蔣 飛 ,戴習(xí)林
(1.上海市水產(chǎn)研究所,上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站,上海 200433;2.上海海洋大學(xué),水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 201306)
羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii),俗稱泰國蝦或馬來西亞大蝦等,原產(chǎn)于東南亞、南亞和西太平洋島嶼,在我國有兩大主要產(chǎn)區(qū),包括兩廣地區(qū)和江浙滬一帶。因其營養(yǎng)豐富、體型較大、生長速度快,抗病能力強(qiáng),羅氏沼蝦已成為我國主要的淡水養(yǎng)殖蝦類[1]。雖然人工育苗技術(shù)的突破和養(yǎng)殖技術(shù)的提升提高了羅氏沼蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)量,但是近年來羅氏沼蝦的種質(zhì)退化現(xiàn)象日益凸顯,影響了我國羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此,需要開展不同地區(qū)羅氏沼蝦種群的遺傳多樣性分析,以更好地指導(dǎo)羅氏沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)。
近年來,國內(nèi)外關(guān)于羅氏沼蝦在細(xì)胞遺傳學(xué)、生化遺傳學(xué)以及分子遺傳學(xué)等方面的研究都已有報(bào)道[2-5]。線粒體脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、分子量小、呈母系遺傳、進(jìn)化速度快等優(yōu)點(diǎn),在水產(chǎn)動(dòng)物群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究中已得到廣泛應(yīng)用,其中COⅠ基因長度適宜、進(jìn)化速率適中且遺傳信息量較大,也常被用于種群分析[6-8]。本實(shí)驗(yàn)擬通過線粒體COⅠ基因序列分析,對上海選育群體(SC)、浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)和泰國野生群體(TL)進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期在線粒體水平上了解羅氏沼蝦的遺傳背景,為羅氏沼蝦遺傳改良和可持續(xù)健康發(fā)展提供理論參考。
上海選育群體(SC):2014年7月采自上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)公司養(yǎng)殖基地(上海漕涇鎮(zhèn))。浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)來源于2014年7月浙江南太湖種業(yè)有限公司。泰國野生群體(TL)采自2014年7月泰國天然水域中。
上海選育群體(SC)和浙江養(yǎng)殖群體(ZJ)各隨機(jī)采樣90尾,泰國野生群體(TL)隨機(jī)采樣雌、雄各15尾,所有樣本浸泡于無水乙醇中,帶回實(shí)驗(yàn)室,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
從3個(gè)羅氏沼蝦群體中分別隨機(jī)選取10個(gè)樣本,共計(jì)30個(gè)樣本,羅氏沼蝦基因組DNA的提取主要參考Moore D D等[9]的方法并稍作改進(jìn)。采用蛋白酶K裂解液消化、酚-氯仿法抽提并純化DNA、-20℃無水乙醇沉淀的方法提取肌肉組織中的DNA,TE緩沖液稀釋后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
COⅠ基因片段擴(kuò)增引物為COⅠ-F(5′-ATTGTCACTGCCCACGCATT-3′ )、COⅠ-R(5′-TGTTGGTAGAGGATCGGGTC-3′ )。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0% EB-瓊脂糖凝膠電泳檢測驗(yàn)證,結(jié)果符合測序要求,由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測序。
將測得的序列用BioEdit 7.0.5.2進(jìn)行序列比對,并輔以人工校對,去除兩端冗余序列;用DNSP 5.1軟件計(jì)算群體遺傳變異參數(shù):單倍型數(shù)量(Number of haplotypes)、單倍型多樣性指數(shù)(Haplotype diversity index,Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Nucleotide diversity index,π)和平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide differences,K);用Arlequin 3.1軟件統(tǒng)計(jì)分子多態(tài)性指數(shù),并對群體遺傳變異進(jìn)行分子方差分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)和遺傳分化系數(shù)(Fixation index statistics,F(xiàn)st)檢驗(yàn)。用MEGA 5.0軟件中的Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算各群體內(nèi)和群體間遺傳距離,并基于遺傳距離構(gòu)建群體間的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。
對測得的序列采用BioEdit軟件進(jìn)行比對分析,去除兩端多余序列,得到458 bp有效長度的序列,并對其進(jìn)一步分析。在458 bp COⅠ基因序列中,共檢測到8個(gè)變異位點(diǎn),并且全部單堿基突變,無堿基顛換,群體間的堿基差異較小。MEGA 5.0軟件分析顯示,所有樣本序列的A、T、C和G堿基含量的平均值分別為26.3%、28.1%、26.1%和19.6%,A+T的含量為54.4%,高于G+C的含量45.7%。3個(gè)羅氏沼蝦群體中共有4種單倍型,SC群體、ZJ群體和TL群體的基因型種類分別為1、2和3種。
對3個(gè)羅氏沼蝦群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析(表1),結(jié)果顯示群體SC、ZJ和TL的單倍型多樣性指數(shù)(Hd)依次為0、0.356和0.733;核苷酸多樣性指數(shù)最高的是ZJ群體(π=0.005),其次是TL群體(π=0.002),SC群體最低(π=0)。對3個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行Tajima′s D中性檢驗(yàn),結(jié)果范圍為0~1.337,3個(gè)群體Tajima′s D 的P值均大于0.05,差異不顯著,說明COⅠ基因序列核苷酸的變化符合中性突變假說。
用Arlequin 3.1軟件進(jìn)行AMOVA分析,3個(gè)羅氏沼蝦群體的遺傳變異結(jié)構(gòu)和變異來源見表2。AMOVA的分析結(jié)果表明,在羅氏沼蝦3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)差異中,有74.5%遺傳差異來源于群體間,25.5%遺傳差異來源于群體內(nèi)。群體間的遺傳變異明顯高于群體內(nèi)的遺傳變異。
表2 3個(gè)羅氏沼蝦群體間和群體內(nèi)的分子方差分析(AMOVA)
3個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)和遺傳距離結(jié)果如表3所示,SC群體與TL群體遺傳分化指數(shù)最高(Fst=0.925),其次是ZJ群體與TL群體(Fst=0.687),SC群體與ZJ群體的遺傳分化指數(shù)最低(Fst=0.111);SC群體與ZJ群體的遺傳距離較近,約為0.003,而與TL群體的遺傳距離較遠(yuǎn),約為0.013。
表3 3個(gè)羅氏沼蝦群體間遺傳分化指數(shù)和群體遺傳距離
根據(jù)COⅠ基因序列,從GenBank中下載與羅氏沼蝦同屬不同種的日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense,Mn)(登錄號:FM958077)作為外群,采用NJ法和UPMGA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可知,2種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹趨于一致,沼蝦屬的2個(gè)種聚為兩大支:日本沼蝦的遺傳距離與羅氏沼蝦3個(gè)群體均明顯偏遠(yuǎn),單獨(dú)聚為一支;SC群體與ZJ群體遺傳距離最近,首先聚在一起成為一小支,然后再與TL群體聚為另一支。
注:SC、ZJ、TL分別是來自上海、浙江、泰國的羅氏沼蝦;Mn為日本沼蝦。
線粒體DNA作為核外遺傳物質(zhì),普遍存在于真核細(xì)胞中,由于具有結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母系遺傳、變異性大、核苷酸替代率高等優(yōu)點(diǎn)[8,10],其已經(jīng)成為物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育以及種群遺傳等研究中一種有效的分子標(biāo)記[11]。mtDNA序列分析是DNA多態(tài)性分析技術(shù)中重要的方法之一,不論是群體還是個(gè)體,任何的遺傳變異或者多態(tài)都是DNA序列的差異,mtDNA序列分析可以檢測到堿基的插入、缺少和替換等變異信息,從而在分子水平上檢測個(gè)體、群體及種間的多態(tài)及遺傳差異[12]。COⅠ基因作為mtDNA的主要分子標(biāo)記之一,適用于種、亞種及地理種群間的系統(tǒng)關(guān)系研究[13]。COⅠ序列在蝦類的分子系統(tǒng)學(xué)中被廣泛應(yīng)用,如Carini G等[14]和 Vassilios K等[15]分別研究了澳洲沼蝦(M.australien)的遺傳結(jié)構(gòu)和不同地理種群的歐洲龍蝦(Homarusgammarus)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。
本研究初步分析了3個(gè)羅氏沼蝦群體線粒體COⅠ序列的差異,共檢測出8個(gè)變異位點(diǎn)、4個(gè)單倍型。變異位點(diǎn)和單倍型數(shù)量少可能是由于各群體樣品檢測數(shù)量偏低或COⅠ基因序列無法將其很好地區(qū)分開。但是TL群體的單倍型數(shù)量(3個(gè))分別高于SC群體(1個(gè))和ZJ群體(2個(gè))的單倍型數(shù)量,這至少可以說明浙江養(yǎng)殖群體和上海選育群體因長期的人工養(yǎng)殖和選育,導(dǎo)致其遺傳多樣性較野生群體有所降低。堿基組成分析表明,A+T的平均含量(54.4%)高于G+C的平均含量(45.7%),這與許多研究者在其他蝦蟹類線粒體基因中檢測到的結(jié)果類似,如姜虎成等[16]研究發(fā)現(xiàn),淮河水系日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)A+T的含量(59.0%)高于G+C含量(41.0%);葛家春等[17]研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)G+C含量(37.6%)低于A+T的含量(62.4%)。
當(dāng)采用線粒體DNA研究群體遺傳多樣性時(shí),核苷酸多樣性指數(shù)(π)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)均是衡量群體遺傳多樣性的2個(gè)重要指標(biāo)[18]。有些群體通過變異積累了單倍型的多態(tài)性,而并不能積累核苷酸序列的多樣化[19]。本研究結(jié)果表明,TL群體的單倍型多樣性指數(shù)較高(Hd=0.733),但其核苷酸多樣性指數(shù)(π=0.002)明顯偏低,說明TL群體可能是由少量個(gè)體擴(kuò)增形成的一個(gè)小種群。SC群體和ZJ群體的Hd值和π值均較低,造成這一現(xiàn)象的主要原因可能是這兩個(gè)群體在長期人工養(yǎng)殖和選育過程中發(fā)生了遺傳漂變(Genetic drift)、近交(Inbreeding)或奠基者效應(yīng)(Founder effect)[20-21]。
群體間遺傳分化系數(shù)(Fst)經(jīng)常用于衡量群體間基因分化的程度[22],F(xiàn)st值的大小與群體遺傳分化水平符合正相關(guān)關(guān)系。在0~1的范圍內(nèi),F(xiàn)st值為0~0.05屬于遺傳分化微弱;Fst值在0.05~0.15之間屬于中度遺傳分化;Fst值為0.15~0.25屬于高度遺傳分化;Fst值在0.25以上屬于極高度遺傳分化[23]。本研究中,SC群體與ZJ群體(Fst=0.111)屬于中度遺傳分化;SC群體與TL群體(Fst=0.925)、ZJ群體與TL群體(Fst=0.687)都屬于極高度遺傳分化,由此證明長期閉鎖選育和人工養(yǎng)殖對羅氏沼蝦的遺傳結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生了影響。
Hebert P D N等[24]曾經(jīng)對動(dòng)物界的11門13 320個(gè)物種的線粒體COⅠ基因進(jìn)行序列比較分析,得出物種內(nèi)的遺傳距離大部分小于0.010,很少有大于0.020的結(jié)論;本研究中,根據(jù)羅氏沼蝦3個(gè)不同群體的遺傳距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出,基于線粒體COⅠ基因序列的3個(gè)羅氏沼蝦群體間的種內(nèi)遺傳距離為0.003~0.013,與其研究結(jié)果一致。SC群體與ZJ群體遺傳距離最小,為0.003,親緣關(guān)系較近。SC群體和ZJ群體與TL群體的遺傳距離分別為0.013和0.011,遺傳距離相對較大,親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)?;谶z傳距離構(gòu)建的NJ和UPMGA系統(tǒng)進(jìn)化樹趨于一致,SC群體首先與ZJ群體聚在一起成為一小支,然后再與TL群體聚為另一支,結(jié)果表明3個(gè)群體的遺傳距離進(jìn)化關(guān)系與聚類關(guān)系類似。產(chǎn)生這樣結(jié)果的原因可能是SC群體和ZJ群體的遺傳背景相似,而與TL群體遺傳背景差異較大,亦或是SC群體、ZJ群體與TL群體存在養(yǎng)殖地理環(huán)境的差異。
鑒于本研究是從一個(gè)線粒體基因?qū)α_氏沼蝦3個(gè)不同群體的遺傳多樣性進(jìn)行評估,且樣本量有限,因此上述結(jié)果只可作初步參考,而后期有必要增加檢測樣本數(shù)量,同時(shí)將從其他多個(gè)線粒體基因并配合核DNA遺傳分析,以期得到更全面和客觀的結(jié)果。