基于HS-SPME-GC-MS鑒定不同樹齡柚子花關(guān)鍵呈香物質(zhì)

馮 濤，孫嘉卿，王秀敏，夏賢水，朱 霖，姚凌云*

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)，上海 201418；2.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103；3.上海大蓮湖果業(yè)專業(yè)合作社，上海 201799)

柚子花，花期早而且比較短，一般集中在每年的3月下旬至4月下旬開放，多為花苞。原產(chǎn)于東南亞，在我國已有3 000多年的栽培歷史，浙江、廣西、廣東、福建等均有栽種[1]。柚子花的花香清爽、甜美、馥郁，在我國產(chǎn)量巨大，是理想的香花資源[2]。柚子花作為一種常見的窨制輔料，在一些花茶的制作中有很好的應(yīng)用[3]。

早期，日本的栽培技術(shù)針對(duì)水分脅迫和柚子花開花的關(guān)系有所研究[4]。近年來，福建琯溪蜜柚受到廣泛關(guān)注，張利軍等[5]研究了福建琯溪蜜柚的落花落果與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的關(guān)系。葉鵬等[6]采用液液萃取和水蒸氣蒸餾法對(duì)琯溪蜜柚的柚子花風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，共鑒定出19種風(fēng)味物質(zhì)。Vivian Goh等[7]對(duì)我國和東南亞各國產(chǎn)的柚子不同部位進(jìn)行風(fēng)味分析對(duì)比，對(duì)柚子花采用脂吸法和油萃取的方法進(jìn)行前處理，再分別采用頂空固相微萃取和溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)的方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)油萃取的前處理方法相對(duì)更好。不同產(chǎn)地柚子花中均已經(jīng)被鑒定出的主要風(fēng)味物質(zhì)有檸檬烯、β-羅勒烯、芳樟醇、香葉醇等[8]。而針對(duì)我國華東產(chǎn)區(qū)的柚子花以及不同樹齡對(duì)柚子花風(fēng)味的影響的研究鮮見報(bào)道。

揮發(fā)性香氣物質(zhì)對(duì)于鮮花品質(zhì)是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。不同種類、產(chǎn)地、收獲季節(jié)、前處理方式等都會(huì)影響到其風(fēng)味物質(zhì)[9]。水蒸氣蒸餾法得到的鮮花精油是最常用的鮮花香氣物質(zhì)的分析方法[10]。但對(duì)于一些沸點(diǎn)較低的易揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取率相對(duì)較低。頂空固相微萃取技術(shù)(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)集采樣、萃取、濃縮和進(jìn)樣于一體，操作簡(jiǎn)單且高效，富集效果較好[11]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)被廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)性成分分析的檢測(cè)，具有所需樣品少、分析速度快、靈敏度高等特性，并可以檢測(cè)出特定的風(fēng)味化合物[12]。雙柱定性法旨在對(duì)樣品中的極性以及非極性的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行全面的分析捕捉和驗(yàn)證。香氣活力值(odor activity value，OAV)是揮發(fā)性物質(zhì)濃度與其對(duì)應(yīng)介質(zhì)中氣味閾值的比值，其值越大，說明該物質(zhì)對(duì)呈香越重要，是關(guān)鍵呈香成分分析的重要手段，此方法可通過理論值的計(jì)算來表征揮發(fā)性物質(zhì)香氣的貢獻(xiàn)度[13]。該研究采用頂空固相微萃取技術(shù)與氣相質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)2種樹齡的柚子花揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行富集分析鑒定，采用雙柱法進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量，能夠較為全面地對(duì)2種柚子花的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑供試樣品為上海青浦4月大樹(10年樹齡)和小樹(5年樹齡)現(xiàn)場(chǎng)采摘的柚子花，采摘后迅速密封包裝，放入冷凍(-20 ℃)保藏運(yùn)輸于實(shí)驗(yàn)室，用于揮發(fā)性成分檢測(cè)；1，2-鄰二氯苯(100 mg/L)購于Sigma Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)公司。

1.2 儀器與設(shè)備7890B-5977B 型 GC-MS 聯(lián)用儀，安捷倫科技(中國)有限公司；色譜柱 HP-Innowax(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和色譜柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，安捷倫科技(中國)有限公司；嗅聞儀(ODP 2)，德國 Gerstel公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1柚子花中香氣物質(zhì)的萃取。準(zhǔn)確稱取5.0 g新鮮解凍后的柚子花，置于20 mL帶有聚四氟乙烯瓶蓋的頂空小瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L，1，2-鄰二氯苯)，將頂空小瓶置于60 ℃的水浴中平衡20 min。使用50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取纖維頭，萃取時(shí)間為30 min。在使用之前，萃取纖維頭需在氣相色譜儀上預(yù)處理老化30 min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，使得萃取纖維頭上無殘留其他氣味雜質(zhì)。

1.3.2氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)條件。采用安捷倫7890A氣相色譜儀和5975C質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用。色譜柱采用HP-Innowax和DB-5分析熔融石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件：進(jìn)樣模式為不分流模式，進(jìn)樣品解吸時(shí)間為3 min，進(jìn)樣口解吸溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，恒流量為1 mL/min，溶劑延遲3 min；升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃保持 5 min，再以8 ℃/min升至200 ℃保持5 min，最后以3 ℃/min升至230 ℃保持3 min。質(zhì)譜條件：電子電離能為70 ev；離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍為30～450m/z。

1.3.3氣相色譜-嗅聞儀(GC-O)條件及評(píng)價(jià)方法。采用安捷倫7890A氣相色譜儀配置嗅聞儀，在嗅聞口對(duì)樣品進(jìn)行嗅聞?dòng)涗?。氣相色譜條件同“1.3.2”，載氣恒流量為 2 mL/min，氣相色譜流出物以1∶1的比例分別流向質(zhì)譜儀和嗅聞口。嗅聞試驗(yàn)由10名訓(xùn)練有素的專業(yè)成員(6名女性和4名男性)進(jìn)行。每次嗅聞時(shí)間為50 min，并記錄嗅聞到的香氣物質(zhì)的香氣特征、香氣強(qiáng)度和香氣頻率。強(qiáng)度計(jì)算為所有小組成員記錄的平均得分。氣味強(qiáng)度按0～10分線性強(qiáng)度等級(jí)評(píng)定，0表示化合物無氣味，5表示中等強(qiáng)度，10表示極強(qiáng)氣味。

1.3.4感官評(píng)價(jià)。根據(jù)ISO 8589—2007的指導(dǎo)原則和條件，在感官實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官分析的方法采用一般描述性分析。第一步，在50 mL感官杯中制備5 g柚子花樣品，由10名成員(4名男性和6名女性)組成的訓(xùn)練有素的感官評(píng)價(jià)小組對(duì)柚子花的香氣進(jìn)行嗅聞和討論。第二步，通過嗅聞和討論達(dá)成的初步共識(shí)(每次2 h)，小組成員就柚子花的香氣描述詞達(dá)成一致(甜香、果香、花香、脂肪香、青香、木香)。每個(gè)感官描述詞通過對(duì)以下參考化合物的嗅聞被準(zhǔn)確定義：石竹烯表示“甜香”的香氣，右旋萜二烯表示“果香”的香氣，芳樟醇表示“花香”的香氣，己醛表示“脂肪香”的香氣，正己醇代表“青香”的香氣，β-蒎烯代表“木香”的香氣。從0(感知不到)到3.0、4.0、5.0(香氣適中)，再到10.0(可非常強(qiáng)烈感知)的0～10線性標(biāo)度對(duì)應(yīng)香氣嗅聞強(qiáng)度。每個(gè)樣品的感官評(píng)定試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值。

1.3.5柚子花揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性。 通過在NIST數(shù)據(jù)庫中匹配真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間、保留指數(shù)(RI)和質(zhì)譜來鑒定化合物。未知化合物的RI由C7～C30正構(gòu)烷烴測(cè)定，計(jì)算公式如下[14]：

式中，tx代表揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留時(shí)間；tz代表與風(fēng)味物質(zhì)具有相同碳原子數(shù)的烷烴的保留時(shí)間；Z表示該風(fēng)味化合物的碳原子數(shù)。

1.3.6柚子花揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定量。以10 μL的100 mg/L的鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的含量。計(jì)算公式如下[14]：

C=C0×V0×Ax/M×A0

式中，C0為內(nèi)標(biāo)物濃度(mol/L)；V0為內(nèi)標(biāo)物體積(μL)；Ax為揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；M為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.7柚子花香氣活力值(OAV)的計(jì)算。利用嗅覺活性值的公式計(jì)算柚子花香氣活力值(OAV)，即OAV=C/T，其中C代表化合物的濃度；T代表該化合物在空氣中的嗅覺閾值，嗅覺閾值來自文獻(xiàn)參考[14]。OAV>1表明該化合物對(duì)香氣有直接影響。一般認(rèn)為，OAV值越高的揮發(fā)性化合物對(duì)柚子花香氣的貢獻(xiàn)越大。

1.4 數(shù)據(jù)處理揮發(fā)性成分種類圖和風(fēng)味雷達(dá)圖采用Excel 2020制作。采用SPSS 22軟件對(duì)檢測(cè)的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚子花揮發(fā)性成分組分分析大樹與小樹柚子花的揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖1，兩者出峰總體趨勢(shì)較為一致，且分離效果較好。

圖1 大樹(a)和小樹(b)柚子花的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of pomelo flowers of big tree(a)and small tree(b)

采用雙柱定性法和相對(duì)內(nèi)標(biāo)法對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，共鑒定出44種風(fēng)味物質(zhì)，其中大樹37種，小樹29種，大樹和小樹共同鑒定出的風(fēng)味物質(zhì)22種。在2種柚子花鑒定到的風(fēng)味物質(zhì)共可分為8個(gè)化合物種類(醛類、酯類、烯烴類、醇類、酮類、酚類、酸類、其他)。

表1 2種不同樹齡的柚子花的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 1 Volatile flavor compounds in two pomelo flowers of different ages

醛類中，己醛、香茅醛、苯甲醛等提供青香和果香的風(fēng)味物質(zhì)含量較高，乙醛僅在小樹柚子花中被檢測(cè)到，更富有果香的檸檬醛在大樹柚子中被檢測(cè)到，且相對(duì)含量較高。對(duì)于酯類物質(zhì)，大樹柚子中的酯類物質(zhì)含量和種類數(shù)都相對(duì)較高，主要體現(xiàn)在乙酸香葉酯、丁酸乙酯、苯甲酸甲酯和乙酸橙花酯，這幾種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要香氣特征是略帶花香的果香，即花果香。對(duì)于烯烴類的化合物，大樹和小樹的風(fēng)味物質(zhì)種類是相同的，其中，蒎烯和月桂烯閾值相對(duì)較低，且在大樹柚子花中相對(duì)含量較高，會(huì)對(duì)大樹柚子柑橘類的果香屬性貢獻(xiàn)較大。綜上3個(gè)種類的風(fēng)味物質(zhì)看來，大樹柚子的風(fēng)味特征相對(duì)小樹柚子來說，其果香和花香的特征香氣更突出一些。對(duì)于總體占比含量較高的醇類物質(zhì)來說，大樹柚子的相對(duì)含量也高于小樹柚子，如葉醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇、苯乙醇等。對(duì)于酮類物質(zhì)，小樹柚子的酮類物質(zhì)的種類數(shù)和相對(duì)含量略高于大樹柚子，而酮類物質(zhì)在香氣特征上主要是提供甜香。對(duì)于酸類物質(zhì)，大樹柚子和小樹柚子的種類和相對(duì)含量較為相近，故在該香氣分路上差異不大。大樹柚子在其他類的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)上有一定的優(yōu)勢(shì)。綜上所述，大樹柚子風(fēng)味中，提供花香、果香、青香的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類和相對(duì)含量上有一定的優(yōu)勢(shì)，小樹柚子中提供甜香的酮類物質(zhì)種類和相對(duì)含量的優(yōu)勢(shì)較高；大樹柚子的風(fēng)味更為豐富多元些。

有研究表明，在植物種植期，前3年個(gè)體開花量較少，隨著樹齡的增長(zhǎng)，花的產(chǎn)量呈冪函數(shù)關(guān)系，且在11年左右達(dá)到穩(wěn)定[15]；其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與香氣活性物質(zhì)的積累也隨樹齡的增長(zhǎng)而不斷累積，使其香氣豐富度有所增強(qiáng)。在這生長(zhǎng)過程中，吲哚乙酸、脫落酸、玉米素赤霉素等內(nèi)源激素含量的變化起著重要的作用[16]。在開花后，不僅果實(shí)的產(chǎn)量會(huì)隨著樹齡而增長(zhǎng)[17]，果實(shí)的質(zhì)量也會(huì)受到樹齡的影響，在果酒釀造過程中，由于單株樹木單寧含量的自然變化程度是不同的，所以其對(duì)最終風(fēng)味有較大的影響[18]。綜上，大樹柚子風(fēng)味較為豐富多元，被認(rèn)為是10年樹齡的柚子樹在可溶性固形物含量、固酸比和VC含量累積的結(jié)果[19]。小樹柚子花由于樹齡較小，故風(fēng)味相對(duì)單一?？赡苁怯捎谛滂肿由L(zhǎng)期間，除了產(chǎn)生脂肪族、 支鏈或芳香族的醇類、醛類、羰基化合物、酸類和酯類的氨基酸代謝途徑，其脂氧合酶在脂肪酸代謝途徑中也較為旺盛[20]。

續(xù)表1

2.2 柚子花揮發(fā)性成分種類分析大樹及小樹柚子花揮發(fā)性成分種類的占比見圖2，共分為8類，這8類共同構(gòu)成了柚子花的香氣特征，其中烯烴類和醇類含量較高，約占總體風(fēng)味成分的95%以上，其余的酯類、酮類、醛類、酸類、酚類等所占比例相對(duì)較少。

圖2 2種柚子花揮發(fā)性化合物種類及占總體化合物的百分比Fig.2 Types of volatile compounds from two pemelo flowers and their in the total compounds

2.3 2種柚子花GC-O嗅聞試驗(yàn)用頂空固相微萃取(HS-SPME)對(duì)2種柚子花的香氣物質(zhì)進(jìn)行了萃取吸附，并用氣相色譜-嗅聞(GC-O)進(jìn)行了嗅聞描述，結(jié)果見表2，從大樹和小樹柚子花中分別嗅聞鑒定出37和28種氣味活性物質(zhì)。通過計(jì)算的保留指數(shù)(RIs)、香氣描述和質(zhì)譜鑒定3種方式對(duì)2個(gè)樣品中的香氣物質(zhì)進(jìn)行鑒定。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香氣強(qiáng)度(AIs)大樹柚子花為1.2～9.6，小樹柚子花為1.1～9.4。

表2 GC-O嗅聞結(jié)果Table 2 GC-O smell results

續(xù)表2

2.4 2種柚子花感官評(píng)價(jià)由不同樹齡柚子花感官評(píng)分得分(表3)得到2種柚子花的風(fēng)味感官輪廓圖(圖3)。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，大樹柚子花的花香和果香更為突出，青香也比小樹柚子花得分高，而小樹柚子花則在甜香的香韻結(jié)果評(píng)分較高。

表3 不同樹齡柚子花感官評(píng)價(jià)得分Table 3 Sensory evaluation scores of pomelo flowers at different ages

圖3 不同樹齡柚子花感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.3 Radar chart for sensory evaluation of pomelo flowers at different tree ages

2.5 柚子花揮發(fā)性物質(zhì)的OAV分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)柚子花風(fēng)味的貢獻(xiàn)主要受到不同風(fēng)味物質(zhì)閾值的影響。閾值作為香氣化合物能夠被嗅聞到的最低濃度，化合物濃度與其比值得到的OAV值成為表明香氣貢獻(xiàn)程度的主要指標(biāo)。該研究選取OAV值大于1的物質(zhì)(被認(rèn)為香氣貢獻(xiàn)值較大)，共10種，其中醇類3種、烯烴類6種、醛類1種，主要為芳樟醇、月桂烯、右旋萜二烯、蒎烯、β-羅勒烯、香葉醇、石竹烯、己醛、β-蒎烯、正己醇，見表4。除石竹烯和右旋萜二烯外，其他8種OAV值大于1的物質(zhì)均在大樹柚子花中OAV值更高，香氣活力值更大。右旋萜二烯主要在柚子花中貢獻(xiàn)出柑橘屬性的果香以及花香，而石竹烯在濃度較低的情況下其主要風(fēng)味特征為帶有香蕉樣的甜香。這與人工感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致。

表4 柚子花中OAV值大于1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Volatile flavor compounds with OAV value greater than 1 in pomelo flowers

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS的方法從上海青浦4月的大樹和小樹柚子花中共鑒定到44種風(fēng)味物質(zhì)，其中大樹37種，小樹29種，大樹和小樹共同鑒定出的風(fēng)味物質(zhì)22種，香氣貢獻(xiàn)值較大的風(fēng)味物質(zhì)10種，均為大樹和小樹共有的。綜合分析香氣貢獻(xiàn)值較大物質(zhì)的OAV值以及各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)，大樹和小樹的香氣特征總體差異不大，相對(duì)而言，大樹柚子花的風(fēng)味特征更偏向花香和果香多一些，且香氣特征更為多元豐富，小樹柚子花的香氣特征總體比大樹柚子花甜香多一些。該研究初步明確了一種上海青浦4月大樹柚子花和小樹柚子花的揮發(fā)性香氣成分與關(guān)鍵呈香物質(zhì)，后續(xù)將進(jìn)一步使用分子感官科學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合解析柚子花的特征風(fēng)味物質(zhì)及其香氣前體物質(zhì)，也將為柚子花風(fēng)味的開發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。