海藻多糖–納米硒的結(jié)構(gòu)及其促進水稻硒累積的機理

王潮鑫，楊春妹，張 木，沈 宏*

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣東 廣州 510642）

硒(selenium，Se)是人體必需的微量元素，缺硒會誘發(fā)克山病、大骨節(jié)病、甲狀腺功能減退和免疫系統(tǒng)減弱等癥狀[1–3]。而人體自身無法合成硒，只能通過食品藥品等途徑攝入硒元素。水稻是我國南方最主要的糧食作物，通過外源施硒提高大米硒含量是滿足缺硒地區(qū)人群對硒日常需求的有效辦法。

可用于提高稻米硒含量的硒源包括硒酸鹽、亞硒酸鹽、硒氨基酸和納米硒(selenium-nanoparticles，SeNPs)。目前，在農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)中廣泛使用硒酸鹽和亞硒酸鹽，但其安全范圍較窄，存在硒毒害風(fēng)險[4]。納米硒指的是尺寸在0～100 nm的紅色零價單質(zhì)硒。Zhang等[5]采用化學(xué)方法合成納米硒顆粒，并發(fā)現(xiàn)納米硒顆粒具有較高的生物活性以及較寬的安全施用范圍。但前人對納米硒的研究多集中在醫(yī)學(xué)上的抑菌、抗氧化、抗癌等效果，在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用很少[6–8]。近幾年，納米硒對農(nóng)作物的影響受到越來越多的關(guān)注，納米硒能提高辣椒中辣椒素的含量，促進次生代謝產(chǎn)物和抗氧化劑的積累[9]；也能提高金絲小棗的硒含量、產(chǎn)量和品質(zhì)[10]。Zahedi等[11]還發(fā)現(xiàn)葉面噴施納米硒能減輕鹽脅迫對草莓生長和產(chǎn)量的影響。納米硒與硅、硫等元素配合施用還可以緩解重金屬對水稻的脅迫[12–13]。但是通過物理化學(xué)方法合成的納米硒需要加入穩(wěn)定劑以保持其穩(wěn)定性和活性，且不同的穩(wěn)定劑對納米硒的性質(zhì)和應(yīng)用效果有較大影響。前人利用殼聚糖、茶多糖、葡聚糖、黃芪多糖和海藻多糖等制備了天然多糖穩(wěn)定納米硒[2, 14–16]。

多數(shù)研究使用的是商品納米硒肥[17–18]，其穩(wěn)定劑成分未明，是否加入穩(wěn)定劑也同樣未知，因此難以深入研究納米硒在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。成分確定的多糖納米硒則多數(shù)被應(yīng)用于藥品、食品添加劑、飼料添加劑等領(lǐng)域，且海藻多糖在農(nóng)業(yè)中已被廣泛應(yīng)用[19–21]，但將海藻多糖結(jié)合納米硒用作肥料還未見報道，海藻多糖與納米硒結(jié)合是否能產(chǎn)生更好的農(nóng)作物富硒效果值得深入研究。

針對上述問題，本研究先通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化制備出海藻多糖?納米硒(alginate polysaccharide selenium-nanoparticles，APS-SeNPs)，并對APS-SeNPs進行形貌表征及表面性能分析，進而研究在大田條件下噴施APS-SeNPs對水稻(Oryza sativa L.)硒累積的效果，以期為富硒水稻生產(chǎn)提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海藻提取液由本實驗室制備得到[22]，海帶購于廣州申晶雅農(nóng)業(yè)科技有限公司?？箟难?Vc)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硒酸鈉(Na2SeO4)購于北京化工集團有限公司。水稻種子(粳稻‘洛稻998’和秈稻‘川香優(yōu)2號’)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 海藻多糖?納米硒的制備工藝優(yōu)化 APSSeNPs的制備步驟：以海藻提取液作為溶劑制備0.5 mol/L Na2SeO3母液，參考 Mansouri-Tehrani 等[15]、Hu 等[2]、穆靜靜等[23]的方法。稱取 1.8 g Vc 于 200 mL燒杯中，加入適量海藻提取液，在40℃條件下攪拌溶解，滴加5 mL Na2SeO3母液(硒添加量2000 mg/L)，繼續(xù)加海藻提取液至100 mL，在40℃條件下持續(xù)攪拌反應(yīng)40 min。

抗壞血酸還原法制備納米硒的反應(yīng)式如下[24–25]：

按照上述步驟，分別改變硒添加量(1000、2000、4000、6000、8000 mg/L)、硒酸比 (Na2SeO3與 Vc 的摩爾比 1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、反應(yīng)溫度(30℃、40℃、60℃、80℃、90℃)、反應(yīng)時間(5、10、20、40、80、120 min) 4 個因素中的一個，其余因素保持不變。測定反應(yīng)產(chǎn)物的粒徑以及Zeta電位。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果分析，使用Design-Expert 12軟件設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗方案，因素水平如表1所示。然后對軟件分析得到的最佳制備工藝條件所制備的APS-SeNPs進行表征。

表1 APS-SeNPs主要制備條件的響應(yīng)面設(shè)計Table 1 Response-surface design of main preparation conditions of APS-SeNPs

1.2.2 海藻多糖?納米硒對水稻硒累積效果 2021年3—11月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)實驗基地(113°57′E，23°35′N)進行大田試驗，連續(xù)種植兩季水稻。采用隨機區(qū)組設(shè)置，將試驗田分為10個小區(qū)(每個小區(qū)長8.0 m，寬1.2 m)，幼苗移栽兩天前將基肥(N∶P2O5∶K2O = 24∶8∶20)施入土壤，用量為 250 kg/hm2，水稻生長期間按當(dāng)?shù)卣４筇飾l件管理。第一季水稻收獲后，將稻田灌滿水，兩天后施入等量基肥并重新整田，將提前培育了45天的幼苗移栽，種植第二季水稻。

處理設(shè)置如下：對照 (清水)、5 mg/L APS-SeNPs、25 mg/L APS-SeNPs、5 mg/L Na2SeO3、25 mg/L Na2SeO3。兩個水稻品種共10個處理。其中Na2SeO3為不含海藻提取液的水溶液，APS-SeNPs由最佳工藝條件制備后加入乙醇進行離心沉淀，倒掉上清液后進行冷凍干燥，得到APS-SeNPs凍干粉加水稀釋至相應(yīng)濃度。處理方法為：在水稻灌漿期間進行葉面噴施處理一次，用量3000 L/hm2。水稻成熟后，每個處理小區(qū)隨機選取3個點各收獲1 m2的水稻作為3次重復(fù)，以測定相關(guān)指標。

1.3 海藻多糖?納米硒理化性質(zhì)測定方法

1.3.1 Zeta電位和粒徑 APS-SeNPs的制備反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)穆靜靜等[23]的方法，將APS-SeNPs用超純水稀釋至10 mg/L左右，使用激光粒度分析儀(Zatesizer Nano ZSE)分別測定 APS-SeNPs的 Zeta 電位和粒徑。

1.3.2 納米硒含量 在反應(yīng)產(chǎn)物中加入乙醇進行離心沉淀，倒掉上清液后進行冷凍干燥，得到APSSeNPs凍干粉，加水進行重懸浮，稱取0.5 g重懸浮液采用氫化物發(fā)生—原子熒光光度法(GB 5009.93-2017)測定APS-SeNPs的濃度。

1.3.3 傅里葉紅外光譜分析 (FTIR) 稱取 0.05 g 的凍干粉和1 g的溴化鉀混勻后壓片，然后使用傅里葉變換紅外光譜儀(Vertex 70，BRUKER，德國)進行測定。以APS作為對照。

1.3.4 透射電鏡分析(TEM)與能譜分析(EDS) 稱取0.1 g的APS-SeNPs凍干粉加入超純水定容至500 mL進行重懸浮，稀釋至10倍后滴加到銅網(wǎng)上，待完全干燥后使用場發(fā)射透射電子顯微鏡(FEI Talos F200S，賽默飛，美國)進行觀察，并做透射電鏡?能譜分析(TEM-EDS)。以不添加APS所制備的SeNPs作為對照。

1.3.5 表面張力 采用Wilhelmy吊片法[26]，將玻璃培養(yǎng)皿用待測樣品潤洗后，倒入樣品至培養(yǎng)皿1/2高度，使用全自動表面張力儀(BZY-1，上海衡平儀器儀表廠，中國)測定APS-SeNPs的表面張力。以相同濃度的SeNPs、Na2SeO3、Na2SeO4溶液以及400倍APS-SeNPs稀釋液作為對照。

1.3.6 接觸角[27]剪取新鮮水稻葉片，用雙面膠粘貼在載玻片上，使用接觸角測量儀(OCA20，DATAPHYSICS，德國)測定APS-SeNPs在水稻葉片上的接觸角。以相同濃度的SeNPs、Na2SeO3和Na2SeO4溶液作為對照。

1.3.7 持液量 參考張鵬九等[28]的方法。剪取水稻劍葉，記錄好原始重量后葉面朝上平放在桌面上，將配置好的樣品溶液在葉片上均勻噴灑5次，然后將葉片垂直夾起使多余的溶液離開葉片，再次稱量葉片的總質(zhì)量；將葉片擦干后附上標尺拍照，使用imageJ軟件計算葉片面積，計算出葉片的持液量。單位為mg/cm2。

1.4 水稻相關(guān)指標的測定

1.4.1 產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成 將水稻自然風(fēng)干后，每個重復(fù)隨機選取3株水稻，計算每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)以及千粒重，隨后將所有風(fēng)干后的水稻進行打谷，測定單位面積的產(chǎn)量。

1.4.2 總硒含量 將收獲后的葉片和籽粒用清水清洗，吸水紙擦干表面水分后將籽粒進行脫殼，分為葉片、稻殼和糙米3部分烘干粉碎后，采用氫化物發(fā)生—原子熒光光度法測定各部位硒含量。

1.4.3 硒的轉(zhuǎn)運系數(shù) 糙米硒濃度與葉片硒濃度之比為硒的轉(zhuǎn)運系數(shù)，轉(zhuǎn)運系數(shù)越高代表植物葉片吸收的硒轉(zhuǎn)運到大米的能力越強。

1.4.4 有機硒含量 根據(jù)Wang等[29]的方法，在3 g 樣品中加入 3.5 mL 的 4 mol/L 鹽酸，在 100℃ 沸水中水浴10 min，然后在4℃條件下2500 r/min離心10 min，將上清液用超純水定容至10 mL，采用氫化物發(fā)生—原子熒光光度法測定無機硒含量，將總硒含量減去無機硒含量計算出有機硒含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析使用軟件SPSS 20.0，響應(yīng)面法相關(guān)圖表使用軟件Design-Expert 12繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對制備海藻多糖?納米硒的影響

由不同硒添加量對APS-SeNPs透明度的影響(圖1)可知，將所有樣品統(tǒng)一稀釋至500 mg/L后，硒添加量1000和2000 mg/L的樣品顏色透亮，其背后的文字清晰可見，而在硒添加量4000、6000和8000 mg/L時出現(xiàn)渾濁，背后的文字無法看清。如圖2-a所示，APS-SeNPs在硒添加量1000～2000 mg/L的粒徑和Zeta電位絕對值分別在53.58～54.75 nm和42.48～43.99 mV，硒添加量 4000 mg/L 時顆粒直徑顯著上升至137.04 nm及Zeta電位的絕對值下降至36.06 mV，硒添加量再升高，顆粒直徑再升高，Zeta電位絕對值再下降。這與圖1結(jié)果一致，表明APSSeNPs體系的靜電穩(wěn)定性在硒添加量≥4000 mg/L時顯著下降。

圖1 不同硒添加量制備的APS-SeNPs透明度對比Fig. 1 Transparency comparison of APS-SeNPs prepared with different levels of Se addition

Na2SeO3與Vc的摩爾比(Se∶Vc)對APS-SeNPs粒徑和Zeta電位的影響如圖2-b所示，當(dāng)硒酸比為1∶2時，雖然體系的Zeta電位絕對值高于30 mV，但其顆粒直徑較大(139.50 nm)。而當(dāng)硒酸比在1∶3～1∶6時，體系顆粒直徑與Zeta電位絕對值分別在 47.89～85.29 nm 和 42.39～47.88 mV，均處于非常穩(wěn)定的狀態(tài)。其中，硒酸比為1∶5時粒徑最小(47.89 nm)，穩(wěn)定性最高 (?47.88 mV)。

反應(yīng)溫度對APS-SeNPs粒徑和Zeta電位的影響如圖2-c所示，隨著反應(yīng)溫度的提高，納米硒粒徑先變小后變大，在溫度≥80℃時超過了100 nm (155.96 nm)；Zeta電位先升后降，在90℃時無法保持穩(wěn)定(?26.78 mV)。納米硒的粒徑和 Zeta電位在 40℃時均處于最佳。

反應(yīng)時間對APS-SeNPs粒徑和Zeta電位的影響如圖2-d所示，Vc對亞硒酸鹽的還原需要時間，隨著反應(yīng)時間的延長，體系的顆粒直徑逐漸下降并趨于穩(wěn)定，在≥20 min時粒徑基本在47.61～53.04 nm。Zeta電位也有相同的趨勢，5 min 時只有?27.24 mV，20 min 之后穩(wěn)定在?40.64～?45.16 mV。APS-SeNPs在反應(yīng)20～120 min內(nèi)的粒徑和Zeta電位均較為接近，因此20 min為制備APS-SeNPs的最佳反應(yīng)時間。

圖2 不同反應(yīng)條件制備的APS-SeNPs粒徑及其Zeta電位Fig. 2 Particle size and Zeta potential of APS-SeNPs prepared under different reaction conditions

上述結(jié)果表明，不同條件下納米硒的Zeta電位與粒徑有相反的變化趨勢。因此選擇粒徑作為唯一響應(yīng)值進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

通過單因素試驗確定了影響APS-SeNPs粒徑和穩(wěn)定性的主要因素為硒添加量(A)、硒酸比(B)以及反應(yīng)溫度(C)，從而設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面，試驗結(jié)果如表2所示。將試驗結(jié)果使用Design Expert 12軟件進行響應(yīng)面擬合分析，得到APS-SeNPs粒徑響應(yīng)值(Y)和各因子(A、B、C)之間的多元回歸模型：

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Response-surface analysis scheme and experimental results

回歸模型的方差分析結(jié)果表明，該二次多項式回歸模型極顯著(F=107.31, P<0.00001)，說明該模型各因素與其響應(yīng)值之間有著極為顯著的相關(guān)性。同時失擬項的P值為0.5696大于0.05并不顯著。模型的R2為0.9928，調(diào)整后的R2為0.9836，與預(yù)測的R2(0.9508)相差小于0.2。說明該二次多項式回歸模型擬合程度良好，可對APS-SeNPs合成粒徑進行分析和預(yù)測。

對回歸模型進行分析之后得到3個因素對APSSeNPs粒徑影響的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖(圖3)。三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖可以生動地反映保持一個影響因素在中心值不變的前提下，其余兩個影響因素對響應(yīng)面值的影響，等高線的橢圓化程度與兩個因素交互作用的顯著程度呈正相關(guān)，橢圓化程度越高，說明交互作用越顯著[30]。如圖3-d、f所示，等高線近似橢圓，說明硒添加量與硒酸比、硒酸比與反應(yīng)溫度的交互作用顯著。由圖3-e可見，硒添加量和反應(yīng)溫度的交互作用不顯著。從三維響應(yīng)曲面可直觀看出，兩個因素之間對粒徑的影響呈凹面，能在圖上看到最低點，說明各因素的取值范圍合理。

圖3 硒添加量、硒酸比和反應(yīng)溫度之間成對比較的三維立體響應(yīng)曲面(a、b、c)和等高線圖(d、e、f)Fig. 3 Response-surface (a, b, c) and contour map (d, e, f) for pairwise comparison of Se addition, Se:Vc ratio and reaction temperature

采用 Design Expert 12 軟件預(yù)測 APS-SeNPs制備的最佳條件。結(jié)果顯示APS-SeNPs制備的最佳條件為硒添加量2850 mg/L，硒酸比18.85%，反應(yīng)溫度32.2℃，此條件下APS-SeNPs的粒徑最小，預(yù)測值為38.5 nm。為方便試驗，在硒添加量為2800 mg/L，硒酸比為19∶100 (19%)，反應(yīng)溫度為32℃的條件下進行驗證試驗。上述試驗條件下得到APS-SeNPs的粒徑為38.94±2.26 nm，與理論預(yù)測值接近，同時其靜電穩(wěn)定性較高 (Zeta 電位?52.17±1.30 mV)。因此可以確定APS-SeNPs的最佳制備條件為硒添加量2800 mg/L，硒酸比19∶100，反應(yīng)溫度32℃，反應(yīng)時間20 min。最佳制備條件下得到的APS-SeNPs濃度為 2430±32 mg/L。

2.3 海藻多糖?納米硒的電鏡觀察與能譜分析

由SeNPs與APS-SeNPs的透射電鏡觀察結(jié)果(圖4)可知，SeNPs和APS-SeNPs的平均粒徑均在50 nm左右，其中SeNPs (圖4-a)的納米顆粒呈現(xiàn)橢圓形，顆粒成形較差，且顆粒之間出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象。但APS-SeNPs (圖4-b)的納米顆粒呈圓球形，顆粒之間的間隙清晰分明，并且體系分散均勻穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，APS-SeNPs形成的納米顆粒大小均一，穩(wěn)定性好。

圖4 SeNPs (a)與APS-SeNPs (b)的透射電鏡(TEM)掃描圖Fig. 4 Transmission electron microscopy (TEM) scanning of SeNPs (a) and APS-SeNPs (b) particle

通過掃描透射電鏡?能譜圖觀察了APS-SeNPs的元素分布(如圖5所示)。圖5-a顯示出了APS-SeNPs顆粒的位置，明顯呈現(xiàn)圓形顆粒狀，圖5-b、c、d中氧、硫、硒元素的主要熒光區(qū)域高度重合，集中分布在納米顆粒上；納米硒的特征峰在1.39、11.25和12.49 keV，APS-SeNPs顆粒的硒原子比達到了28.90%，質(zhì)量比達到了71.59%。上述結(jié)果表明APS與納米硒成功結(jié)合形成APS-SeNPs。

圖5 APS-SeNPs的透射電鏡?能譜分析(TEM-EDS)Fig. 5 TEM-EDS analysis of APS-SeNPs

2.4 海藻多糖?納米硒的紅外分析

采用FTIR分析了APS與APS-SeNP的紅外光譜圖(圖6)，APS與APS-SeNPs的吸收峰高度相似，說明兩者相互結(jié)合。APS譜圖中，波數(shù)為3436.98 cm?1的吸收峰屬于O—H伸縮振動產(chǎn)生的強吸收峰，波數(shù)為1637.48 cm?1的吸收峰屬于C=O不對稱伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰，波數(shù)為676.98 cm?1的吸收峰屬于C—H彎曲振動產(chǎn)生的吸收峰。APS-SeNPs的譜圖吸收峰與APS吸收峰基本相同，但在1415.68 cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰。

圖6 APS-SeNPs和APS的紅外光譜圖Fig. 6 FIIR spectra of APS-SeNPS and APS

2.5 海藻多糖?納米硒的表面張力與接觸角分析

為了探究APS-SeNPs在水稻葉片上的表面性能，測定了不同硒源的表面張力、持液量和接觸角(表 3)。同一濃度的 Na2SeO3、Na2SeO4和 SeNPs溶液的表面張力均顯著高于APS-SeNPs。Na2SeO3、Na2SeO4和SeNPs的表面張力接近水的表面張力，而APS-SeNPs的平均靜態(tài)表面張力為46.23 mN/m，與APS的表面張力接近(46.96 mN/m)。此外，APSSeNPs 400 倍稀釋液的表面張力 (65.80 mN/m)也顯著低于Na2SeO3、Na2SeO4和SeNPs。4種溶液在水稻葉片上的持液量和接觸角支持了上述結(jié)果： APSSeNPs在葉片上的持液量最大、接觸角最小。上述結(jié)果表明，APS-SeNPs在水稻葉片上的停留效果好于 Na2SeO3、Na2SeO4和 SeNPs。

表3 不同硒源的表面張力和接觸角Table 3 Surface-tension and contact-angles of selenium sources

2.6 海藻多糖?納米硒對水稻各部位硒累積的影響

不同硒源葉面噴施處理下不同水稻品種的各部位硒含量不同(表4)。無論噴施何種硒源，兩個水稻品種各部位硒含量均隨著施硒濃度的增加而增加，并且各部位硒含量大小為葉片>稻殼>糙米。在同一濃度處理下，APS-SeNPs處理的水稻各部位硒含量均高于Na2SeO3處理。但兩個品種間存在差異，對于‘洛稻998’，其葉片和稻殼兩部位的提升比例較高，APS-SeNPs處理比Na2SeO3處理提高了34.2%～74.3%，而糙米硒含量只提升了10.5%～29.1%；對于‘川香優(yōu)2號’，葉片、稻殼和糙米的提升不明顯，其中糙米硒含量比Na2SeO3處理提升了2.2%～34.5%。值得一提的是，‘洛稻998’噴施25 mg/L APS-SeNPs或 25 mg/L Na2SeO3處理的糙米中硒含量高于0.3 mg/kg，超過國家富硒標準(0.04～0.30 mg/kg，GBT 22499—2008 富硒稻谷)，而其余施硒處理的糙米硒含量均在國家富硒標準范圍內(nèi)。

表4 噴施不同濃度APS-SeNPs和Na2SeO3對水稻各部位硒含量和硒轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響Table 4 Effects of concentrations of APS-SeNPs and Na2SeO3 on Se content in different parts of rice and transport coefficient

結(jié)合兩季的硒轉(zhuǎn)運系數(shù)可知，外源施硒會降低水稻對硒的轉(zhuǎn)運能力。APS-SeNPs處理與Na2SeO3處理的變化趨勢相同，隨著施硒濃度的增加，兩種水稻對硒的轉(zhuǎn)運系數(shù)逐漸降低，從0.17下降到0.07。

2.7 海藻多糖?納米硒對糙米有機硒和無機硒含量的影響

為了研究噴施APS-SeNPs對兩種水稻大米中硒的生物有效性的影響，測定了糙米中的有機硒和無機硒的含量。兩季的數(shù)據(jù)基本一致，因此只討論第一季的結(jié)果。如圖7所示，洛稻998和川香優(yōu)2號糙米中有機硒和無機硒的比例隨不同硒源的變化趨勢一致，兩種水稻糙米中的硒主要以有機形式存在。施硒處理的糙米有機硒比例在70.9%～85.3%，空白對照的無機硒則未檢出(無機硒含量低于0.05 μg/L，可視有機硒比例為100%)，且隨著施硒濃度的提高，APS-SeNPs和Na2SeO3處理的糙米有機硒比例均逐漸下降，說明外源施硒會降低大米中硒的有效性。但值得一提的是，相同施硒濃度條件下，APS-SeNPs處理的水稻有機硒比例顯著高于Na2SeO3處理。且APS-SeNPs處理的川香優(yōu)2號有機硒比例比Na2SeO3處理高4.8～7.6個百分點，而洛稻998只高了2.1～3.4個百分點。說明不同品種對APS-SeNPs的轉(zhuǎn)化能力不同，川香優(yōu)2號對APSSeNPs的轉(zhuǎn)化能力更強。

圖7 噴施不同硒源糙米中有機硒和無機硒的比例Fig. 7 Proportion of organic and inorganic Se in brown rice as affected by Se sources

2.8 海藻多糖?納米硒對水稻產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

如表5所示，兩季的數(shù)據(jù)略有差異，但趨勢相同。對于‘洛稻998’，與對照相比，5 mg/L的APSSeNPs與Na2SeO3處理的千粒重分別顯著增加10.2%～11.1% 和 8.1%～8.7%，25 mg/L APSSeNPs和Na2SeO3處理差異不顯著；各處理之間的株穗數(shù)和穗粒數(shù)均沒有顯著差異；5 mg/L APSSeNPs處理較對照增加了7.6%。對于‘川香優(yōu)2號’，只有5 mg/L Na2SeO3處理的千粒重較對照顯著增加14.6%～20.0%，其余處理雖表現(xiàn)為高于對照趨勢，但差異不顯著；第一季5 mg/L Na2SeO3處理增產(chǎn)明顯。‘川香優(yōu)2號’的產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素測定結(jié)果均高于‘洛稻998’，各處理的變化趨勢與‘洛稻998’一致。上述結(jié)果表明，APS-SeNPs主要通過影響水稻千粒重提高水稻產(chǎn)量。

表5 兩種水稻大田收獲產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成Table 5 Harvest yield and yield composition of two rice cultivars

3 討論

3.1 海藻多糖?納米硒制備條件分析

納米硒顆粒直徑越小，其各項性能表現(xiàn)越好[25]。Zeta電位則被用來評價體系的穩(wěn)定性，當(dāng)電位的絕對值大于30 mV時，體系處于穩(wěn)定狀態(tài)，高于40 mV時體系處于非常穩(wěn)定的狀態(tài)。多數(shù)研究認為，蛋白質(zhì)和多糖等穩(wěn)定劑通過對納米硒的表面進行包裹，從而避免納米硒顆粒之間因直接接觸而聚沉失活[15, 31]。因此，Se與APS的比例會對APS-SeNPs的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響，在APS濃度不變的情況下，Se的添加量是有限的。在保證納米硒較小的粒徑以及較高的靜電穩(wěn)定性情況下，盡可能地提高納米硒的濃度可以降低肥料的運輸成本。因此選擇硒添加量2000和4000 mg/L作為響應(yīng)面實驗設(shè)計的?1和1水平。

Na2SeO3與Vc的摩爾比對納米硒的粒徑和靜電穩(wěn)定性有著顯著影響。理論上，亞硒酸鹽與Vc的還原反應(yīng)計量比為1∶2，為了保證充分反應(yīng)，一般會添加過量的還原劑。本研究的結(jié)果(圖2-b)支持了上述觀點，當(dāng)硒酸比為1∶2時反應(yīng)產(chǎn)物粒徑較大，可能是體系中的還原物質(zhì)不夠?qū)е录{米硒無法保持分散狀態(tài)[32]。但當(dāng)體系中的還原物質(zhì)充足時，不同的穩(wěn)定劑具有不同的最佳硒酸比和反應(yīng)溫度。如喻波[33]以殼聚糖為穩(wěn)定劑制備納米硒的最佳硒酸比為1∶4，最佳反應(yīng)溫度為65℃；高娟等[34]以菊糖為穩(wěn)定劑，其最佳硒酸比則為1:3，最佳反應(yīng)溫度為100℃；葉錫光[25]以茶多糖為穩(wěn)定劑的最佳硒酸比為1∶8，最佳反應(yīng)溫度為40℃。而本試驗(圖2-b、c)選擇硒酸比1∶6和1∶4 (17%和25%)、反應(yīng)溫度30℃和60℃作為響應(yīng)面試驗設(shè)計的?1和1水平。

穩(wěn)定劑與納米硒的反應(yīng)需要一定的時間，時間長短與穩(wěn)定劑相關(guān)。如王紅艷[24]以殼寡糖為穩(wěn)定劑制備納米硒，發(fā)現(xiàn)其在反應(yīng)110 min后趨于穩(wěn)定；葉錫光[25]則選用60 min作為制備茶多糖?納米硒的最佳反應(yīng)時間。本研究中，當(dāng)反應(yīng)時間超過20 min后，APS-SeNPs的粒徑和Zeta電位趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)時間不是影響APS-SeNPs粒徑和靜電穩(wěn)定性的主要因素，因此選擇20 min作為制備APS-SeNPs的最優(yōu)反應(yīng)時間。

3.2 海藻多糖?納米硒的形貌分析

當(dāng)一種化合物與一種單質(zhì)通過次級鍵結(jié)合時，該化合物的紅外光譜部分吸收峰會發(fā)生偏移。所有以多糖為穩(wěn)定劑制備的納米硒在3400、1600 cm?1處的吸收峰會發(fā)生偏移，這是納米硒與多糖分子中的O—H鍵(拉伸和振動)結(jié)合產(chǎn)生的非化學(xué)鍵所導(dǎo)致的[2, 23, 35]。少數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)多糖與納米硒的結(jié)合還會伴隨新的吸收峰產(chǎn)生，如Mulla制備的印楝葉提取物?納米硒的紅外光譜在1456 cm?1處出現(xiàn)了因Se—O鍵結(jié)合而產(chǎn)生的新吸收峰[36]。本研究結(jié)果(圖6)與其相似，也在1415.68 cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰，說明APS與納米硒的結(jié)合同時不僅生成了次級鍵使得紅外光譜發(fā)生偏移，還生成了Se—O化學(xué)鍵從而產(chǎn)生新的吸收峰。但是新吸收峰的峰值較小，說明只有少量的化學(xué)鍵生成，納米硒體系的穩(wěn)定主要靠多糖與納米硒的次級鍵維系。

不同文獻記載的納米硒中硒氧原子的比例不盡相同，這似乎與硒和穩(wěn)定劑的相對濃度以及穩(wěn)定劑的類型有關(guān)[3, 37]。Xiao 等[38]發(fā)現(xiàn)當(dāng)冬蟲夏草胞外多糖的含量相同時，硒糖質(zhì)量比為1∶3時，其硒氧原子比為1∶27；硒糖質(zhì)量比為1∶1時，其硒氧原子比則為1∶1.5。按照多糖和單糖的化學(xué)式 (C6H10O5)n推算，每個硒原子結(jié)合一個多糖或單糖分子，其硒氧原子比應(yīng)在1∶5～1∶6。APS-SeNPs中的硒氧原子比接近5∶2 (圖5-e)，說明在最優(yōu)工藝條件下有超過一半的納米硒未與APS結(jié)合，即可能只有顆粒表面的硒與外層包裹的多糖結(jié)合。但硒氧結(jié)合比例是否對納米硒各項性能產(chǎn)生影響還需要進一步的研究。

3.3 海藻多糖?納米硒對水稻硒累積的影響

植物葉片吸收硒的第一步是硒元素停留在葉片上并進入葉片內(nèi)部[39]，但葉片表面的蠟質(zhì)層具有疏水性，使得液體難以在葉片表面停留，如果溶液的表面張力過大會使得植物不易被濕潤從而導(dǎo)致硒肥的施用效果下降[27]。因此，降低硒肥的表面張力無疑能夠提高葉面肥料的利用率。而海藻提取物中既有—COOH、—OH等親水基團，又有—CH3、—NH2等疏水基團，能夠充當(dāng)表面活性劑，使得APS-SeNPs的表面張力(表3)顯著小于Na2SeO3和Na2SeO4。因此，利用海藻提取物降低納米硒溶液的表面張力使硒納米顆粒在葉片長期停留并被氣孔更多地吸收，可能是APS-SeNPs處理的水稻葉片硒吸收量大于Na2SeO3處理的原因。同時，張木等[40]發(fā)現(xiàn)提高水稻的硒含量可以增強葉片光合作用以及水稻對氮素的同化代謝能力。但與之相對的是，過高濃度的硒會與硫發(fā)生競爭，占據(jù)硫的轉(zhuǎn)運通道，大量取代硫元素合成硒蛋白，干擾了硫的正常代謝活動，從而抑制了水稻的正常生長[41]。APS-SeNPs對兩個水稻品種具有增產(chǎn)的作用，但高濃度的硒處理會減弱水稻增產(chǎn)效果(表5)。這與宋會明等[10]在金絲小棗上的研究結(jié)果一致，說明適當(dāng)?shù)蜐舛鹊奈幚砀欣谒旧a(chǎn)。

水稻將硒轉(zhuǎn)運至籽粒的能力對富硒大米生產(chǎn)有著顯著影響。不同硒源在水稻體內(nèi)的轉(zhuǎn)運能力不同，如姜超強等[42]認為亞硒酸鹽在水稻中的轉(zhuǎn)運系數(shù)低于硒酸鹽是由于在水稻體內(nèi)進行轉(zhuǎn)運的硒是硒酸鹽形態(tài)，而亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒酸鹽的過程較根部吸收亞硒酸鹽的過程慢，從而導(dǎo)致水稻根部累積大量的硒。盡管有研究表明植物葉片與根系對硒的吸收有較大差異[43]，但硒在穿過表皮細胞進入葉片后，同樣需要跨過質(zhì)膜進入葉肉細胞，并發(fā)生一系列的形態(tài)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運過程[44]。這表明葉片轉(zhuǎn)運硒的機理可能與根系相似。而本研究中，水稻對APS-SeNPs和Na2SeO3的轉(zhuǎn)運系數(shù)均隨施硒濃度的增加而逐漸下降，相同施硒濃度下，水稻對兩種硒源的轉(zhuǎn)運系數(shù)沒有明顯規(guī)律(表4)，因此，APS-SeNPs轉(zhuǎn)化為硒酸鹽的途徑和效率與亞硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒酸鹽的途徑和效率是否有相同之處，還需要進一步試驗證明。

外源施硒提高作物硒含量被認為是緩解人體缺硒的理想途徑，因為植物可以將無機硒轉(zhuǎn)化為更加安全且容易被人體吸收的有機硒形式[45]。已有研究表明，不同硒源在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化途徑不同，硒酸鹽的還原需要亞硫酸鹽還原酶的參與，而亞硒酸鹽則進行轉(zhuǎn)化效率更高的非酶還原[44]，使得亞硒酸鹽比硒酸鹽更容易被同化為硒氨基酸。而本研究中，相同施硒濃度下APS-SeNPs處理的糙米硒含量和有機硒比例都顯著高于Na2SeO3處理(表4、圖7)。即在總硒含量相同的情況下，APS-SeNPs處理的糙米有機硒比例大大高于Na2SeO3處理。這與Wang等[17]的研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)SeNPs在水稻體內(nèi)向有機形式的轉(zhuǎn)化比例高于Na2SeO3和Na2SeO4。說明SeNPs在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化途徑與硒酸鹽和亞硒酸鹽不同，可能存在更加高效的轉(zhuǎn)化途徑。

有機硒包括硒蛋白、硒多糖、硒核酸等成分，但主要以硒蛋白的形式存在，因此，多數(shù)研究只測定了硒蛋白的含量[45]。本研究發(fā)現(xiàn)水稻噴硒處理后糙米中的有機硒比例在70.9%～85.3%。而前人研究測定的水稻籽粒中的硒蛋白比例范圍較大，占籽?？偽陌俜直仍?40%～100%[29, 46–48]。這可能是由于硒形態(tài)測定前需要將有機硒釋放出來，但目前對樣品的前處理沒有統(tǒng)一的方法，所以導(dǎo)致不同研究對有機硒測定結(jié)果相差較大。

4 結(jié)論

海藻酸納米硒APS-SeNPs的最佳制備工藝條件是：硒添加量2800 mg/L，Na2SeO3與Vc的摩爾比19∶100，反應(yīng)溫度32℃，反應(yīng)時間20 min。在此工藝條件下，APS-SeNPs顆粒均勻(粒徑38.94 nm)，間隙分明，分散穩(wěn)定(Zeta電位?52.17 mV)。

海藻多糖APS與納米硒結(jié)合產(chǎn)生了新的化學(xué)鍵Se—O，同時還降低了肥料溶液的表面張力，延長了APS-SeNPs在水稻葉片上的停留時間，因而促進了水稻對硒的吸收和利用，特別是提高了糙米中有機硒的比例。噴施5 mg/L APS-SeNPs，糙米硒含量可到達國家富硒標準，因此，APS-SeNPs是生產(chǎn)富硒大米的優(yōu)質(zhì)硒肥。