秦嶺特色藥用植物桃兒七內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的分離鑒定及生物活性研究

李 婷,趙 祥,潘會(huì)賓,王 懿,高吉仁

(商洛職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共課教學(xué)部，陜西 商洛726000)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle) Ying]是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬植物，主要分布在我國(guó)西北和西南地區(qū)[1]。作為傳統(tǒng)中藥材，桃兒七對(duì)血病、胎盤(pán)滯留及中風(fēng)等疾病具有顯著療效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，桃兒七根和莖中糖苷衍生物在睪丸癌、淋巴癌、白血病和小細(xì)胞肺癌治療中發(fā)揮著重要作用[3-4]，且其有效成分鬼臼毒素是合成抗癌藥物的前體物質(zhì)[5]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展及抗癌藥物需求量的增加，桃兒七的需求量也隨之增加，但桃兒七已被列入珍稀瀕危植物，因此，合理開(kāi)發(fā)其潛在的藥用價(jià)值具有重要意義。

植物內(nèi)生真菌[6]在植物生長(zhǎng)過(guò)程中具有促生、抗逆等積極作用，可幫助寄主植物合成次級(jí)代謝產(chǎn)物或完成代謝物的生物轉(zhuǎn)化[7]。內(nèi)生真菌長(zhǎng)期與寄主植物共存，可產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤及抗氧化等作用，是篩選活性物質(zhì)的潛在資源[8]。研究者[9-10]已從桃兒七根和莖中分離到了可產(chǎn)鬼臼毒素的內(nèi)生真菌，但真菌代謝產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)不能達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求，不利于菌種的擴(kuò)大篩選[11]。由于桃兒七植物不同產(chǎn)地、不同營(yíng)養(yǎng)器官中生物活性物質(zhì)的含量差異較大[12]，作者以秦嶺桃兒七內(nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌為研究對(duì)象，采用萃取法從菌絲中分離活性代謝產(chǎn)物，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生物活性進(jìn)行初步分析，為桃兒七內(nèi)生真菌活性藥用成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

桃兒七，采自陜西秦嶺山，海拔高度377.12 m。采樣時(shí)挑選無(wú)病害健康植株，取材部位為植物根、莖、葉。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基：200 g土豆，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 000 mL水。PDA液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

葡萄糖(分析純)、冰醋酸(色譜純)、丙酮(色譜純)、石油醚(色譜純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、乙酸乙酯(色譜純)，美國(guó)Sigma公司；甲醇(色譜純)，上海科旺化學(xué)試劑有限公司；Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠，Pharmacia公司；薄層色譜用硅膠，西安道生化工科技有限公司；200～300目色譜柱硅膠，青島海洋化工廠；(R)-(-)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯[(R)-MTPA]，Alfa Aesar 公司。

AM-400型核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；Auto-Spec3000型質(zhì)譜儀，英國(guó)VG公司；RP-18反相硅膠色譜柱，美國(guó)Merck公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2D型垂直流超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；iMark型酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 內(nèi)生真菌的分離及代謝產(chǎn)物提取

對(duì)桃兒七根、莖、葉表面消毒后，置于PDA固體培養(yǎng)基上，以組織塊法分離出內(nèi)生真菌，經(jīng)純化后得到煙色擬盤(pán)多毛孢菌。

將煙色擬盤(pán)多毛孢菌活化后接入PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)12 d，抽濾；菌絲用乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(80∶15∶5，體積比)浸提3次，合并提取液，經(jīng)乙酸乙酯萃取后得浸膏。以RP-18反相硅膠色譜柱處理浸膏，采用水及體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、100%丙酮梯度洗脫，采用薄層色譜法(TLC)和反復(fù)硅膠柱色譜(洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯)分離得到10個(gè)單體化合物，分別標(biāo)記為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10。

1.3 化合物的Mosher酯制備及表征

分別將化合物1-1、1-2、1-3和1-4分為 2 部分，用無(wú)水吡啶溶解后加入10 μL 的(R)-MTPA，于30 ℃下攪拌12 h，蒸干有機(jī)溶劑，以Sephadex LH-20凝膠柱純化產(chǎn)物，通過(guò)氘代甲醇(CD3OD)核磁共振(NMR)和異核單量子關(guān)系(HSQC)確定仲醇羥基的β-、γ-和δ-位的各個(gè)質(zhì)子的化學(xué)位移變化，確定化合物的絕對(duì)構(gòu)型[13]。

1.4 化合物的細(xì)胞毒活性檢測(cè)

以依托泊苷為陽(yáng)性對(duì)照，參照El-Sayed等[14]方法，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) 比色法檢測(cè)化合物1-1～1-10對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒活性。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、HeLa和HepG2細(xì)胞懸液分別接種于96孔板中，37 ℃下培養(yǎng)1 d，加入經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)稀釋的化合物溶液，每個(gè)化合物做3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，取出，加入MTT培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，測(cè)定570 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率(R，%)：

(1)

式中：Ae為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Ab為空白組的吸光度；Ac為對(duì)照組的吸光度。

1.5 乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測(cè)

參照dos Santos等[15]方法，采用Ellman光度法檢測(cè)乙酰膽堿酯酶抑制活性。將150 μL濃度為0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH值8.04)加入96孔板中，依次加入30 μL化合物溶液、50 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(756 μmol·L-1)、20 μL稀釋后的乙酰膽堿酯酶溶液(0.54 U·mL-1)；以加蘭他敏作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照?；靹蚝笾糜?7 ℃培養(yǎng)箱孵育5 min，加入50 μL底物碘化硫代乙酰膽堿(3 mmol·L-1)，用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測(cè)動(dòng)力學(xué)速率，按式(2)計(jì)算抑制率(R，%):

(2)

式中:Ke、Kp、Kn分別為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組的動(dòng)力學(xué)速率。

由于抑制率與濃度之間存在一定的線性關(guān)系，通過(guò)回歸方程計(jì)算IC50值，并依據(jù)IC50值評(píng)價(jià)乙酰膽堿酯酶的抑制活性。

1.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[16]方法并作適當(dāng)修改。將99 μL濃度為 67 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液(pH值 6.8)加入96孔板中，加入DMSO稀釋的不同濃度(1.0 mmol·L-1、0.5 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1)化合物溶液1 μL，然后加入25 μL α-葡萄糖苷酶(0.4 U·mL-1)，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min；取出，加入25 μL底物對(duì)硝基苯酚、α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)(5.0 mmol·L-1)，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min；加入50 μL Na2CO3溶液(0.2 mol·L-1)終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm處吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，并計(jì)算半抑制濃度(IC50)。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)體系總體積為200 μL。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1-1的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.1 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-1 in CD3OD

化合物1-1的分子式為C17H22O6(計(jì)算值為345.130 8；不飽和度為7)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-1含有4個(gè)甲基[δH2.10(3H,s,OAc-17)，1.47(3H,s,CH3-13)，1.32(3H,s,CH3-14)，0.97(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15)；δC20.61(q,C-17)，11.20(q,CH3-13)，22.46(q,CH3-14)，10.30(q,CH3-15)]；2個(gè)亞甲基[δH3.79(1H,d,J=9.8 Hz,H-12)，3.71(1H,dd,J=9.3 Hz、4.7 Hz,H-12a)，2.25(1H,d,J=13.2 Hz,H-6)，1.52(1H,d,J=13.2 Hz,H-6a)；δC71.18(t,C-12)，34.96(t,C-6)]；5個(gè)次甲基[δH6.38(1H,s,H-9)，5.14(1H,t,J=5.2 Hz,H-3)，3.72(1H,dd,J=9.3 Hz、4.7 Hz,H-2)，3.63(1H,d,J=3.8 Hz,H-1)，1.80(1H,dd,J=7.0 Hz、5.7 Hz,H-4)；δC125.29(d,C-9)，72.84(d,C-3)，54.83(d,C-2)，58.97(d,C-1),45.41(d,C-4)]；1個(gè)羰基碳[δC172.35(s,C-16)]；5個(gè)脂肪族季碳[δC146.94(s,C-10)，101.92(s,C-8)，70.49(s,C-7)，63.34(s,C-11)，41.38(s,C-5)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,16、H-4/C-6,10,14、H-6/C-4,10,14、H-9/C-5,7、H-12/C-7,8、H-13/C-7,12、H-14/C-4,10、H-15/C-3,5，分析化合物1-1與已知化合物eremofortin C-1的13CNMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)化合物的13CNMR數(shù)據(jù)基本接近。與文獻(xiàn)[17]數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，化合物1-1與已知化合物eremofortin C-1的結(jié)構(gòu)相似，化合物1-1中δC101.92(C-8)與化合物eremofortin C-1中δC102.41(C-8)之間僅相差0.49 ppm；分析HR-ESI-MS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)化合物的分子離子峰之間僅相差14，由此初步確定為失去了一個(gè)亞甲基的碎片，再根據(jù)化合物1-1的IR光譜在2 939 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)寬的吸收譜帶，可以確定連接在eremofortin C-1的C-8位上是一個(gè)甲氧基，而連接在化合物1-1的C-8位上是一個(gè)羥基。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，最終確定化合物1-1是一個(gè)新的艾里莫芬烷型倍半萜類化合物，命名為pestalotiopnoid A?；衔?-1的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到，以圓二色譜(CD)計(jì)算確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖1)。

圖1 化合物1-1的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.1 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-1

表2 化合物1-2的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.2 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-2 in CD3OD

化合物1-2的分子式為C34H42O11(計(jì)算值為649.261 9；不飽和度為14)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-2含有8個(gè)甲基[δH2.10*(6H,d,J=2.3 Hz,OAc-17,17′)，1.34(3H,s,CH3-13)，1.47(3H,s,CH3-13′)，1.28(3H,s,CH3-14)，1.30(3H,s,CH3-14′)，1.00(3H,s,CH3-15)，1.02(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15′)；δC25.73(q,CH3-14′)，23.65(q,CH3-14)，20.60*(q,C-17′)，20.52*(q,C-17)，17.20(q,CH3-13′)，12.86(q,CH3-13)，11.18(q,CH3-15)，10.77(q,CH3-15′)]；4個(gè)亞甲基[δH4.07(1H,d,J=10.7 Hz,H-12′)，4.00(2H,d,J=10.7 Hz,H-12′a,12a)，3.55(1H,s,H-12)，2.24(1H,d,J=14.8 Hz,H-6′)，1.84(1H,d,J=5.8 Hz,H-6′a)，1.96(1H,m,H-6)，1.88(1H,m,H-6a)；δC70.41(t,C-12)，65.96(t,C-12′)，42.26(t,C-6′)，33.74(t,C-6)]；10個(gè)次甲基[δH5.96(1H,s,H-9)，6.43(1H,s,H-9′)，5.17(1H,dd,J=9.6 Hz、4.2 Hz,H-3)，5.14(1H,d,J=5.1 Hz,H-3′)，3.62(1H,d,J=3.9 Hz,H-1)，3.75(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′)，3.66(1H,m,H-2)，3.89(1H,m,H-2′)，1.84(1H,t,J=4.6 Hz,H-4)，1.93(1H,t,J=4.5 Hz,H-4′)；δC131.81(d,C-9′)，129.49(d,C-9)，72.48(d,C-3)，71.99(d,C-3′)，58.78(d,C-1)，57.09(d,C-1′)，56.68(d,C-2′)，54.74(d,C-2)，42.76(d,C-4′)，42.30(d,C-4)]；3個(gè)羰基碳[δC195.19(s,C-8′)，172.31*(s,C-16′)，172.28*(s,C-16)]；9個(gè)脂肪族季碳[δC163.67(s,C-10′)，146.14(s,C-10)，102.35(s,C-8)，70.01(s,C-7)，67.52(s,C-11′)，67.42(s,C-11)，64.07(s,C-7′)，40.23(s,C-5)，38.81(s,C-5′)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-1/H-2、H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15、H-1′/H-2′、H-2′/H-3′、H-3′/H-4′、H-4′/H-15′及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,15,16、H-4/C-2,6,10,14、H-6/C-4,8,13,14、H-9/C-1,5,7、H-12/C-7,13、H-13/C-7,12、H-14/C-4,6,10、H-15/C-3,5、H-1′/C-5′,9′、H-2′/C-4′,10′、H-3′/C-5′,15′,16′、H-4′/C-2′,6′,10′,14′、H-6′/C-4′,8′,13′,14′、H-9′/C-1′,5′,7′、H-12′/C-7′,8′,13′、H-13′/C-7′,12′、H-14′/C-4′,6′,10′、H-15′/C-3′,5′，通過(guò)HR-ESI-MS數(shù)據(jù)和C-8(δC102.35)、C-12(δC70.41)及H-12′/C-8之間的長(zhǎng)程耦合關(guān)系，可以確定化合物1-2中存在一個(gè)由C-11′/C-12′/O/C-8組成的醚鍵，且化合物1-2是由具有高氧化度的化合物PR-toxin和化合物1-1之間脫去一分子水成醚縮合而成。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和相關(guān)文獻(xiàn)[18]調(diào)研，確定化合物1-2是一個(gè)新的艾里莫芬烷型倍半萜類化合物，命名為pestalotiopnoid B，通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到其相對(duì)構(gòu)型。對(duì)已知化合物eremofortin C-1進(jìn)行單晶培養(yǎng)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，利用X-射線單晶衍射證實(shí)了化合物1-2的平面結(jié)構(gòu)并確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖2)。

圖2 化合物1-2的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.2 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-2

表3 化合物1-3的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Tab.3 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-3 in CD3OD

化合物1-3的分子式為C34H42O11(計(jì)算值為649.261 9；不飽和度為14)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-3中含有8個(gè)甲基[δH2.10*(6H,d,OAc-17,17′)，1.38(3H,s,CH3-13′)，1.47(3H,s,CH3-13)，1.27(3H,s,CH3-14′)，1.32(3H,s,CH3-14)，0.98(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15)，1.02(3H,d,J=7.1 Hz,CH3-15′)；δC23.40(q,CH3-14′)，22.49*(q,C-17′)，20.59*(q,C-17)，20.50(q,CH3-14)，17.05(q,CH3-13′)，11.24(q,CH3-13)，10.70(q,CH3-15′)，10.34(q,CH3-15)]；4個(gè)亞甲基[δH3.78(1H,d,J=9.9 Hz,H-12)，3.90(1H,m,H-12′)，3.68(1H,d,J=9.9 Hz,H-12a),1.55(1H,d,J=13.3 Hz,H-6a)，2.24(1H,dd,J=18.1 Hz、14.1 Hz,H-6)，1.87(1H,d,J=14.1 Hz,H-6′a)，2.20(1H,d,J=14.7 Hz,H-6′)；δC71.46(t,C-12)，63.95(t,C-12′)，42.65(t,C-6′)，35.07(t,C-6)]；10個(gè)次甲基[δH6.35(1H,s,H-9)，6.43(1H,s,H-9′)，5.15(1H,t,J=3.5 Hz,H-3′)，5.12(1H,t,J=3.2 Hz,H-3)，3.64(1H,d,J=3.8 Hz,H-1)，3.75(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′)，3.72(1H,dd,J=4.9 Hz、3.9 Hz,H-2)，3.88(1H,d,J=2.4 Hz,H-2′)，1.81(1H,dd,J=7.0 Hz、5.6 Hz,H-4)，1.89(1H,m,H-4′)；δC131.97(d,C-9′)，125.67(d,C-9)，72.86(d,C-3′)，71.94(d,C-3)，59.02(d,C-1)，56.89(d,C-1′)，56.60(d,C-2′)，54.87(d,C-2)，45.56(d,C-4)，42.97(d,C-4′)]；3個(gè)羰基碳[δC195.32(s,C-8′)，172.39*(s,C-16′)，172.28*(s,C-16)]；9個(gè)脂肪族季碳[δC163.78(s,C-10′)，146.82(s,C-10)，102.20(s,C-8)，70.52(s,C-7)，67.19(s,C-11′)，63.40(s,C-11)，63.75(s,C-7′)，41.39(s,C-5)，38.62(s,C-5′)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-1/H-2、H-2/H-3、H-3/H-4、H-4/H-15、H-1′/H-2′、H-2′/H-3′、H-3′/H-4′、H-4′/H-15′及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-1/C-5,9、H-2/C-4,10、H-3/C-5,15,16、H-4/C-2,6,10,14、H-6/C-4,8,13,14、H-9/C-1,5,7、H-12/C-7,13、H-13/C-7,12、H-14/C-4,6,10、H-15/C-3,5、H-1′/C-5′,9′、H-2′/C-4′,10′、H-3′/C-5′,15′,16′、H-4′/C-2′,6′,10′,14′、H-6′/C-4′,8′,13′,14′、H-9′/C-1′,5′,7′、H-12′/C-7′,8′,13′、H-13′/C-7′,12′、H-14′/C-4′,6′,10′、H-15′/C-3′,5′，通過(guò)HR-ESI-MS數(shù)據(jù)和相關(guān)NMR數(shù)據(jù)，可以確定化合物1-3與化合物1-2結(jié)構(gòu)相同，造成13CNMR數(shù)據(jù)不同的原因可能是化合物1-3與1-2的構(gòu)型不同，因此，化合物1-3命名為pestalotiopnoid C?；衔?-3的相對(duì)構(gòu)型通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到，以CD計(jì)算確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖3)。

圖3 化合物1-3的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.3 Key HMBC,COSY,and NOESY of compound 1-3

表4 化合物1-4的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CDCl3)Tab.4 1HNMR and 13CNMR data of compound 1-4 in CDCl3

化合物1-4的分子式為C18H28O6(計(jì)算值為363.177 8；不飽和度為5)，綜合分析13CNMR、DEPT和HSQC圖譜信息，表明化合物1-4中含有4個(gè)甲基[δH2.02(3H,s,CH3-15)，1.59(3H,s,CH3-16)，1.16(3H,s,CH3-13)，1.03(3H,s,CH3-12)；δC27.16(q,CH3-12)，24.07(q,CH3-13)，21.56(q,C-15)，19.06(q,CH3-16)]；3個(gè)亞甲基[δH4.34(1H,d,J=11.3 Hz,H-18)，3.95(1H,d,J=11.0 Hz,H-18a)，2.29(1H,dd,J=11.8 Hz、4.1 Hz,H-8)，1.56(1H,d,J=11.6 Hz,H-8a)，1.92(1H,dd,J=12.9 Hz、6.3 Hz,H-11)，1.74(1H,dd,J=12.9 Hz、10.9 Hz,H-11a)；δC64.70(t,C-18)，38.87(t,C-8)，32.85(t,C-11)]；5個(gè)次甲基[δH5.88(1H,d,J=2.5 Hz,H-4)，5.24(1H,dd,J=11.5 Hz、4.1 Hz,H-9)，3.78(1H,dd,J=9.2 Hz、2.0 Hz,H-5)，3.24(1H,dd,J=10.7 Hz、6.3 Hz,H-2)，2.89(1H,d,J=9.2 Hz,H-6)；δC138.95(d,C-4)，75.60(d,C-5)，74.67(d,C-9)，65.58(d,C-6)，41.43(d,C-2)]；5個(gè)脂肪族季碳[δC170.44(s,C-14)，137.91(s,C-3)，79.24(s,C-1)，56.78(s,C-7)，43.07(s,C-10)]；1個(gè)甲氧基[δH3.42(3H,s,OCH3-17)；δC57.69(OCH3-17)]。結(jié)合1H與1H-COSY的相關(guān)關(guān)系H-2/H-11、H-4/H-5、H-5/H-6、H-8/H-9及1H與HMBC的相關(guān)關(guān)系H-2/C-10,18、H-4/C-2、H-5/C-7,17、H-6/C-8,16、H-8/C-1,16、H-9/C-2,14、H-11/C-1,3,12,13、H-12/C-1,13、H-13/C-1,11,12、H-16/C-6,8、OCH3-17/C-5、H-18/C-2,4，通過(guò)HR-ESI-MS和C-6(δC65.58)、C-7(δC56.78)等數(shù)據(jù)，可以確定化合物1-4含有一個(gè)由C-6/O/C-7組成的環(huán)氧結(jié)構(gòu)。通過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和相關(guān)文獻(xiàn)[19]調(diào)研，確定化合物1-4是一個(gè)新的石竹烯型倍半萜類化合物，命名為pestalotiopsin K，通過(guò)NOESY數(shù)據(jù)推理得到其相對(duì)構(gòu)型。對(duì)該化合物進(jìn)行單晶培養(yǎng)，再利用X-射線單晶衍射證實(shí)其平面結(jié)構(gòu)并確定其絕對(duì)構(gòu)型(圖4)。通過(guò)單晶結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)可知，化合物1-4的OH-1與OH-18之間形成氫鍵，在空間上構(gòu)成4/6/9三環(huán)網(wǎng)狀骨架(圖5)。

圖4 化合物1-4的關(guān)鍵HMBC、COSY和NOESYFig.4 Key HMBC,COSY，and NOESY of compound 1-4

圖5 化合物1-4的X-射線單晶衍射ORTEP圖Fig.5 XRD ORTEP diagram of compound 1-4

化合物1-5：無(wú)色油狀液體；HR-ESI-MS，m/z：393.130 8([M+Na]+,C21H22O6Na+;計(jì)算值：393.131 4)；1HNMR(400 MHz,CD3OD)，δ：6.58(1H,dd,J=2.3 Hz、0.8 Hz,H-6)，6.57(1H,d,J=2.2 Hz,H-8)，6.08(1H,dd,J=5.7 Hz、2.5 Hz,H-13)，5.99(1H,dd,J=5.7 Hz、1.8 Hz,H-14)，5.68(1H,d,J=2.3 Hz,H-18)，5.66(1H,d,J=2.2 Hz,H-19)，4.78(1H,m,H-17)，3.77(1H,d,J=5.8 Hz,H-16)，3.57(1H,d,J=1.6 Hz,H-11)，2.93(1H,m,H-12)，2.61(3H,s,CH3-21)，1.63(3H,s,CH3-20)，1.24(3H,d,J=7.2 Hz,CH3-22)；13CNMR(100 MHz,CD3OD)，δ：168.78(C-2)，163.38(C-4)，162.53(C-9)，158.98(C-7)，143.83(C-13)，139.44(C-5)，131.16(C-18)，129.85(C-14)，128.47(C-19)，116.36(C-6)，111.62(C-15)，105.84(C-10)，104.37(C-3)，101.50(C-8)，78.18(C-16)，67.82(C-17)，52.23(C-11)，47.35(C-12)，21.73(CH3-21)，21.42(CH3-22)，13.54(CH3-20)。通過(guò)與文獻(xiàn)[11]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-5為pestalustaine B(圖6a)。

圖6 化合物1-5(a)和1-6(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural formulas of compounds 1-5(a) and 1-6(b)

圖7 化合物1-7(a)和1-8(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structural formulas of compounds 1-7(a) and 1-8(b)

化合物1-8：白色無(wú)定形固體；HR-ESI-MS，m/z：333.167 6([M+Na]+,C17H26O5Na+;計(jì)算值：333.167 2)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：5.73(1H,dd,J=5.9 Hz、2.6 Hz,H-6)，5.67(1H,d,J=5.9 Hz,H-5)，5.32(1H,dd,J=10.5 Hz、5.7 Hz,H-2)，4.16(1H,d,J=2.9 Hz,H-7)，3.71(1H,d,J=11.7 Hz,H-14a)，2.54(1H,dd,J=12.7 Hz、8.0 Hz,H-9)，2.10(1H,dd,J=12.7 Hz、9.2 Hz,H-10a)，1.58(1H,dd,J=9.0 Hz、8.1 Hz,H-10b)，1.78(2H,s,H-3)，2.02(3H,s,CH3-17)，1.08(3H,s,CH3-12)，1.12(3H,s,CH3-13),1.06(3H,s,CH3-15)；13CNMR(100 MHz,CDCl3)，δ：170.44(C-16)，141.64(C-5)，129.58(C-6)，87.34(C-7)，79.92(C-1)，72.48(C-2)，62.10(C-14)，54.94(C-8)，50.40(C-4)，47.06(C-9)，42.31(C-11)，36.42(C-3)，35.06(C-10)，23.54(CH3-15)，23.39(CH3-12)，23.33(CH3-13)，21.40(CH3-17)。通過(guò)與文獻(xiàn)[19]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-8為punctaporonin L(圖7b)。

化合物1-9：淡黃色油狀液體；HR-ESI-MS，m/z：333.167 8([M+Na]+,C17H26O5Na+;計(jì)算值：333.167 8)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)，δ：5.95(1H,s,H-5)，5.94(1H,s,H-7)，5.67(1H,d,J=13.6 Hz,H-6)，4.86(1H,t,J=5.3 Hz,H-2)，4.16(2H,d,J=11.5 Hz,H-14)，3.48(1H,m,H-9)，2.91(1H,d,J=5.9 Hz,H-3a)，1.55(1H,d,J=16.6 Hz,H-3b)，2.20(1H,t,J=11.9 Hz,H-10a)，1.63(1H,d,J=9.8 Hz,H-10b)，2.09(3H,s,CH3-17)，1.21(3H,s,CH3-15)，1.14(3H,s,CH3-12)，1.12(3H,s,CH3-13)；13CNMR(100 MHz,CDCl3)，δ：172.31(C-16)，143.68(C-5)，137.43(C-8)，128.63(C-7)，123.88(C-6)，81.22(C-1)，75.79(C-2)，72.56(C-4)，65.06(C-14)，44.78(C-3)，40.36(C-11)，39.23(C-9)，33.64(C-10)，31.20(CH3-15)，24.23(CH3-12)，23.37(CH3-13)，21.45(CH3-17)。通過(guò)與文獻(xiàn)[23]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-9為punctaporonin H(圖8a)。

圖8 化合物1-9(a)和1-10(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structural formulas of compounds 1-9(a) and 1-10(b)

化合物1-10：白色粉末狀固體；HR-ESI-MS，m/z：275.162 3([M+Na]+,C15H24O3Na+;計(jì)算值：275.162 3)；1HNMR(400 MHz,CD3OD)，δ：5.74(1H,dd,J=5.9 Hz、2.4 Hz,H-6)，5.71(1H,d,J=5.9 Hz,H-7)，4.14(1H,d,J=2.4 Hz,H-5)，3.66(1H,d,J=11.2 Hz,H-14a)，2.49(1H,dd,J=12.8 Hz、7.8 Hz,H-9)，2.05(1H,m,H-10a)，1.55(1H,m,H-10b)，1.99(1H,m,H-2a)，1.33(1H,dt,J=12.3 Hz、5.5 Hz,H-2b)，1.84(1H,dd,J=9.2 Hz、3.8 Hz,H-3)，1.13(3H,s,CH3-12)，1.06(3H,s,CH3-13)，1.02(3H,s,CH3-15)；13CNMR(100 MHz,CD3OD)，δ：142.94(C-7)，130.80(C-6)，89.36(C-5)，80.35(C-1)，62.89(C-14)，56.59(C-8)，49.13(C-9)，47.00(C-4)，43.64(C-11)，36.31(C-10)，32.40(C-2)，31.88(C-3)，24.92(CH3-15)，24.01(CH3-12)，23.58(CH3-13)。通過(guò)與文獻(xiàn)[24-25]NMR數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物1-10為punctaporonin A(圖8b)。

2.2 細(xì)胞毒活性

對(duì)化合物1-3、1-4、1-8進(jìn)行細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖9。

*表示P<0.05，與依托泊苷相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示P<0.01，與依托泊苷相比具有顯著性差異圖9 不同化合物細(xì)胞毒活性比較Fig.9 Comparison of cytotoxic activities of different compounds

由圖9可知，化合物1-3對(duì)A549細(xì)胞的IC50值為(32.27±4.26) μmol·L-1，與依托泊苷相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值分別為(9.71±0.61) μmol·L-1和(12.63±0.47) μmol·L-1，均顯著低于依托泊苷(P<0.01)，表明化合物1-3對(duì)A549、HeLa和HepG2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性?；衔?-4和1-8對(duì)A549細(xì)胞的IC50值，與依托泊苷相比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的IC50值均顯著高于依托泊苷(P<0.01)。

2.3 乙酰膽堿酯酶抑制活性

乙酰膽堿酯酶抑制劑是治療阿爾茨海默病最有效的手段[26]，目前報(bào)道的高效乙酰膽堿酯酶抑制劑均來(lái)源于藥用植物[27-28]?；衔?-1和1-3對(duì)乙酰膽堿酯酶的IC50值分別為31.0 μmol·L-1和16.1 μmol·L-1，化合物1-1的IC50值明顯高于加蘭他敏(P<0.05)，化合物1-3的IC50值與加蘭他敏相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。其它化合物在濃度為1 μmol·L-1時(shí)，對(duì)乙酰膽堿酯酶均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性(圖10)

圖10 不同化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性比較Fig.10 Comparison of α-glucosidase inhibitory activities of different compounds

由圖10可知，化合物1-1、1-2、1-3和1-4對(duì)α-葡萄糖苷酶均未表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

3 結(jié)論

從桃兒七內(nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌代謝產(chǎn)物中分離并鑒定了10個(gè)萜類化合物，其中化合物1-1、1-2、1-3和1-4為新化合物，對(duì)其細(xì)胞毒活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，化合物1-3、1-4和1-8對(duì)A549、HeLa和HepG2細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性，表明化合物1-3、1-4和1-8具有潛在的抗腫瘤活性，但其抗腫瘤活性與化合物結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究分析?；衔?-3對(duì)乙酰膽堿酯酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，但其對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制具體機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。基于桃兒七內(nèi)生煙色擬盤(pán)多毛孢菌分離出具有抗腫瘤活性和抑制乙酰膽堿酯酶活性的萜類化合物，為桃兒七內(nèi)生真菌抗腫瘤及治療阿爾茨海默病新藥開(kāi)發(fā)提供了新思路。