頭花蓼不同提取物的抗氧化、抗炎及抗菌活性*

陳濤， 何磊， 林燕*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

苗藥頭花蓼是貴州民間廣泛使用的一種苗族中草藥，臨床主要用于治療尿路感染、尿路結(jié)石、腎盂腎炎、膀胱炎、血尿等疾病[1]。相關(guān)研究表明，苗藥頭花蓼的水提取物具有抗菌、抗炎及抗氧化等多種藥理活性[2-4]，然而苗藥頭花蓼其它提取物的生物活性未見系統(tǒng)報道。苗藥頭花蓼的化學(xué)成分中有30種單體黃酮苷元及其苷類成分[5-7]，關(guān)于這些成分的藥理活性研究主要集中在少數(shù)幾個含量較高的化合物[8-11]，而對整體活性部位的研究較少。因此，本研究擬對貴州省不同產(chǎn)地采集的11批次頭花蓼藥材，分別制備頭花蓼水提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物，研究這些提取物的抗氧化、抗炎與抗菌生物活性成分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥材、細菌及細胞來源 11批次苗藥頭花蓼藥材于2019年采集貴州省不同地區(qū)(表1)，通過性狀鑒別與DNA條形碼技術(shù)鑒定本研究藥材為蓼科蓼屬植物頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham. ex D. Don)的干燥全草；大腸桿菌(Escherichiacoli，EC)ATCC 8739、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)ATCC 9027及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)ATCC 6538由南開大學(xué)提供，培養(yǎng)于Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中；小鼠單核-巨噬細胞RAW264.7購自美國菌種保藏中心，于Dulbecco改良后的Eagle培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)中進行培養(yǎng)。

表1 11批次苗藥頭花蓼產(chǎn)地信息Tab.1 Location information of 11 batch seedlings of P. capitatum

1.1.2主要藥品與試劑 胰蛋白酶 (tyrosinase，美國Gibco)，dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)基和胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS；美國Hyclone)，NO檢測試劑盒(江蘇碧云天)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；北京化工)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；貴陽超研生物)，青霉素鈉(上海源葉生物科技公司)，姜黃素(南京澤朗)，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及1,1二苯基-2-苦?；?2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)試劑等(美國Sigma-Aldrich)。

1.1.3主要儀器 ZNHW型電熱套(鄭州標普)，E104 /02 型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器)，XW-80A漩渦混合儀(上海馳唐)，KQ3200型超聲波清洗器(昆山超聲)，UPW-UP-10超純水處理器(成都天莘寧)，LUX3020-426多功能酶標儀(賽默飛世爾)，GL-20B冷凍離心機(上海安亭)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(日本三洋)，超凈工作臺(蘇州蘇凈安泰)。

1.2 研究方法

1.2.1提取物的制備 將干燥的頭花蓼藥材各500 g粉碎，分別用95%乙醇、蒸餾水回流提取2 h，濃縮合并濾液，經(jīng)冷凍干燥后分別得到頭花蓼乙醇提取物和水提取物粉末，放入干燥器中備用；頭花蓼藥材粉末1 000 g，95%乙醇回流提取3次、2 h/次，濃縮合并濾液至無醇味，加蒸餾水超聲分散濾液，依次分別用乙酸乙酯和正丁醇分段萃取，分別濃縮合并濾液，冷凍干燥后即得到頭花蓼乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物粉末；綜上，頭花蓼水提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物已準備好，最后經(jīng)DMSO分別溶解上述4種固體粉末，制備得到100 g/L的待用樣品溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2DPPH抗氧化活性測定 參考文獻[12-13]方法測定4種頭花蓼提取物對DPPH的自由基清除能力來反映抗氧化活性。0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL加入各待用樣品溶液中，再將上述溶液加預(yù)先混有乙醇的96孔板中，混合溶液共200 μL，BHT為陽性對照，乙醇溶液為陰性對照；避光反應(yīng)，溫度為30 ℃；反應(yīng)30 min，于492 nm波長下測定各混合溶液、陽性組以及空白對照組的吸光度值，并計算DPPH的清除活性。

1.2.3抗菌活性測定 參考文獻[14-15]方法采用微量肉湯倍比稀釋法(broth microdilutionmethod)測定11批次黔產(chǎn)苗藥頭花蓼4種提取物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。在LB培養(yǎng)基中分別接種EC ATCC 8739、PA ATCC 9027及SA ATCC 6538，并放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，稀釋菌液至光密度(optical density 600，OD600)為0.02，得到3種菌體混懸液；頭花蓼4種提取物溶液按2倍量稀釋法依次加入96孔細胞板中，并加菌體混懸液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)8 h，得待測溶液；于600 nm波長條件下，使用多功能酶標儀檢測待測溶液的吸光度，其中PBS緩沖液處理后的細菌菌液作為空白對照組，青霉素鈉處理后的細菌菌液作為陽性藥組。

1.2.4NO抗炎活性測定 參考本課題組前期研究結(jié)果[16-17]，將RAW264.7細胞以1.2×105個/孔的方式加入96孔板中，CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；各孔分別加1 mg/L LPS溶液和10 mg/L頭花蓼各提取物，孵育24 h，每孔吸取培養(yǎng)基50 μL至新的96孔板中，按照NO檢測試劑盒的操作說明分別加格里斯試劑Ⅰ和Ⅱ，于540 nm下采用多功能酶標儀檢測NO濃度；20 μmol/L姜黃素作為陽性對照組，所有實驗均設(shè)置3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 DPPH抗氧化活性

11批次苗藥頭花蓼4種提取物DPPH抗氧化活性篩選結(jié)果顯示, 乙醇提取物與乙酸乙酯提取物比水提取物與正丁醇提取物的抗氧化活性強，并且乙酸乙酯提取物的抗氧化活性最強；苗藥頭花蓼乙酸乙酯提取物濃度為10 mg/L時，對DPPH的清除率為90%～99%；陽性藥BHT為10 μmol/L時，清除率為67.2%。見圖1。

圖1 各批次頭花蓼4種提取物DPPH抗氧化活性篩選Fig.1 DPPH antioxidant activity screening from each batch of 4 extracts of P. capitatum

2.2 抗菌活性

測定4種提取物對革蘭陽性菌(SA)以及革蘭陰性菌(PA、EC)的抗菌活性，結(jié)果顯示，11批次頭花蓼的乙醇提物與乙酸乙酯提取物的抗菌活性比水提取物與正丁醇部位的抗菌活性強(表2)，這個趨勢與頭花蓼提取物DPPH抗氧化結(jié)果相一致；乙醇提取物與乙酸乙酯提取物的抗菌能力相當，乙醇提取物對SA、PA及EC的MIC分別為0.46～2.10 g/L、0.25～2.42 g/L及1.80～3.75 g/L，乙酸乙酯提取物對SA、PA及EC的MIC分別為0.18～0.65 g/L、0.13～0.82 g/L及0.15～0.78 g/L；陽性藥青霉素鈉對這3種細菌的MIC為1.12 μg/L。

表2 各批次黔產(chǎn)頭花蓼4種提取物抗菌活性篩選Tab.2 Screening of antibacterial activity of each batch of 4 extracts of P. capitatum

2.3 NO抗炎抑制活性

測定11批次黔產(chǎn)苗藥頭花蓼4種提取物(頭花蓼水提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物)的抗炎活性，篩選得到頭花蓼最佳抗炎活性提取物。NO抗炎抑制活性結(jié)果顯示，頭花蓼水提取物與正丁醇提取物抗炎活性非常弱，乙酸乙酯提取物抗炎活性最強、抑制率最高達70%，陽性藥姜黃素20 μmol/L時抑制率為66%。見圖2。

圖2 各批次苗藥頭花蓼4種提取物NO抗炎活性的篩選Fig.2 NO anti-inflammatory inhibition activity from each batch of 4 extracts of P. capitatum

3 討論

氧化應(yīng)激是機體內(nèi)無法避免的一種狀態(tài)，在正常情況下都會存在。炎癥及心血管疾病等病癥的產(chǎn)生，都和機體內(nèi)過度的氧化應(yīng)激有一定的關(guān)系[18-20]。氧化應(yīng)激是指細胞中氧化與抗氧化作用平衡失調(diào)，更偏向于氧化的病理過程，該過程會導(dǎo)致中性粒細胞炎癥浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物[21]。如果能夠迅速改善機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，就能有效地預(yù)防這些疾病的發(fā)生。因此，頭花蓼的清熱利濕功效、抗炎等現(xiàn)代藥理活性都歸因于其抗氧化活性。本研究中11批次苗藥頭花蓼的乙醇提取物及乙酸乙酯提取物的DPPH抗氧化能力非常強，初步說明頭花蓼提取物具有較好的體外抗氧化活性，并且其抗氧化活性部位為乙醇提取物及乙酸乙酯提取物。

有研究顯示，70%頭花蓼乙醇提取物具有較強的抗菌活性[22]，但頭花蓼具有抗菌的活性部位的系統(tǒng)研究未見報道。從本研究結(jié)果可知，11批次黔產(chǎn)頭花蓼的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物對革蘭陽性菌(SA)及革蘭陰性菌(PA、EC)均具有較強的抗菌活性。由此可推測，臨床中開發(fā)以頭花蓼為原料的治療泌尿系相關(guān)疾病的中藥制劑，可選用乙醇提取物和乙酸乙酯提取物作為活性部位。

炎癥是具有血管系統(tǒng)的活體組織對各種損傷因子的刺激所產(chǎn)生的紅、腫、熱、痛等癥狀的防御反應(yīng)，是機體對內(nèi)外環(huán)境中有害刺激所產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理和病理反應(yīng)現(xiàn)象[22]。它是普遍且重要的基本病理過程，是引起人類多種重大疾病的共同通路，參與人體感染(比如肺炎、肝炎、腎炎等)、腫瘤、心腦血管病等許多重大疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[23]。頭花蓼作為一種被苗族群眾廣泛使用的中藥，常用于治療炎癥性疾病[24]。頭花蓼的一些臨床功效比如清熱利濕、活血止痛等，以及一些治療痢疾、腎盂腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石、濕疹等疾病的作用，可能都與其抗炎活性有直接聯(lián)系[25]。本研究表明，頭花蓼乙酸乙酯提取物較頭花蓼其它3個提取物具有最強的NO抗炎抑制活性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，11批次黔產(chǎn)苗藥頭花蓼乙醇提物與乙酸乙酯提取物均具有較強的抗氧化、抗炎及抗菌活性，其中乙酸乙酯提取物可進一步深度開發(fā)作為臨床用藥的有效活性部位。