基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探究茵梔黃顆粒治療肝纖維化的作用機(jī)制

申鳳霞，范建偉，李倩，馬云，馮群，關(guān)永霞*

(1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 臨沂 276006；3.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400)

肝纖維化是肝臟結(jié)締組織異常增生，這些結(jié)締組織增生是由肝炎所導(dǎo)致的肝細(xì)胞的損傷所致。當(dāng)纖維化達(dá)到一定程度，纖維化組織會(huì)形成肝硬化的結(jié)節(jié)，逐漸變成肝硬化，甚至是肝衰竭[1]?，F(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化是由多因子、多細(xì)胞共同參與的一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)病變，活化的肝星狀細(xì)胞是參與肝纖維化形成與發(fā)展的主要細(xì)胞，其中涉及多個(gè)靶點(diǎn)和多條通路[2-3]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是肝纖維化治療的重要手段，干預(yù)肝纖維化進(jìn)程是該病治療過程中極其重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此尋求有效阻止肝纖維化進(jìn)程的藥物是目前研究的熱點(diǎn)之一[2]。

中藥在肝病的治療過程中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控作用機(jī)制，在治療肝病的同時(shí)兼顧機(jī)體的整體調(diào)節(jié)[4-5]，符合中醫(yī)治病的整體觀念。茵梔黃顆粒源于《傷寒論》中的茵陳蒿湯,是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味藥物的提取物制成的中藥制劑，具有清熱解毒、利濕退黃的功效，臨床上主要用于各種肝炎的治療[6]。方中茵陳味苦性微寒，善能清熱祛濕、利膽退黃，為君藥；梔子清三焦火邪，除肝膽濕熱而退黃；黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，與梔子共為臣藥；金銀花甘寒，清熱解毒，用為佐藥，全方清熱解毒、利濕退黃?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，茵梔黃顆粒具有利膽退黃，保肝利膽，治療肝炎、肝纖維化以及肝內(nèi)膽汁淤積的作用[7-8]。

隨著醫(yī)學(xué)的高速發(fā)展和大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生，并能很好地與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治不謀而合[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病等相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體角度來研究藥物對(duì)整個(gè)機(jī)體的影響，揭示中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同增效的作用機(jī)制，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供新的方法[9]。分子對(duì)接能夠預(yù)測(cè)化合物與靶蛋白之間的親和力，已成為計(jì)算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)。由于目前缺乏茵梔黃顆粒對(duì)肝纖維化治療的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用靶點(diǎn)、通路調(diào)控機(jī)制的深入研究，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法篩選茵梔黃顆粒有效成分、作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 茵梔黃顆?；钚猿煞旨鞍悬c(diǎn)的收集

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)和中國(guó)知網(wǎng)、萬方、維普三個(gè)數(shù)據(jù)庫的文獻(xiàn)檢索，分別收集茵梔黃顆粒中茵陳、梔子、黃芪、金銀花4味中藥的的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18為篩選條件[10-11]篩選出茵陳、梔子、黃芪、金銀花的活性成分。潛在活性成分的SMILE結(jié)構(gòu)式利用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行搜集，并導(dǎo)入SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2 茵梔黃顆粒與肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

從GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中下載與肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)，將上述SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)與從GeneCards數(shù)據(jù)庫下載的肝纖維化的靶點(diǎn)在Venn2.1.0中取交集，獲取共有靶點(diǎn)作為茵梔黃顆粒治療肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)，用于下一步的分析。

1.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將茵梔黃顆粒的候選活性成分與靶點(diǎn)的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape3.9.0軟件，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)分別代表化合物和靶點(diǎn)，邊代表化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，采用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì),計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度值(degree)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，將茵梔黃顆粒作用于肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo sapiens”，置信度設(shè)定為≥0.5，獲得蛋白質(zhì)之間的的相互作用關(guān)系，并以TSV格式保存下載，導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，根據(jù)度值篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 GO功能富集和KEGG通路富集分析

將茵梔黃顆粒與肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)輸入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫，分別進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，GO富集分析以P<0.05為篩選條件，選取下載結(jié)果中P值小于0.05的前15個(gè)生物學(xué)條目繪制條形圖。KEGG富集分析同樣以P<0.05為顯著富集篩選條件，選取P<0.05的前15條信號(hào)通路繪制氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接

茵梔黃顆粒中主要活性化合物的3D結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載，核心靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)從Protein Data Bank(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載。用Pymol軟件對(duì)核心靶蛋白進(jìn)行去除溶劑分子等的初步處理，再用AutoDock Tools進(jìn)一步加氫處理、加電荷處理，將核心靶蛋白和活性化合物保存為“pdbqt”格式的文件，并設(shè)置合適的格子位置和大小，最后，由Autodock Vine完成成分和靶點(diǎn)的對(duì)接。

2 結(jié)果及分析

2.1 茵梔黃顆粒活性成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索茵梔黃顆粒中的4味藥，共得到530個(gè)成分，其中茵陳53個(gè)，梔子98個(gè)，黃芩143個(gè)，金銀花236個(gè)。以同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，分別得到茵陳有效成分13個(gè)，梔子12個(gè)，黃芩14個(gè)，金銀花11個(gè)，刪除重復(fù)的共有成分，共計(jì)43個(gè)活性成分。一味藥可以含有多種活性成分，同一個(gè)活性成分也可以來自多味藥，表明不同中藥之間具有共同活性成分，與中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用機(jī)制是一致的，配伍使用具有協(xié)同增效的作用，為方便后續(xù)研究，這些成分被編號(hào)為MOL01～MOL43。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出茵梔黃顆粒的43個(gè)活性成分潛在作用靶點(diǎn)，刪除靶點(diǎn)重復(fù)項(xiàng)后，得到778個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)的收集及茵梔黃顆粒治療作用靶點(diǎn)的篩選

通過篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，選取相關(guān)性得分≥10的前500個(gè)肝纖維化的靶點(diǎn)，與茵梔黃顆粒有效成分的778個(gè)靶點(diǎn)取交集，二者映射后確定了111個(gè)共同作用靶點(diǎn)，作為茵梔黃顆粒作用于肝纖維化的潛在靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 茵梔黃顆粒和肝纖維化交集靶點(diǎn)的維恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection targets of Yinzhihuang Granules and liver fibrosis

2.3 茵梔黃顆?；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

茵梔黃顆粒的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，該網(wǎng)絡(luò)圖有154個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中包括活性化合物43個(gè)(三角形)，潛在靶點(diǎn)111個(gè)(圓形)，717條邊，邊代表化合物與靶點(diǎn)之間的靶向關(guān)系。43個(gè)活性成分作用于111個(gè)靶點(diǎn)，在一定程度上體現(xiàn)了中醫(yī)藥通過不同的活性成分作用于同一靶點(diǎn)，以及同一活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)的作用機(jī)制。采用插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，在網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)的大小代表該節(jié)點(diǎn)度值的大小，度值越大，表明該節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)中的樞紐作用越強(qiáng)，度值排名前15的主要成分見表1，43個(gè)活性成分的詳細(xì)信息見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1。基于此分析發(fā)現(xiàn)活性成分中槲皮素節(jié)點(diǎn)的度值最大，其次為β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷等。

表1 茵梔黃顆粒的主要活性成分Table 1 Fifteen main active ingredients of Yinzhihuang Granules

圖2 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of the active ingredient targets

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖分析

將111個(gè)茵梔黃顆粒治療肝纖維化相關(guān)的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI關(guān)系，隨后導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件進(jìn)行分析，見圖3。采用Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，計(jì)算度值，設(shè)置顏色的深淺和節(jié)點(diǎn)的大小反映度值的大小，根據(jù)度值的大小選出6個(gè)核心節(jié)點(diǎn)，分別是STAT3、AKT1、IL-6、TNF、EGFR、SRC，基于此推測(cè)這6個(gè)靶點(diǎn)為茵梔黃顆粒治療肝纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)篩選出的與肝纖維化相關(guān)的111個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分別選取P<0.05的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)的前15條目繪制條形圖，如圖4所示?？v坐標(biāo)代表GO的各個(gè)條目，橫坐標(biāo)代表富集到與該條目的靶點(diǎn)數(shù)目。BP主要涉及凋亡過程的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控等；MF主要包括酶結(jié)合、受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合等；CC主要包含線粒體、蛋白質(zhì)復(fù)合物、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合的細(xì)胞器等。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，一共富集得到110條信號(hào)通路，本研究選取下載結(jié)果中P<0.05前20條通路繪制氣泡圖進(jìn)行可視化分析，如圖5所示。富集結(jié)果顯示主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎、丙型肝炎、VEGF信號(hào)通路等信號(hào)通路，通路之間通過發(fā)揮協(xié)同作用起到治療肝纖維化的作用。

注：圖中氣泡大小代表通路富集的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)；圖中的顏色的變化代表P值的大小。圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of the KEGG pathway

2.6 分子對(duì)接

根據(jù)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖里活性成分度值的排名以及文獻(xiàn)調(diào)研[12-15]，本研究將活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷與PPI網(wǎng)絡(luò)里的排名前6的核心靶點(diǎn)STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC進(jìn)行分子對(duì)接，部分結(jié)果見表2，全表詳見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表2。其結(jié)合能均小于-20 kJ/mol，結(jié)合能越小表示結(jié)合活性越高，化合物越容易與該靶點(diǎn)結(jié)合。黃芩苷與EGFR結(jié)合能最低，其次是黃芩苷與STAT3，表明黃芩苷與EGFR、STAT3結(jié)合活性最強(qiáng)，分子對(duì)接情況如圖6所示。

表2 部分化合物與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of the compounds and targets

圖6 化合物與靶點(diǎn)分子對(duì)接圖Fig.6 Molecular docking diagram of the compounds and targets

3 討論

茵梔黃顆粒源自中醫(yī)經(jīng)典名方“茵陳蒿湯”,現(xiàn)代藥理研究表明茵梔黃顆粒具有清熱解毒、利膽退黃、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、光譜抗菌等功效[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆?？擅黠@降低酒精肝患者的炎癥反應(yīng)[4]，具有抑制肝細(xì)胞炎性病變、積極調(diào)控肝內(nèi)微循環(huán)、增強(qiáng)膽管收縮力，促進(jìn)膽汁分泌與排泄[16]的功效。茵梔黃顆粒在肝病的治療中已得到廣泛應(yīng)用，為了深入研究茵梔黃顆粒治療肝纖維化的作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，借助多個(gè)數(shù)據(jù)庫收集得到茵梔黃顆粒中530個(gè)成分和其對(duì)應(yīng)的778個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)OB和DL參數(shù)篩選出43個(gè)活性成分，其中111個(gè)靶點(diǎn)與肝纖維化相關(guān)。

通過分析化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷有較高的度值，其對(duì)應(yīng)的靶蛋白數(shù)目相對(duì)于其他成分較多，可能是茵梔黃顆粒治療肝纖維化的主要有效成分。其中槲皮素的度值最高，該復(fù)方中的的槲皮素來自茵陳、梔子和金銀花3味藥材，在肝臟疾病領(lǐng)域，槲皮素在非酒精性脂肪性肝病和肥胖癥中表現(xiàn)出調(diào)節(jié)脂肪、調(diào)節(jié)腸肝軸、穩(wěn)定肝星狀細(xì)胞以減少纖維化和影響丙型肝炎病毒生命周期的能力[12,17]，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過上調(diào)IL-10和HO-1的表達(dá)從而抑制NLRP3炎癥小體激活和炎癥因子分泌，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)急性酒精性損傷肝的保護(hù)作用[12-13]。β-谷甾醇是茵梔黃顆粒中茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味藥材均含有的成分，研究表明，β-谷甾醇能抑制血清中酒精引起的生化指標(biāo)的變化，減輕酒精引起的氧化應(yīng)激，例如恢復(fù)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、減少谷胱甘肽消耗、恢復(fù)抗氧化酶活性和減少丙二醛的過度產(chǎn)生，β-谷甾醇還可以通過PI3K/Akt通路下調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[14]。此外，β-谷甾醇成功地減輕了二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，并防止了膠原的積聚，具有抗肝臟纖維化的功效[18]。木犀草素是金銀花的活性成分，能夠降低小鼠肝指數(shù)和血清中AST、ALT的水平，改善肝細(xì)胞脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死，對(duì)酒精所致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用[15]。山奈酚對(duì)四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，顯著降低肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍和程度[19-20]。梔子苷為梔子的主要活性成分，也是《中國(guó)藥典》要求的檢測(cè)成分，能夠下調(diào)炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)，抑制TLR4表達(dá)NF-κB的活化，起到抗炎的作用，此外還具有改善肝纖維化的功能[21-22]。綠原酸是一種多酚類化合物，具有抗氧化和抗炎特性，已有研究表明綠原酸可以有效地減輕大鼠肝纖維化，通過抑制炎性因子的表達(dá)在急性酒精性肝損傷中起到保護(hù)作用[23-24]。黃芩苷能夠改善肝功能和炎癥指標(biāo)，對(duì)肝臟起到保護(hù)作用，已有研究表明黃芩苷有效地減輕了MCD飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性、炎癥、纖維化和細(xì)胞凋亡，黃芩苷的這些調(diào)節(jié)作用是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制促炎細(xì)胞因子如TNF-α等進(jìn)而預(yù)防肝纖維化[25]。此外還有研究證明，黃芩苷通過抑制氧化應(yīng)激，從而減少炎癥和細(xì)胞凋亡，對(duì)ATO誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用，通過調(diào)控STAT3等關(guān)鍵蛋白進(jìn)而調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路參與對(duì)肝臟的保護(hù)作用[26]。

本研究通過對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，排名前6位的核心靶點(diǎn)分別為STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通過參與肝星狀細(xì)胞的增殖和活化進(jìn)而參與到肝纖維化的過程中，在肝細(xì)胞中，適度表達(dá)的STAT3可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，有助于肝臟的修復(fù)，但是STAT3的過表達(dá)導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化、過度增殖，誘發(fā)肝纖維化，甚至是肝臟癌變[27]。AKT1參與調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)代謝和血管生成等多個(gè)過程，研究顯示，哺乳動(dòng)物雷帕霉素復(fù)合物靶蛋白2(mTORC2)在c-Myc驅(qū)動(dòng)的小鼠肝細(xì)胞癌中被激活，導(dǎo)致AKT1磷酸化激活，c-Myc的激活與磷酸化AKT1的表達(dá)密切相關(guān)。AKT1高表達(dá)與肝癌患者生存期差有關(guān)，AKT1的缺失可完全阻止小鼠c-Myc誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌形成[28]，調(diào)節(jié)AKT1誘導(dǎo)血管新生、保護(hù)血管，從而改善肝纖維化[29]。白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種在體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，在正常生理?xiàng)l件下，是肝組織穩(wěn)態(tài)、肝臟再生、抗病毒和代謝功能微調(diào)所必需的。IL-6是適應(yīng)性免疫的重要調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化并調(diào)節(jié)自身免疫。IL-6可以增強(qiáng)抗病毒適應(yīng)性免疫反應(yīng)并減輕慢性感染期間T細(xì)胞的耗竭，是調(diào)節(jié)肝臟再生和支持效應(yīng)免疫功能的關(guān)鍵因素，表明IL-6的這些功能可用于肝臟病治療[30-31]。TNF-α可以誘導(dǎo)多種致纖維化、致炎因子產(chǎn)生，對(duì)肝纖維化的啟動(dòng)及調(diào)控起重要作用，TNF-α是激活肝星狀細(xì)胞持續(xù)活化的核心細(xì)胞因子，肝星狀細(xì)胞的持續(xù)性活化是肝纖維化發(fā)生的病理基礎(chǔ)，由此推測(cè)抑制TNF-α的表達(dá)有助于減緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生和肝纖維的啟動(dòng)[32]。Scheving等[33]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及其配體與肝纖維化有關(guān)，降低EGFR的表達(dá)，可以抑制肝纖維化過程中血管生成和肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)部分肝組織的纖維化[34-35]。已有研究表明，SRC在硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型和肝硬化患者中表達(dá)上調(diào)，磷酸化的SRC在肝星狀細(xì)胞活化過程中上調(diào)，抑制SRC可以降低原代肝星狀細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)，并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)，這些結(jié)果表明SRC在肝纖維化中起重要作用，抑制SRC的過表達(dá)可以防止肝纖維化[36]。

從KEGG通路富集中可知茵梔黃顆粒治療肝纖維化可能通過PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎、丙型肝炎等關(guān)鍵通路發(fā)揮作用。PI3K-Akt信號(hào)通路的激活可以調(diào)控下游蛋白參與細(xì)胞增殖凋亡等一系列的生理活動(dòng)，通過抑制PI3K-Akt通路信號(hào)的傳導(dǎo)來降低機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低炎性因子的表達(dá)水平，對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞有抑制作用，可以阻止肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展[37]。并基于分子對(duì)接初步模擬活性成分與靶標(biāo)之間可能的分子作用機(jī)制，結(jié)合能的大小直接反映預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，其結(jié)合能均小于-20 kJ/mol，結(jié)合能越小表示結(jié)合活性越高，表明化合物越容易與該靶點(diǎn)結(jié)合。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，初步闡明了茵梔黃顆粒多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同增效治療肝纖維化的作用機(jī)制。茵梔黃顆?？赡苁峭ㄟ^槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山柰酚、梔子苷、綠原酸、黃芩苷等活性成分，作用于STAT3、AKT1、IL6、TNF、EGFR、SRC等靶點(diǎn)，參與多通路的調(diào)控，通過抗炎、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和肝星狀細(xì)胞的活化等發(fā)揮治療肝纖維化的作用。該研究為進(jìn)一步驗(yàn)證茵梔黃顆粒治療肝纖維化的相關(guān)靶點(diǎn)及通路提供了依據(jù)，為茵梔黃顆粒新功能的發(fā)現(xiàn)以及治療肝纖維化新藥的開發(fā)提供了一定的參考依據(jù)，同時(shí)為深入開發(fā)茵梔黃顆粒提供了方法學(xué)支撐，也為后續(xù)的基礎(chǔ)機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。但本研究?jī)H從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接層面來探究茵梔黃顆?？垢卫w維化作用的有效活性成分及作用靶點(diǎn)，存在一定的局限，因此在后續(xù)的研究中將進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，并結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。