復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌、青枯雷爾氏菌的抑菌對(duì)比研究

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2023.05.013

收稿日期：2023-06-12

基金項(xiàng)目：廈門市科技局資助項(xiàng)目（3502Z20226016）；福建省科技廳STS計(jì)劃配套項(xiàng)目（2023T3021）

作者簡(jiǎn)介：劉泉林（1988-），男，農(nóng)藝師，主要從事園林養(yǎng)護(hù)與管理工作，E-mail：1253352667@qq.com

摘要要：【目的】對(duì)比復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌、青枯雷爾氏菌的抑菌效果，為開(kāi)展有效防治植物的靈芝根腐病和青枯病提供參考。【方法】從鳳凰木上分離獲得2株靈芝菌，購(gòu)買青枯雷爾氏菌，分別在PDA、SPA培養(yǎng)基上加入復(fù)合微生物菌劑進(jìn)行培養(yǎng)，以無(wú)復(fù)合微生物菌劑培養(yǎng)的菌株為對(duì)照，觀察抑菌效果?！窘Y(jié)果】復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌的抑菌圈直徑為0.50和0.67 cm，平均抑菌率為97.69%，對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑為2.50、2.70和2.90cm，平均抑菌率為30.00%?！窘Y(jié)論】復(fù)合微生物菌劑對(duì)真菌類的鳳凰木根腐病靈芝菌抑菌率在95.37%～100.00%，生防效果好；對(duì)細(xì)菌類的青枯雷爾氏菌的抑制作用差。

關(guān)鍵詞：鳳凰木；復(fù)合微生物菌劑；靈芝菌；青枯雷爾氏菌；抑菌率

中圖分類號(hào)：S144.1；S567.31? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2095-5774（2023）05-0381-04

A Comparative Study on Bacteriostasis of Compound Microbial Agents against

Ganoderma lucidum and Ralstonia solanacearum

Liu Quanlin

（Xiamen Jimei Gardening and Landscaping Co.，Ltd.，Xiamen Muhicipal Group，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021，China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to compare the bacteriostatic effects of compound microbial agents on Ganoderma lucidum and Ralstonia solanacearum in order to provide references for their effective control. 【Method】Two strains of Ganoderma lucidum were isolated from Delonix regia. Ralstonia Solanacearum was cultured on PDA and SPA media，respectively，with the addition of the compound microbial agent，and the strains cultured without the compound microbial agent were used as the control to observe the comparative bacteriostasis effect.【Result】The average diameter of inhibition zone of compound microbial agents against Ganoderma lucidum was 0.50 cm and 0.67 cm，respectively. The average bacteriostatic rate was 97.69%. The average diameter of inhibition zone of compound microbial agents against Ralstonia solanacearum was 2.50 cm，2.70 cm and 2.90 cm，respectively. The bacteriostatic rate was 30.00%.【Conclusion】The bacteriostatic rate of the compound microbial agent against the root rot of Ganoderma lucidum was 95.37%-100.00%. The bacteriostatic effect of the compound microbial agent was good against Ganoderma lucidum and not good against Ralstonia solanacearum.

Key words： Delonix regia；Compound microbial agent；Ganoderma lucidum；Ralstonia solanacearum；Bacteriostatic rate

復(fù)合微生物菌劑的核心菌群主要包括芽孢桿菌等有益菌群，在逆境中對(duì)維持植物和土壤健康起著重要作用，因而被用來(lái)代替化學(xué)農(nóng)藥成為城市園林植物病蟲(chóng)害防治的熱點(diǎn)方向。復(fù)合微生物菌劑施加后對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的改善體現(xiàn)在三個(gè)方面，一是可以增強(qiáng)植物對(duì)土壤中磷元素的吸收、利用、轉(zhuǎn)化；二是可以提高土壤中功能酶的活性，將養(yǎng)分轉(zhuǎn)換為更易被植物吸收的形態(tài)；三是能抑制土壤中病原菌的活性［1］。

鳳凰木（Delonix regia）根腐病的病原腐菌屬靈芝菌是一種弱寄生真菌，常以菌絲體或厚壁孢子在病殘?bào)w或土壤中越冬，分生孢子通過(guò)雨水、灌溉水或土壤耕作傳播［2］，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道常見(jiàn)的有4種，靈芝（Ganoderma lucidum）、熱帶靈芝（Ganoderma tropicum）、南方靈芝（Ganoderma australe）、韋伯氏靈芝（Ganoderma weberianum）。靈芝菌子實(shí)體大型，高8～12 cm，1 a生，木栓質(zhì)至木質(zhì)，一般在高溫多雨的7-9月出現(xiàn)，往往是多個(gè)子實(shí)體同時(shí)長(zhǎng)出，其傳播途徑主要是子實(shí)體釋放的擔(dān)子孢子借由土壤、水或風(fēng)進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，遇到樹(shù)木根頸部或根部的傷口即行侵染；近距離傳播則是由林木根際之間的相互接觸，由病根上的菌絲體傳至健康株的根部，并繁殖形成新的侵染。靈芝根腐病的發(fā)生不是突發(fā)性的，而是經(jīng)過(guò)侵染2～3 a甚至5～6 a后，才逐漸表現(xiàn)出癥狀。在鳳凰木的靈芝根腐病發(fā)病初期，林木生長(zhǎng)緩慢，樹(shù)冠稀疏，并呈現(xiàn)出黃化現(xiàn)象；待到病害中期，鳳凰木的生長(zhǎng)幾乎停滯，葉片大量脫落，樹(shù)冠稀疏更加明顯，此時(shí)常能發(fā)現(xiàn)有白色菌絲或赤褐色的子實(shí)體生長(zhǎng)在病株的地際部，或是在露出地表的根部，從病根的細(xì)根到粗根的表面都布滿了菌絲體，呈現(xiàn)為蜘蛛網(wǎng)狀、扇狀、氈狀等，且組織腐朽，材部組織也長(zhǎng)有菌絲體；在靈芝根腐病的病害末期，立木會(huì)萎枯死亡，地際部的根長(zhǎng)出許多子實(shí)體。另外也有可能是二孢假芝（Amauroderma subresinosum）造成的根腐?。?］。青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是一種土傳植物病原細(xì)菌，會(huì)引發(fā)植物青枯病，被認(rèn)為是植物上最具破壞性的病原細(xì)菌，可侵染250多個(gè)物種，包括番茄、馬鈴薯、煙草、香蕉、辣椒、茄子等在內(nèi)的多種重要農(nóng)作物，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。由于施用復(fù)合微生物菌劑對(duì)真菌和細(xì)菌作用可能存在差異，為探明其抑菌效果，本文以復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌和青枯雷爾氏菌開(kāi)展離體試驗(yàn)研究，觀察對(duì)比二者的抑菌和生防效果，以期制定防治方案，為有效防治植物的靈芝根腐病和青枯病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)所用的靈芝菌是通過(guò)采集鳳凰木上的靈芝菌子實(shí)體，經(jīng)分離培養(yǎng)獲得；青枯雷爾氏菌購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（https：//cgmcc.net）；云集合益植得寶復(fù)合微生物菌劑購(gòu)買于廈門云創(chuàng)生物科技有限公司（https：//flbook.com.cn/c/9ndepkpPTe#page/ 16），含有紫紅曲霉（Monascus purpureus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等活菌。

1.1.1靈芝菌采集

2022年3月在廈門市集美區(qū)道路兩旁，從已露出地表的鳳凰木根腐病的病根（封三? 圖2）上采集靈芝菌子實(shí)體（封三? 圖3）。

1.1.2靈芝菌分離培養(yǎng)

1.1.2.1配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基

將去皮馬鈴薯200 g切成小塊，用600 mL蒸餾水大火煮開(kāi)，小火煮約20 min，兩層紗布過(guò)濾，去渣，加入葡萄糖20 g、瓊脂17 g，加水定容至1 L，pH自然，高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后，冷卻至60℃左右，每20 mL培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾的50 mg/mL氨芐青霉素溶液20 μL。

1.1.2.2分離純化

先將成熟的靈芝菌子實(shí)體表面用70%酒精擦拭消毒，然后將其撕開(kāi)，從內(nèi)層解剖刀切取0.5 mm大小的內(nèi)層幼嫩組織，置于PDA平板中心，在30℃黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d，待擔(dān)孢子長(zhǎng)出白色菌絲后，挑取單個(gè)擔(dān)孢子長(zhǎng)出的生長(zhǎng)旺盛健壯、無(wú)雜菌污染的菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)換培養(yǎng)，再不斷選優(yōu)純化后保存。

1.1.2.3菌種保藏

將分離純化后的靈芝菌菌株液體培養(yǎng)基（不含瓊脂的PDA培養(yǎng)基）經(jīng)搖床培養(yǎng)成菌絲球后，轉(zhuǎn)入2 mL凍存管，將液體培養(yǎng)基與滅菌后的甘油按12渦旋混勻，封口后貼標(biāo)簽置于-20 ℃冰箱保藏。使用前在PDA培養(yǎng)基上活化備用。所有器材均為事先經(jīng)高溫滅菌。

1.2離體培養(yǎng)

將靈芝菌（LZ1和LZ2菌株）和青枯雷爾氏菌分別置于PDA、胰蛋白胨蔗糖（SPA）培養(yǎng)基（液/固）上進(jìn)行離體培養(yǎng)，待得到液態(tài)菌絲體后，再開(kāi)展離體試驗(yàn)觀測(cè)。其中SPA液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，蔗糖20 g，K2HPO4? 0.5 g，MgSO4? 0.25 g，加水定容至1L，121℃高溫滅菌備用；另備各材料加水定容至1 L后加入15 g瓊脂，121℃高溫滅菌備用，則為SPA固體培養(yǎng)基。

1.3 抑制靈芝菌試驗(yàn)

1.3.1培養(yǎng)基制備

稱取0.2 g復(fù)合微生物菌劑，直接加入100 mL

PDA培養(yǎng)基中，制成處理組培養(yǎng)基；以不加復(fù)合微生物菌劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組。每種處理3組重復(fù)（處理1、2、3）。

1.3.2抑菌處理

從生長(zhǎng)狀況良好的靈芝菌菌株的菌落邊緣取直徑0.5 cm的菌餅，置于上述1.3.1制備的平板培養(yǎng)基中心位置。25℃黑暗培養(yǎng)4 d后，以十字交叉法測(cè)得菌落直徑［5］。計(jì)算靈芝菌抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.4 抑制青枯雷爾氏菌試驗(yàn)

1.4.1培養(yǎng)基與菌液制備

在100 mL液體SPA 培養(yǎng)基中加入20 μL青枯雷爾氏菌菌株樣品，28℃，150 rpm，過(guò)夜培養(yǎng)。稱取0.2 g復(fù)合微生物菌劑，直接加入100 mL SPA液體培養(yǎng)基中備用。用移液槍吸取過(guò)夜培養(yǎng)菌液測(cè)量OD600值，再定容到OD600=1.000，并按照每700 mL 培養(yǎng)基加10 mL菌液的比例，加入融化后適溫（50℃左右）的SPA固體培養(yǎng)基，再倒入平板中，制成菌液混合SPA培養(yǎng)基。在已凝固的培養(yǎng)基上做打洞處理。

1.4.2菌餅培養(yǎng)與數(shù)據(jù)處理

對(duì)照組為空白SPA培養(yǎng)基孔洞中加入50 μL復(fù)合微生物菌劑；菌液處理組為菌液混合SPA培養(yǎng)基的孔洞中加入50 μL空白 SPA 液體培養(yǎng)基；復(fù)合微生物菌劑處理組為菌液混合SPA培養(yǎng)基孔洞中加入50 μL復(fù)合微生物菌劑，3組重復(fù)處理（處理1、2、3），每組處理中設(shè)置3個(gè)孔洞（孔洞1、2、3）。

經(jīng)28℃黑暗培養(yǎng)3 d，十字交叉法測(cè)得菌落直

徑［6］。由于青枯菌的對(duì)比培養(yǎng)是在直徑9.00 cm的整個(gè)培養(yǎng)基中，所以根據(jù)抑菌圈占整個(gè)培養(yǎng)基的比例，計(jì)算青枯雷爾氏菌抑菌率（%）=抑菌圈直徑/培養(yǎng)基直徑×100%。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌的抑菌效果

對(duì)比試驗(yàn)處理可得，LZ1和LZ2在 PDA 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好（封三? 圖5）。由表1可見(jiàn)，培養(yǎng)4 d后，LZ1和LZ2的抑菌圈平均直徑分別為0.50、0.67 cm，而對(duì)照組的抑菌圈平均直徑是4.13、

4.18 cm，求得復(fù)合微生物菌劑對(duì)靈芝菌的平均抑菌率為97.69%，生防效果好。

2.2復(fù)合微生物菌劑對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制效果

經(jīng)28℃黑暗培養(yǎng)3 d后，青枯雷爾氏菌在SPA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好。復(fù)合微生物菌劑對(duì)于青枯菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用，其表現(xiàn)為在菌液混合培養(yǎng)基倒板中，孔洞周圍有一定的抑菌圈表現(xiàn)，且培養(yǎng)基顏色較淺。通過(guò)十字交叉法測(cè)得其抑菌圈平均直徑為2.50、2.70和2.90 cm（表2）。在對(duì)照處理組中，加入復(fù)合微生物菌劑處理的孔洞附近有一定的微生物生長(zhǎng)情況，可能為復(fù)合微生物菌劑中有益菌生長(zhǎng)產(chǎn)生（封三? 圖6）。

3 結(jié)論與討論

目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)“以菌抑菌”在重大植物疾病防治上采用的是普通微生物菌劑，其多為單一菌種或復(fù)配菌種，因?yàn)榭鼓嫘圆粡?qiáng)對(duì)環(huán)境適應(yīng)性有限、與有害菌的競(jìng)爭(zhēng)力不足等原因，而鮮有成功案例。復(fù)合微生物菌劑的應(yīng)用能夠提高土壤微生物群落多樣性，增加OTU 數(shù)量和Chao1、Shannon指

數(shù)［7，8］，從而改善根際微生物區(qū)系減低病害發(fā)生程度。本試驗(yàn)選用云集合益植得寶復(fù)合微生物菌劑分別對(duì)靈芝菌、青枯雷爾氏菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，效果對(duì)比結(jié)果表明，對(duì)真菌類的鳳凰木根腐病靈芝菌有較好的抑菌效果，抑菌率在95.37%～100.00%，生防效果好，而對(duì)細(xì)菌類的青枯雷爾氏菌的抑菌作用差。

在此研究基礎(chǔ)上，后續(xù)將繼續(xù)開(kāi)展盆栽試驗(yàn)，評(píng)估復(fù)合微生物菌劑和有機(jī)肥聯(lián)合施用對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響，試圖探明土壤微生物群落對(duì)復(fù)合微生物菌劑的響應(yīng)變化，尋求針對(duì)不同健康程度的鳳凰木靈芝根腐病解決方案，用于有效防治鳳凰木靈芝根腐病。

參考文獻(xiàn)：

［1］尹淑麗，張蕾，麻耀華. 復(fù)合微生態(tài)菌劑對(duì)連作黃瓜根際土壤微生物數(shù)量及酶活的影響研究//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)全國(guó)設(shè)施園藝與園藝作物標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)交流會(huì)［C］ . 2014.

［2］單金雪，李增平，張宇，等. 一種木麻黃靈芝莖腐病病原鑒定及生物學(xué)特性［J］.熱帶生物學(xué)報(bào). 2021，12（1）：88-95.

［3］蔡吉堂，林麗超，王開(kāi)輝，等. 靈芝侵染鳳凰木根腐病研究初報(bào)［J］. 中國(guó)森林病蟲(chóng)，2019，38（5）：28-31.

［4］吳如慧，李增平，程樂(lè)樂(lè)，等.臺(tái)灣相思假芝根腐病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性測(cè)定［J］.熱帶作物學(xué)報(bào). 2019，40（8）： 1590-1597.

［5］張陽(yáng)，劉重喜，王相晶，等. 微生物代謝產(chǎn)物在植物病害防治中的應(yīng)用［J］. 世界農(nóng)藥，2013，35（3）：34-40.

［6］王志丹，王樹(shù)桐，胡同樂(lè)，等. 柑橘青枯病的發(fā)生規(guī)律及防治措施［J］. 河北果樹(shù)，2018（1）：17-19.

［7］張志良，孔麗麗，王鵬. 微生物肥料的研究進(jìn)展及其應(yīng)用現(xiàn)狀［J］. 土壤通報(bào)，2019，50（4）：997-1003.

［8］王立華，王建玲，曾祥英. 微生物肥料的作用機(jī)制及應(yīng)用現(xiàn)狀研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（9）：17-21.

（責(zé)任編輯：許? ? 玲）