微小殘留病灶檢測在實體瘤中的應(yīng)用及進展

楊鑫鑫,孟宏學(xué)

腫瘤經(jīng)過不同方式的治療后,仍有可能存在部分殘留的腫瘤細胞。我們將殘留在患者體內(nèi),與原發(fā)腫瘤表型相似的少量惡性腫瘤細胞稱之為微小殘留病灶/分子殘留病灶(minimal residual disease/molecular residual disease, MRD)。MRD是腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一,MRD檢測的優(yōu)勢是可以較影像學(xué)等傳統(tǒng)檢查方式更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的存在。目前臨床上應(yīng)用較多的MRD檢測方法分別為基于循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTC)和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)。此外,MRD檢測也用來對實體瘤患者進行治療指導(dǎo)、預(yù)后評估和動態(tài)監(jiān)測。本文就MRD檢測在實體瘤臨床診治發(fā)展過程中的應(yīng)用及進展進行梳理及總結(jié)。

1 液體活檢技術(shù)

液體活檢的概念可追溯到1869年CTC的首次提出[1],實際上液體活檢并不是實體活檢,該術(shù)語包括了在體液中可檢測到的任何腫瘤衍生成分。所以后續(xù)液體活檢的概念迅速擴展到了ctDNA和其他腫瘤衍生產(chǎn)物,如外周血游離RNA(circulating cell-free RNA, cfRNA)、細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)、腫瘤誘導(dǎo)血小板(tumor-educated platelets, TEPs)等[2-5]。液體活檢在臨床上的應(yīng)用包括早期癌癥檢測、癌癥分期確定、療效檢測、靶向耐藥機制檢測等,其中基于CTC和ctDNA的檢測應(yīng)用最廣泛[6],當(dāng)前MRD檢測應(yīng)用的主要技術(shù)是液體活檢技術(shù)。雖然目前組織活檢是分子病理檢測的金標(biāo)準,但與液體活檢相比,它有以下局限性[7],(1)有創(chuàng)性:與血液采集相比,活檢術(shù)為更有侵入性的有創(chuàng)性檢查,同時部分患者由于疾病情況及腫瘤生長部位特殊,并不容易獲取腫瘤組織。(2)限制性:當(dāng)原發(fā)腫瘤組織過小或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移細胞還未定植前,傳統(tǒng)影像學(xué)無法檢測,從而影響患者的確診和后續(xù)治療。(3)異質(zhì)性:同塊腫瘤組織不同位置可能會存在空間異質(zhì)性,例如不同部位所檢測出的靶點變異并不相同。(4)時效性:組織無法在患者疾病進展過程中隨時獲取,而液體活檢可起到動態(tài)監(jiān)測的作用。

2 MRD檢測技術(shù)

2.1 MRD的定義及發(fā)展MRD是惡性腫瘤難以根治的主要障礙。盡管腫瘤對許多治療方式的敏感性均較高,但仍有一些殘留的腫瘤細胞持續(xù)存在于體內(nèi),而目前的影像學(xué)檢查無法檢測和追蹤到,最終導(dǎo)致了腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[8]。MRD一詞起初常用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤,通過流式細胞術(shù)(檢測白血病特異性抗原)或其他分子定量技術(shù),如定量PCR [檢測T細胞受體(TCR)或免疫球蛋白(Ig)基因重排]來確定患者治療后血液中腫瘤細胞的存活狀況。除了上文所述的檢測CTC外,檢測患者血漿中的ctDNA也是一種有效的臨床檢測方法。因此,基于MRD檢測的治療已常規(guī)應(yīng)用于急性淋巴母細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病和慢性粒細胞白血病患者中[9-10]。

目前實體瘤MRD檢測技術(shù)及臨床研究取得飛速進展,顯著降低了多種腫瘤的發(fā)病率和病死率[11]。基于CTC或ctDNA的液體活檢檢測為多種實體瘤患者檢測MRD的主要方式,其中臨床上以基于ctDNA的MRD檢測更為常見。

2.2 MRD的發(fā)生機制腫瘤難以治愈的解釋之一是放化療對實體瘤細胞造成的損傷是隨機分布的,這就無法保證每個腫瘤細胞都得到了有效的消滅,總有部分腫瘤細胞受到的損傷較小從而導(dǎo)致這部分腫瘤細胞的再生,即出現(xiàn)MRD。目前已有部分研究提出了腫瘤細胞反復(fù)在藥物敏感性腫瘤中存活的機制,除了腫瘤細胞自身內(nèi)部的機制外,腫瘤微環(huán)境的變化,如來自成纖維細胞、免疫細胞、細胞外基質(zhì)及血管網(wǎng)絡(luò)等的信號也發(fā)揮了一定作用[8]。

2.2.1腫瘤細胞內(nèi)部機制 (1)腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)對治療耐受性更強:腫瘤的生長依賴于一些能夠自我更新的CSC,而另外大部分腫瘤細胞由快速增殖的細胞和有絲分裂后的分化細胞組成,這些細胞不能自己形成腫瘤。關(guān)于MRD,CSC方面的研究認為CSC對放療及藥物治療的耐受性更強,從而導(dǎo)致了患者初始治療后的腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移[12-13]。(2)殘留的腫瘤細胞增殖速率加強:有研究觀察到,在放化療期間腫瘤細胞的再生速率隨時間遞增。在患者初始治療后,后續(xù)的治療周期中腫瘤細胞將加速再生最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[14]。(3)殘留的細胞表現(xiàn)出代謝特性同時依賴自噬來生存:殘留的腫瘤細胞表現(xiàn)出了獨特的代謝特性,如細胞糖酵解更少,更依賴線粒體途徑產(chǎn)生能量等;同時細胞自噬和微脂自噬對這些殘留細胞的生存起到了至關(guān)重要的作用[15]。(4)多倍體殘留腫瘤細胞更易復(fù)發(fā):部分殘留細胞通過暫停腫瘤細胞的有絲分裂活性,同時維持DNA的復(fù)制從而進入細胞周期阻滯來導(dǎo)致復(fù)發(fā)。有絲分裂中DNA的解偶是p53缺陷細胞的一個重要特征[16]。(5)殘留的腫瘤細胞或許經(jīng)歷了染色質(zhì)介導(dǎo)的可逆性耐藥狀態(tài):對持續(xù)性耐藥細胞(drug-tolerant persisters, DTPs)的基因表達分析揭示了幾個參與染色質(zhì)修飾基因的改變。值得注意的是,組蛋白H3K去甲基化酶KDM5A/Jarid1A的基因表達增加,其表達缺失減少了DTPs的數(shù)量[17]。

2.2.2腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的影響 (1)TME分泌的因子影響腫瘤的生長和耐藥性:腫瘤細胞和TME中的細胞之間存在相互作用,從而影響腫瘤細胞對凋亡的敏感性及對化療的反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤基質(zhì)細胞分泌的肝細胞生長因子可保護鄰近的腫瘤細胞不被藥物損傷[18]。(2)TME中的免疫細胞影響腫瘤的生長:腫瘤浸潤性免疫細胞在控制腫瘤生長中起重要作用,腫瘤免疫編輯的概念描述了免疫系統(tǒng)對腫瘤生長的影響[19]。(3)腫瘤血管化:腫瘤細胞和血管之間距離的變化可能是影響腫瘤內(nèi)治療異質(zhì)性的另一個重要因素。有研究表明靠近血管系統(tǒng)的腫瘤細胞較遠處的腫瘤細胞更容易被化療藥物損傷和消滅[20]。

3 MRD評估技術(shù)

3.1 基于CTC的評估

3.1.1CTC的富集 CTC利用腫瘤細胞和血細胞之間的差異性來實現(xiàn)高效富集,包括細胞表面蛋白的差異表達和細胞其他的不同物理特性等。在標(biāo)志物方面,上皮細胞黏附分子(EPCAM)是CTC中應(yīng)用最廣泛、用以進行陽性選擇的細胞表面蛋白[21]。此外,其他上皮細胞表面抗原如EGFR、mucin 1、組織特異性抗原(包括前列腺癌細胞特異性膜抗原PSMA、乳腺癌特異性抗原HER2)都可以在CTC中對某類具有特定特征的腫瘤細胞進行富集[22-26]。

CTC富集的非標(biāo)記性技術(shù)是基于腫瘤細胞和非惡性血細胞的大小、密度、電荷和變形能力之間的物理差異[27]。這些特征在CTC之間差異很大,可能會存在一些細胞重疊。CTC的大小定義取決于例如微過濾器的捕獲裝置,研究顯示大多數(shù)血細胞的直徑約為10 μm,而CTC的直徑變化較大,大多數(shù)為6～20 μm[28]。目前微過濾技術(shù)已逐步發(fā)展成熟,其原理是將血液通過微孔或微流控步驟,對尺寸進行校準后進行捕獲[29]。

3.1.2CTC的檢測 CTC富集后其內(nèi)部可能仍包含數(shù)百到數(shù)千個白細胞,所以后期需要使用特定的可靠方法來識別單個的CTC。CTC可以采用一系列的方法來識別,主要方法是使用針對細胞膜和細胞質(zhì)抗原的抗體直接進行免疫檢測,包括上皮、間充質(zhì)、組織特異性和腫瘤特異性相關(guān)標(biāo)志物,例如PSMA、HER2等。同時應(yīng)用CD45排除白細胞,后續(xù)可通過手動操作分離已識別出的CTC[30]。上述方法操作相對較為繁瑣,后續(xù)可應(yīng)用另一種方法分離CTC用于進一步基因組、分子或功能分析。這種方法應(yīng)用DEPArray進行自動單細胞選擇,這是一種能夠在DEP中捕獲單個CTC的設(shè)備[31-32]。目前一種新的熒光激活細胞分選(fluorescence activated cell sorting, FACS)方法也被用于CTC檢測和表型分析,但這種技術(shù)通常需要一個預(yù)富集步驟,以達到足夠高的起始CTC濃度[33]。

CTC還可以通過基于核酸的原理來識別。在mRNA或DNA水平上檢測CTC需要通過使用引物來檢測組織特異性、器官特異性或腫瘤特異性的轉(zhuǎn)錄本,以及腫瘤特有的基因突變、易位或甲基化模式等。后續(xù)可使用RT-qPCR檢測低豐度的mRNA轉(zhuǎn)錄本,以此來定量CTC[34]。

一些功能分析方法,如上皮免疫位點(EPISPOT)也被開發(fā)應(yīng)用于CTC的檢測。利用這項技術(shù),可以根據(jù)熒光檢測從這些細胞分泌、脫落或以其他方式釋放的特定上皮蛋白來評估短期細胞培養(yǎng)物中存活CTC的存在(如CK19、PSA)[35]。該方法提供了樣本中存活CTC的定量信息,以及細胞培養(yǎng)過程中蛋白質(zhì)分泌或脫落的定性信息。同時這種檢測方法逐步發(fā)展成了敏感性液體微滴(EPIDROP)檢測,該種方法可以在單細胞水平上捕獲和檢測CTC[36]。使用這種方法可以對CTC進行染色,以確定CTC的總數(shù)(EPCAM+或EPCAM-)以及功能性CTC的數(shù)量[27]。

3.2 基于ctDNA的評估

3.2.1ctDNA的富集 近些年ctDNA用于臨床實體瘤患者MRD的檢測越來越普遍,相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究也層出不窮。其原理是腫瘤會將DNA釋放到血液中,通過患者常規(guī)采血后的血漿分離出ctDNA。雖然ctDNA只代表血漿中cfDNA的一小部分,但它可以通過PCR或二代測序(next generation sequencing, NGS)等方式進行擴增后檢測,然后針對腫瘤特異性突變、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異和表觀遺傳學(xué)特征進行分析[37-38]。

在基于ctDNA的MRD檢測中常以平均腫瘤分子數(shù)(mean tumor molecules, MTM)和等位基因變異頻率(variant allele frequency, VAF)來量化腫瘤的特異性變異。VAF測量了變異等位基因與野生型等位基因的比例,MTM檢測了細胞中游離DNA的總量[7]。當(dāng)前大多數(shù)基于ctDNA的MRD檢測平臺均以上述兩種方式中的一種來評估ctDNA數(shù)量。有研究分析了來自3 000多例患者的6 000余份血漿樣本,以評估VAF和MTM在多種實體腫瘤不同環(huán)境中的平均腫瘤負荷相關(guān)性。除去cfDNA水平較高(≥50 ng/mL)的情況外,VAF和MTM之間呈顯著正相關(guān)。隨著MTM的增加,VAF值趨于穩(wěn)定,這種情況可能是VAF在cfDNA高水平患者中的檢測局限性。同時,MTM在接受免疫治療的晚期實體瘤患者中較VAF有更強的預(yù)后相關(guān)性[39]。

3.2.2ctDNA的檢測 ctDNA的檢測方法包括,(1)PCR:應(yīng)用PCR將目標(biāo)基因或位點進行擴增后進行相關(guān)分析。(2)數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR):dPCR改進了傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR擴增,將DNA樣本劃分為較小的反應(yīng),特點是能夠提供一個絕對的定量,提高了反應(yīng)的敏感性[40]。(3)NGS:可分為擴增法NGS和捕獲法NGS,已應(yīng)用于幾種不同的ctDNA分析方法,無論是哪種方式的NGS都可以從一個生物樣本中檢測到數(shù)百萬至數(shù)十億的DNA分子[41-42]。(4)全基因組測序:理論上將全基因組測序(WGS)應(yīng)用于血漿中ctDNA檢測可以比NGS方法檢測到更多的突變,同時不需要進行panel選擇,但存在背景錯誤率高,追蹤突變數(shù)量過多、性價比不高等缺點[43]。(5)新興技術(shù):一些基于DNA甲基化或其他反映腫瘤細胞染色質(zhì)狀態(tài)的表觀遺傳特征的分析方法(片段組學(xué))已被用于檢測ctDNA[44]。

基于ctDNA的MRD檢測技術(shù)方法可分為兩種,分別是腫瘤知情檢測(tumor-informed assays)和腫瘤未知檢測(tumor-agnostic assays)。前者是對患者原發(fā)腫瘤進行監(jiān)測后,根據(jù)患者自身情況個性化定制panel進行后續(xù)的監(jiān)測,后者是將既往與相關(guān)腫瘤相關(guān)的基因組成固定panel進行檢測。

在患者有手術(shù)及治療的情況下,治療后進行ctDNA檢測的周期十分關(guān)鍵,需在手術(shù)后2～4周進行檢測。這是因為手術(shù)后可能導(dǎo)致患者正常的循環(huán)cfDNA水平升高,導(dǎo)致檢測的背景噪聲增強。這種情況會稀釋ctDNA,降低檢測的敏感性。同時建議對手術(shù)前4周內(nèi)檢測不到ctDNA的患者進行重復(fù)檢測,以避免假陰性[45-46]。此外,在患者全身治療過程中,ctDNA水平會迅速下降。理想情況下,MRD評估應(yīng)在輔助化療開始之前,而不是在全身治療期間。在進行動態(tài)監(jiān)測的情況下,對輔助治療結(jié)束后2～4周再進行基于ctDNA的MRD評估才更合理[7]。國內(nèi)《非小細胞肺癌分子殘留病灶專家共識》推薦MRD首次檢測時間窗在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)根治性治療1周～1個月;早期NSCLC患者根治性切除術(shù)后,MRD陽性提示復(fù)發(fā)風(fēng)險高,需進行密切隨訪管理,建議每3～6個月進行1次MRD檢測[47]。

4 MRD在腫瘤進展中的作用

4.1 早期腫瘤高危人群分層在早期腫瘤患者人群中,部分患者經(jīng)過根治治療可以達到治愈的目的,但還有許多患者體內(nèi)會攜帶MRD。此時MRD檢測可以輔助對這部分早期患者進行分層。對于檢測后提示無MRD的患者只需接受定期隨訪,而針對手術(shù)/放化療等手段后仍檢測出MRD的患者應(yīng)進行相應(yīng)治療策略的調(diào)整[48]。該種方式可以為治愈的早期腫瘤患者減少治療負擔(dān),篩選出高復(fù)發(fā)風(fēng)險、最能從輔助治療中獲益的早期腫瘤患者,避免過度診療,節(jié)省醫(yī)療資源。

4.2 療效預(yù)測及治療指導(dǎo)LUNGCA-1研究為大規(guī)模前瞻性、多中心隊列研究,研究納入了不同分期的NSCLC患者。在對這些患者的術(shù)前血樣檢測發(fā)現(xiàn),術(shù)前ctDNA檢測MRD陽性患者中有46.4%出現(xiàn)了術(shù)后復(fù)發(fā),而術(shù)前ctDNA檢測MRD陰性患者中僅有14.6%復(fù)發(fā)[49]。這種現(xiàn)象也提示我們患者術(shù)前MRD檢測可以對治療療效進行一定的預(yù)測。同時在患者治療期間,ctDNA的變化也能反映出患者對治療的敏感度,當(dāng)患者MRD持續(xù)升高要考慮治療方式的選擇是否出現(xiàn)問題,是否需要更換治療方法等[50]。

4.3 預(yù)后判斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測MRD檢測相比于傳統(tǒng)檢測(影像學(xué)/腫瘤標(biāo)志物)的最大優(yōu)勢就是更早的檢測出腫瘤細胞陽性,從而預(yù)測復(fù)發(fā)。同時血液/體液樣本相對于組織學(xué)樣本更易獲取,創(chuàng)傷性較小,可以在患者治療后的一段時間內(nèi)進行動態(tài)檢測,以提示患者復(fù)發(fā)風(fēng)險程度。術(shù)后輔助治療后ctDNA持續(xù)陰性或下降至陰性并持續(xù)為0則提示患者復(fù)發(fā)風(fēng)險較低;術(shù)后輔助治療后ctDNA先降后升或停止治療后迅速上升則提示患者出現(xiàn)耐受,需更換治療方式;術(shù)后ctDNA為陰性,在未接受治療的情況下逐步上升則提示患者出現(xiàn)MRD,存在復(fù)發(fā)風(fēng)險[47]。

5 MRD在腫瘤診斷中的作用

近些年MRD檢測技術(shù)已逐漸應(yīng)用于多個實體瘤中,關(guān)于MRD的臨床研究也展示了許多十分重要的成果。目前基于CTC和ctDNA的MRD檢測技術(shù)已應(yīng)用于乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌和肺癌等。

5.1 肺癌有研究針對接受化療的晚期NSCLC人群進行基于CTC的MRD檢測(某些患者需行姑息放療)。研究包含了70例Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者,這部分患者在1個周期化療后進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在7.5 mL血液中檢測到>5個CTC的患者預(yù)后明顯差于<5個CTC的患者[51]。在基于ctDNA的MRD檢測研究中也發(fā)現(xiàn),MRD持續(xù)陰性患者的長期臨床結(jié)局較好,復(fù)發(fā)率較低。同時該研究還顯示在患者術(shù)后12～18個月內(nèi)MRD陽性及復(fù)發(fā)風(fēng)險達到了高峰[52]。

5.2 結(jié)直腸癌一項單中心研究針對183例非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行了CTC的前瞻性隨訪評估,從初始診斷起中位隨訪時間5.1年。在對30 mL血液分析后顯示,44例患者(24%)在術(shù)前檢測出CTC,且CTC陽性與不良結(jié)局相關(guān)[53]。另有研究應(yīng)用基于ctDNA的NGS方法對230例Ⅱ期結(jié)腸癌患者的1 046份血漿樣本進行了MRD前瞻性分析。在178例未接受輔助化療的患者中,14例(7.9%)患者術(shù)后檢測到ctDNA。中位隨訪時間27個月,ctDNA陽性患者的復(fù)發(fā)率高于ctDNA陰性患者[54]。

5.3 乳腺癌有研究證明診斷為乳腺癌后5年左右患者存在CTC可能預(yù)示著HER2陰性乳腺癌的復(fù)發(fā)。在353例激素受體陽性乳腺癌患者中,CTC陽性組的復(fù)發(fā)率為21.4%,而CTC陰性組的復(fù)發(fā)率僅為2.0%。多變量分析表明,CTC陽性預(yù)示著復(fù)發(fā)風(fēng)險將增加13.1倍[55]。另有研究應(yīng)用134個癌癥相關(guān)基因組成的Panel來評估ctDNA作為MRD生物標(biāo)志物的適用性。在新輔助化療后存在MRD的38例三陰型乳腺癌患者中,33例原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)了至少1個突變。有4例患者在輔助治療期間的cfDNA樣本中檢測到突變,且這4例患者在9個月內(nèi)病情出現(xiàn)了復(fù)發(fā)[56],雖然樣本量較小、但也可以說明基于ctDNA的MRD檢測與乳腺癌患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

6 總結(jié)

在過去10年里,MRD檢測為腫瘤診斷開辟了新的途徑,為個性化治療提供了重要的臨床線索。同時基于CTC和ctDNA的MRD評估為患者腫瘤隱匿階段的MRD檢測提供了更可靠的依據(jù)。目前越來越多的實體瘤MRD臨床試驗投入到研究中,我們期待這些試驗?zāi)軌蚪鉀Q更多臨床場景中所面臨的實際問題。在未來MRD檢測也面臨著諸多挑戰(zhàn),例如更多檢測方式的選擇、檢測方法的特異性和敏感性等。同時MRD的標(biāo)準化、質(zhì)量控制方案以及相應(yīng)的實驗室認證也將是其應(yīng)用轉(zhuǎn)化為臨床常規(guī)的主要挑戰(zhàn)。