNA 在缺血性腦卒中的診斷及治療方面有很大的潛力，lncRNA 可能成為診治缺血性腦損傷的關鍵分子靶點。

生長阻滯特異性轉錄因子5（growth arrest-special transcript 5,GAS5）位于人類基因組1 號染色體上，在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物過程中起重要調控作用，最初是通過篩選潛在的腫瘤抑制基因而命名，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[6-7]，近年來發(fā)現(xiàn)其參與缺血性腦卒中的病理過程，并可通過不同的信號通路參與高血壓與動脈粥樣硬化的形成。

lncRNA GAS5 與缺血性腦卒中

lncRNA GAS5 通過募集DNA 甲基轉移酶3B（DNA methyltransferase 3B,DNMT3B）顯著誘導絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 4,MAP4K4）甲基化并下調MAP4K4 表達，增加腦梗死體積，抑制lncRNA GAS5 表達可減輕小鼠中腦動脈栓塞模型的腦梗死、神經(jīng)損傷、細胞凋亡和炎癥損傷。在細胞實驗中，lncRNA GAS5 促進氧糖剝奪條件下神經(jīng)元的凋亡，上調促凋亡基因Bax，下調抗凋亡基因Bcl-2[8-11]表達，siRNA 沉默lncRNA GAS5 表達可抑制caspase-3的激活，降低Bax 表達，增加Bcl-2 表達水平顯著抑制神經(jīng)元凋亡，提高氧糖剝奪下細胞活力，改善缺血性卒中的神經(jīng)功能[12]。lncRNA 與miRNA 密切相關，lncRNA 可通過不同的miRNA 調控不同傳導通路發(fā)揮作用。研究顯示中腦動脈栓塞術后和氧糖剝奪處理的小鼠初級腦神經(jīng)元中l(wèi)ncRNA GAS5 水平與miR-137 表達呈負相關，lncRNA GAS5 作為miR-137 的競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過抑制Notch1 信號通路，調節(jié)內(nèi)源性靶標Notch1 降低神經(jīng)元存活率[9]，lncRNA GAS5 可通過競爭性海綿miR-9，促進FOXO3 的表達，下調lncRNA GAS5 可調控miR-9/FOXO3，從而緩解神經(jīng)元細胞損傷[10]，lncRNA GAS5 也可通過海綿miR-221 調控PUMA和下游JNK/H2AX 信號通路，加速細胞凋亡[13]。lncRNA GAS5 還可通過競爭性結合miR-365a-3p 調控DCDC2 的表達，從而形成GAS5/miR-365a-3p/DCDC2調控網(wǎng)絡[11]。由此推測lncRNA GAS5 通過不同的通路在缺血性腦卒中發(fā)病過程中起調控作用。

缺血再灌注損傷是缺血性卒中常見的并發(fā)癥之一，缺血再灌注損傷后大鼠lncRNA GAS5 表達升高，siRNA 敲低lncRNA GAS5 可以逆轉缺血再灌注誘導的細胞凋亡和炎癥反應。生物信息學分析表明，lncRNA GAS5 競爭性地吸附了miR-26b-5p，過表達的miR-26b-5p 可通過抑制靶點Smad1 表達改善細胞凋亡及炎癥反應[14]。應用氧糖剝奪再氧化誘導大鼠原代星形膠質細胞觀察發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA GAS5還可通過miR-1192/STAT5A 軸抑制AQP4 表達緩解腦缺血再灌注損傷[15]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5 和STAT5A 在腦卒中患者中表達較強，抑制模型大鼠lncRNA GAS5 或STAT5A 可改善神經(jīng)功能，減少梗死和神經(jīng)元凋亡，降低腦含水量和星形膠質細胞活化，機制可能為lncRNA GAS5 可靶向調控miR-1192，沉默lncRNA GAS5 后miR-1192 表達被抑制，星形膠質細胞的增殖受到干擾，凋亡和炎癥增強，沉默STAT5A 后可逆轉這一現(xiàn)象，STAT5A 可能與AQP4啟動子結合并調控其表達而發(fā)揮作用，與單獨沉默lncRNA GAS5 相比，沉默lncRNA GAS5 和過表達AQP4 導致上述現(xiàn)象更加明顯。

臨床研究顯示，急性缺血性腦卒中患者較健康者的lncRNA GAS5 表達增高，并且與患者的NIHSS評分和促炎細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-17A 表達呈正相關，與抗炎細胞因子IL-10 呈負相關，機制可能是lncRNA GAS5 通過調節(jié)患者的Smad1 來加速炎癥反應，通過調節(jié)巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞凋亡促進血管內(nèi)膜增厚，加重動脈粥樣硬化病變，從而增加急性缺血性腦卒中的嚴重程度，還可能通過Notch1 信號通路調控神經(jīng)元凋亡，加速血栓形成，加重腦缺血損傷，進而引起認知功能損傷，加重病情[16]，因此推測lncRNA GAS5 是急性缺血性腦卒中的一個潛在預測指標。

進一步探討中國漢族人群中兩種功能lncRNA GAS5 變異（rs145204276 和rs55829688） 與腦卒中易感性之間的相關性，Deng 等[17]采用改進的多溫連接酶檢測反應（iMLDR-TM）基因分型技術，對1 086 例缺血性腦卒中患者和1 045 例年齡匹配的健康對照組的lncRNA GAS5 變異進行基因分型，發(fā)現(xiàn)腦卒中患者與健康者相比，rs145204276 等位基因和基因型頻率有很大變化，del-T 單倍型在腦卒中病例中更為普遍。根據(jù)環(huán)境因素進行分層發(fā)現(xiàn)rs145204276 del 等位基因在男性、吸煙者、高血壓患者和≥65歲的人群中與缺血性腦卒中高風險相關，對亞型進行分享，發(fā)現(xiàn)攜帶rs145204276 del 等位基因的個體患動脈粥樣硬化性腦卒中的幾率更大。此外，在缺血性腦卒中患者中，rs145204276 del 等位基因與lncRNA GAS5 表達升高之間存在顯著相關性。Zheng 等[18]對509 例缺血性腦卒中患者和668 名健康對照者進行基因分型，頻率與年齡、性別、居住地區(qū)和種族相匹配，logistic 回歸分析的結果確定rs145204276 del/del 基因型為缺血性腦卒中的危險因素，攜帶rs145204276 del/del 基因型的患者lncRNA GAS5 水平顯著升高，轉染rs145204276 del 等位基因的細胞熒光素酶活性顯著增加，表明rs145204276 del等位基因通過提高轉錄活性，進而增強lncRNA GAS5表達，并且與缺血性腦卒中易感性增加存在顯著關聯(lián)。

中藥制劑對缺血性腦卒中的治療有較大收益，清大顆?？赏ㄟ^降低腦缺血再灌注損傷大鼠和氧糖剝奪再氧化損傷HT22 細胞中的lncRNA GAS5、Bax 和cleaved caspase3 的表達，增加了miR-137 和Bcl-2 的表達，顯著改善大鼠的腦組織損傷，減少神經(jīng)元損失，促進損傷HT22 細胞生長，抑制細胞凋亡[19]，總之清大顆?？赡苁峭ㄟ^lncRNA GAS5/miR-137 信號通路在缺血性腦卒中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。另一項研究顯示姜黃素也可通過抑制大鼠神經(jīng)元細胞和腦組織中l(wèi)ncRNA GAS5 表達保護腦細胞，過表達lncRNA GAS5 可降低細胞活性，促進凋亡，而姜黃素和低表達的lncRNA GAS5 可以增強細胞活性，降低細胞凋亡，機制可能是姜黃素通過抑制lncRNA GAS5 從而抑制炎癥相關因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達，最終減輕腦缺血細胞損傷[20]。姜黃素還有抵抗卒中后抑郁的作用，在卒中后抑郁大鼠模型應用姜黃素后，通過開放曠場試驗和懸尾試驗以及檢測血清中皮質酮、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）水平、海馬中神經(jīng)遞質5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）水平顯示，模型大鼠抑郁癥明顯減輕，可能的機制為姜黃素通過增強的lncRNA GAS5 表達激活BDNF/Trkβ 信號通路，促進突觸相關蛋白的表達[21]。上述研究發(fā)現(xiàn)可能由于模型及檢測指標不同，lncRNA GAS5 會有不同的作用，但是總體來說，其在缺血性腦卒中發(fā)病及發(fā)展中起到重要作用。

lncRNA GAS5 與高血壓

高血壓是缺血性腦卒中的重要危險因素，發(fā)病機制是基于內(nèi)皮細胞失調、血管平滑肌細胞功能障礙、血管生成受損等病理改變[22-23]。研究表明lncRNA GAS5 是參與高血壓和血管重塑發(fā)病機制最多的lncRNA 之一[24-25]，lncRNA GAS5 在正常大鼠和自發(fā)高血壓大鼠視網(wǎng)膜、尾動脈、腎動脈、胸主動脈和頸動脈中均有表達，與非高血壓大鼠相比，自發(fā)高血壓大鼠各組織及血漿中l(wèi)ncRNA GAS5 表達明顯下調，lncRNA GAS5 在高血壓患者血漿中的水平也低于正常人。高血壓可導致大鼠視網(wǎng)膜中出現(xiàn)新生血管及毛細血管滲漏，敲低lncRNA GAS5將導致新生血管數(shù)量進一步增加、加劇毛細血管變性、毛細血管滲漏，加重堿性燒傷誘導的血管生成，促進高血壓期間小血管的重構。使用siRNA 下調lncRNA GAS5 表達，可增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的增殖能力，加速細胞遷移及管狀形成，減少H2O2誘導的細胞凋亡，增強細胞活力及抗氧化應激能力[25]。

一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，高血壓患者lncRNAGAS5 表達水平降低，當lncRNAGAS5 表達變化0.38 倍時，可預測無癥狀器官損害，敏感性86.6%，特異性88.7%，lncRNAGAS5 表達降低可導致無癥狀器官損害的風險增加，可作為高血壓患者無癥狀器官損害的獨立預測因子[26]。

Ali 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，高血壓合并腦卒中組患者和非高血壓腦卒中組患者血清中l(wèi)ncRNA GAS5 水平均顯著降低，其中伴有高血壓者的血清lncRNA GAS5 水平降低更加明顯，且lncRNA GAS5 水平與患者NIHSS 評分呈顯著負相關，lncRNA GAS5 的ROC 曲線分析能夠區(qū)分腦卒中伴高血壓患者與腦卒中非高血壓患者，因此認為lncRNA GAS5 可作為腦卒中后病情嚴重程度和預后的生物標志物，為腦卒中治療提供新的靶點。

lncRNA GAS5 與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是導致腦卒中的重要原因之一，動脈內(nèi)粥樣斑塊因炎癥、脂代謝異常等導致斑塊破損，血栓形成及脫落，堵塞動脈引起缺血性腦卒中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）參與了動脈粥樣硬化的形成，其誘導的血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化的早期發(fā)病機制之一[28]，從患者和動物模型中收集的動脈粥樣硬化斑塊中，lncRNA GAS5 表達顯著增加，下調lncRNA GAS5 的表達減少了ox-LDL 處理的THP-1 細胞凋亡，lncRNA GAS5 過表達可顯著提高ox-LDL 刺激后THP-1 細胞凋亡，在ox-LDL刺激后THP-1 細胞衍生的外泌體中也存在lncRNA GAS5，lncRNA GAS5 可通過外泌體調控巨噬細胞和內(nèi)皮細胞的凋亡，推測lncRNA GAS5 可能是參與動脈粥樣硬化病理生理過程的靶分子[29]。經(jīng)ox-LDL誘導的HUVEC 細胞損傷中l(wèi)ncRNA GAS5 水平明顯增高，miR-29a-3p 下調，pcDNA-GAS5 致lncRNA GAS5 過表達的HUVEC 細胞活力明顯降低，凋亡增加，高劑量楊梅素干預可抑制pcDNA-GAS5 導致的lncRNA GAS5 過表達，通過抗炎、抗氧化起到保護細胞的功能[30]，lncRNA GAS5 敲低可促進膽固醇的逆向運輸并抑制細胞內(nèi)脂質積累，最終通過減少zeste 同源物2 的增強子（EZH2）介導的組蛋白甲基化對ATP 結合盒轉運體A1（ABCA1）的轉錄抑制來阻止動脈粥樣硬化的進展[31]，這些都提示抑制lncRNA GAS5 可能是治療動脈粥樣硬化的有效途徑。

綜上所述，lncRNA GAS5 參與缺血性腦卒中的病理過程，雖然研究還比較局限，但也提示lncRNA GAS5 有可能成為缺血性腦卒中新的治療靶點[32]。