中老年食蟹猴尿液參考指標測定與比較

邱名寅，呂海洲，周和麗,勞林芳，陳 珠，田朝陽

(1.海南金港生物技術股份有限公司,海南?？?571100；2.海南大學生物醫(yī)學工程學院/海南省生物醫(yī)學工程重點實驗室，海南?？?570228；3.海南大學全健康研究院，海南海口 570228)

由于非人靈長類動物(non-human primates，NHPs)具有與人類極其相似的遺傳、生理和行為特征[1]，與其他動物如嚙齒類、犬和豬相比，非人靈長類動物在解剖學、生理學和內(nèi)分泌學等方面的結果更可靠，因而在聯(lián)系基礎研究和臨床應用方面發(fā)揮重要作用，已成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中理想的模式動物。其中，同為舊大陸猴和獼猴屬動物的食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)是生物醫(yī)學研究中使用最為廣泛的2種非人靈長類動物[2]，尤以食蟹猴占主導地位。近年來，我國的實驗猴養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)有了飛速發(fā)展，已成為全球?qū)嶒灪锏淖畲笊a(chǎn)供應國。據(jù)中國實驗靈長類養(yǎng)殖開發(fā)協(xié)會(CLPA)2021年統(tǒng)計，全國實驗猴養(yǎng)殖企業(yè)60余家，實驗猴總存欄量23萬余只。

由于受新冠(COVID-19)疫情全球大流行、新冠防控疫苗及藥物臨床前動物試驗研究需求增加、中國腦計劃等重大基礎研究項目的啟動和禁止從國外進口食蟹猴種源等多重因素的影響，我國目前存欄的食蟹猴已逐步邁入中老年階段(年齡≥10歲為中年猴；年齡>15歲為老年猴)[3]，普遍出現(xiàn)了種群繁殖率和出生率偏低、供需矛盾緊張和銷售價格不斷攀升的“一猴難求”的共性問題[4]，給整個醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展帶來了深遠影響，已引起業(yè)界和管理部門的高度重視。但這些中老年食蟹猴也為人類衰老相關的慢性疾病研究所急需的自發(fā)性食蟹猴動物疾病模型(如糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病腎病等)的篩查與分析提供了豐富的寶貴資源庫，實驗猴養(yǎng)殖企業(yè)迎來了快速發(fā)展和轉(zhuǎn)型升級的絕佳機遇期。

因此，建立中老年食蟹猴常規(guī)的尿液指標背景數(shù)據(jù)，不僅對其篩查與分析應用提供重要的參考價值，也為標準化的非人靈長類實驗動物生產(chǎn)管理和日常疾病的檢測與診斷發(fā)揮日益重要的作用。筆者對100只10～20歲的食蟹猴的體重和尿肌酐、24 h尿液量、尿微量白蛋白、24 h尿微量白蛋白和尿液微量白蛋白與肌酐比值等尿液指標進行了全面系統(tǒng)的測定，并進行了性別間的比較，為中老年食蟹猴資源在生物醫(yī)學領域的開發(fā)與推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料普通級食蟹猴100只，雄性21只，雌性79只。年齡10～20歲；動物生產(chǎn)單位為海南金港生物技術股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(瓊)2020-0001]。動物均飼養(yǎng)于海南金港生物技術股份有限公司普通級動物實驗室[SYXK(瓊)2019-0017]，飼養(yǎng)條件為12 h/12 h晝夜周期，相對濕度40%～70%，溫度20～26 ℃，不銹鋼代謝單籠飼養(yǎng)，飼喂全價膨化飼料，動物飲水瓶自由飲水。動物實驗方案經(jīng)海南金港生物技術股份有限公司實驗動物使用和管理委員會(IACUC)批準。

1.2 測定項目與方法

1.2.1體重(body weight，BW)。動物空腹時間>16 h，08:00—10:00稱重，稱重前肌注鹽酸氯胺酮(0.1 mL/kg)進行麻醉，采用電子嬰兒秤進行稱量并逐一記錄。

1.2.2尿液指標(urine index)。將100只待檢動物分批放入不銹鋼代謝單籠內(nèi)飼養(yǎng)用于收集24 h尿液，尿液收集方法為在代謝單籠底部固定紗布用于尿液過濾和糞尿分離，玻璃燒杯放置在代謝籠底部用于收集尿液，并用加裝有冰袋的泡沫盒對玻璃燒杯進行冷藏保溫。24 h尿液收集完畢后測定24 h 尿液量(24-hour urine volume,24 h-UV)，然后取出部分尿液離心(離心力3 000 r/min，4 ℃離心10 min),取尿液上清，應用日本東芝120全自動生化儀及上?？迫A檢測試劑盒進行尿肌酐(Urine creatinine，UC)指標檢測和美國貝克曼庫爾特IMMAGE特定蛋白分析儀及配套試劑進行尿微量白蛋白(Urine microalbumin，UM)指標檢測，并用24 h-UV和UM相乘后換算得出24 h尿微量白蛋白(24-hour urine microalbumin，24 h-mAlb)，用UM和UC相除后換算得出尿液微量白蛋白與肌酐比值(microalbumin-creatinine ratio，ACR)。

1.3 數(shù)據(jù)處理應用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，結果以Mean±SD表示，采用t檢驗統(tǒng)計方法，比較各測定指標雌雄間差異，顯著性差異水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 體重指標雌、雄性動物的體重指標(BW)差異極顯著(P<0.01)，雄性顯著高于雌性(表1)。

2.2 尿液指標雌性動物的尿肌酐(UC)與雄性動物相比差異顯著(P<0.05)，雌性動物24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白與肌酐比值(ACR)與雄性動物相比差異不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 中老年食蟹猴體重和尿液指標Table 1 The body weight and urine index of 100 middle and old-aged cynomolgus monkeys (mean±SD)

3 結論與討論

在生物醫(yī)學研究中，動物參考值在評價臨床前發(fā)現(xiàn)和選擇健康受試動物方面起著至關重要的作用[5]。包括食蟹猴在內(nèi)的所有實驗動物的臨床生理生化指標是重要的試驗基礎數(shù)據(jù)，而且實驗動物的正常血常規(guī)參考值、血液生化參考值是病理學、毒理學以及新藥安全性評價研究等選擇實驗動物的重要依據(jù)之一[6-7]。尿液指標也是重要的試驗基礎數(shù)據(jù)，有助于發(fā)現(xiàn)很多已經(jīng)出現(xiàn)或者仍隱匿的機體健康問題，具有重要的臨床意義與價值。但有關中老年食蟹猴(>10歲)的尿液指標的參考值鮮見報道。

該研究測得的中老年食蟹猴(10～20歲)體重指標(BW)表現(xiàn)出極顯著性別差異。結合李冰[8]和Choi等[5]的研究結果，隨著年齡的增長食蟹猴雌雄間體重差異會越來越顯著。這就提示在做試驗方案設計時注意不同年齡段雌雄動物間體重指標的差異問題。

尿液指標檢測分析對于非人靈長類動物的自發(fā)型疾病模型篩選至關重要，但限于動物的習性，采集非人靈長類動物隨機尿(Spot urine)樣本顯得較為困難，通常的做法是采用代謝籠進行一段時間的尿液收集，將動物排泄的尿液和糞便分離，但收集過程易受到糞便、飲水等因素的影響而波動較大。所以考慮收集24 h尿液量并做定量分析來減少上述因素的干擾，以期最大限度地發(fā)揮尿液指標在相關研究中的參考價值。

該研究測得的中老年食蟹猴的24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白量(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白與肌酐比值(ACR)雌雄間均無顯著差異，尿肌酐(UC)指標雄性顯著高于雌性。研究表明，通常在機體健康的情況下，僅有少量白蛋白可通過尿液排出體外，尿液檢驗通常可見少量尿微量白蛋白。一旦腎功能發(fā)生損傷，腎小球基底膜通透性增高，經(jīng)尿液排出體外的白蛋白量將顯著提升，致使尿微量白蛋白指標升高[9]。

微量白蛋白可作為糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)發(fā)生的早期指標，廣泛應用于糖尿病腎病的早期診斷和判斷病情的發(fā)展。朱華等[10]研究表明，尿微量白蛋白在糖尿病腎病的診斷與分期中沿用已久，但不同計算方法的結果正常值范圍有明顯差異，尤以1 L結果報告時，由于受尿量影響較大，正常范圍較寬，易使部分異常標本落入正常范圍而延誤診斷。為此，該試驗在研究過程中，通過收集24 h尿液量和測定尿微量白蛋白，進而測算出24 h尿微量白蛋白量。Gross等[11]根據(jù)尿白蛋白的排出量分為微量白蛋白尿(Microalbuminuria，MAU)和大量白蛋白尿(Macroalbuminuria，CAU)。美國糖尿病協(xié)會(ADA)推薦的MAU的診斷參考標準：300 mg>24 h-mAlb≥30 mg 或300 mg/g >ACR≥ 30 mg/g，CAU或明顯腎病診斷參考標準：24 h-mAlb≥300 mg 或ACR≥300 mg/g[12]。該研究也在100只食蟹猴中發(fā)現(xiàn)了3只(2公和 1母)符合上述診斷標準的動物，是否為糖尿病腎病動物模型還需做進一步的病理分析。因此，該研究為非人靈長類動物自發(fā)型代謝性疾病模型的篩選分析提供了初步的尿液指標參考值。

此外，日趨嚴重的人口老齡化問題急需開展生物醫(yī)學基礎研究，以便更好地了解生物衰老以及特定年齡相關疾病和狀況的生物學機制和治療策略[1]。自然衰老的中老年食蟹猴也會發(fā)生類似于人類的與年齡相關的疾病，且表現(xiàn)出相似的個體間變異性[13]，在疾病特征和發(fā)生發(fā)展機制方面能較全面反映人類衰老情況[14]，因此是研究衰老機制及臨床轉(zhuǎn)化所必不可少的動物模型[15]。該研究為中老年食蟹猴動物疾病模型的挖掘和開發(fā)利用提供了較為基礎的尿液指標背景資料。