過(guò)熱蒸汽對(duì)卵類粘蛋白糖基化反應(yīng)的影響

溫平威， 涂宗財(cái), 2, *， 王 輝， 胡月明

1. 江西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 江西 南昌 330022 2. 江西師范大學(xué)國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心和江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心， 江西 南昌 330022 3. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 南昌 330047

引 言

水在特定壓力(100 ℃， 101.325 kPa)下受熱， 達(dá)到沸點(diǎn)后形成飽和蒸汽， 對(duì)飽和蒸汽繼續(xù)加熱， 使其達(dá)到沸點(diǎn)以上溫度， 飽和蒸汽會(huì)轉(zhuǎn)化為過(guò)熱蒸汽。 加工過(guò)程中， 過(guò)熱蒸汽先冷凝于物料表面， 傳遞大量熱量到物料， 使其溫度迅速升高到水分蒸發(fā)點(diǎn)， 發(fā)生水分蒸發(fā)， 蒸發(fā)的水分可被過(guò)熱蒸汽吸收， 物料中的水分或揮發(fā)性成分會(huì)隨著過(guò)熱蒸汽排出[1]。 此外， 廢氣中殘留熱能也可以在其他操作單元中進(jìn)行再利用[2]。

過(guò)熱蒸汽獨(dú)特的加工方式賦予其特殊的應(yīng)用。 Satou等[3]將過(guò)熱蒸汽用于糙米、 燕麥和馬鈴薯等的滅酶， 研究發(fā)現(xiàn)125～130 ℃過(guò)熱蒸汽處理糙米0.25～2 min可以使糙米中的酶失活， 且不影響淀粉品質(zhì)， 顯著改善其儲(chǔ)存穩(wěn)定性； Head等[4]采用過(guò)熱蒸汽技術(shù)替代窯干處理燕麥粒， 其品質(zhì)與商業(yè)加工在貨架期、 顏色、 冷糊粘度、 游離脂肪酸含量和感官屬性上沒(méi)有顯著差異， 但是過(guò)熱蒸汽處理燕麥釋放出的己醛含量更低， 具有更安全的加工特性。 可見(jiàn)過(guò)熱蒸汽對(duì)酶類等分子的變性具有一定的促進(jìn)作用， 且作用時(shí)間段， 不會(huì)產(chǎn)生其他的有害物質(zhì)。

卵類粘蛋白(OVM)是雞蛋蛋白的重要組分， 對(duì)蛋清蛋白的營(yíng)養(yǎng)和功能性質(zhì)起著重要作用。 大量研究表明糖基化反應(yīng)可以改善蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)和功能性質(zhì)， 然而傳統(tǒng)的熱處理方式糖基化存在處理時(shí)間長(zhǎng)， 易產(chǎn)生有害糖基化反應(yīng)末期產(chǎn)物(AGEs)等缺點(diǎn)[5]。

利用過(guò)熱蒸汽穿透力強(qiáng)、 快速升溫、 瞬間缺氧、 蒸發(fā)水分等優(yōu)點(diǎn)[6]， 將過(guò)熱蒸汽作用于OVM-還原糖體系， 達(dá)到促進(jìn)OVM糖基化修飾的目的。 為了更好地發(fā)揮過(guò)熱蒸汽促進(jìn)糖基化反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)， 同時(shí)減少還原糖用量， 本研究創(chuàng)新性地采用3%的糖添加量來(lái)達(dá)到微糖瞬時(shí)糖基化修飾的效果。 相較于傳統(tǒng)熱處理糖基化， 本方案的創(chuàng)新和優(yōu)勢(shì)如下： 一是以過(guò)熱蒸汽作為熱源提供熱量， 可以快速滲透到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部， 促進(jìn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子表面的糖基化反應(yīng)； 二是高溫狀態(tài)下的缺氧可以限制蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)物的進(jìn)一步氧化產(chǎn)生高級(jí)產(chǎn)物； 三是水分瞬間蒸發(fā)可以促進(jìn)反應(yīng)向糖基化修飾的方向發(fā)展； 四是加入與蛋白質(zhì)含量相差非常大的還原糖， 使還原糖和蛋白質(zhì)充分混合， 減少還原糖之間的相互作用， 降低焦糖化反應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、 試劑及儀器

OVM、 D-葡萄糖、 D-核糖、 D-乳糖均購(gòu)自Sigma化學(xué)試劑公司； 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

U-2910型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)， 日本Hitachi公司； F7000熒光光譜儀， 日本Hitachi公司； MALDI-TOF質(zhì)譜儀， 美國(guó)AB Science公司； 傅里葉紅外光譜儀， 美國(guó)Thermo Nicolet公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

分別稱取三份3 g OVM原料， 每份原料中添加質(zhì)量比為3%的D-核糖、 D-葡萄糖和D-乳糖， 分別溶于100 mL超純水。 每組蛋白-糖混合溶液分別分裝至7個(gè)離心管中， 在-80 ℃冰箱中預(yù)凍24 h后用真空冷凍干燥機(jī)凍干。 凍干后混合物的含水量為2.00%±0.05%。 凍干后的OVM-還原糖(OVM+R， 卵類粘蛋白-核糖； OVM+G， 卵類粘蛋白-葡萄糖； OVM+L， 卵類粘蛋白-乳糖)混合物樣品分別于過(guò)熱蒸汽處理室內(nèi)中進(jìn)行熱處理。 處理溫度為110和120 ℃。 處理時(shí)間為1， 2和3 min。 所處理的樣品密封后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 自由氨基含量測(cè)定

鄰苯二甲醛(OPA)法被用來(lái)檢測(cè)OVM樣品中自由氨基含量的變化， 從而評(píng)估過(guò)熱蒸汽處理后OVM的糖基化反應(yīng)程度。 測(cè)定前需要對(duì)OPA溶液進(jìn)行現(xiàn)配， 其方法如下： 準(zhǔn)確稱取4 mg OPA粉末于小燒杯中， 加入1 mL甲醇攪拌溶解， 依次加入2-巰基乙醇(100 μL)、 四硼酸鈉溶液(0.1 mol·L-1， 25 mL)、 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液(2.5 mL， 20%(W/V))， 充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆颍?然后轉(zhuǎn)移到容量瓶定容至50 mL。 將OVM樣品溶液與OPA于37 ℃反應(yīng)2 min， 在340 nm處測(cè)量吸光度。 以亮氨酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算蛋白質(zhì)中的自由氨基含量。 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.3 紫外光譜分析

用PBS緩沖液將OVM樣品稀釋至1 mg·mL-1， 采用紫外光譜儀(日立)對(duì)OVM樣品進(jìn)行紫外和可見(jiàn)光譜掃描， 掃描范圍為200～500 nm。 每個(gè)樣品掃描三次。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜分析

用PBS緩沖液將OVM樣品稀釋至0.2 mg·mL-1， 采用熒光光譜儀(日立F7000)進(jìn)行OVM樣品的內(nèi)源/同步/三維熒光光譜掃描[7]。 內(nèi)源熒光測(cè)定參數(shù)如下： 激發(fā)波長(zhǎng)290 nm， 掃描范圍300～400 nm， 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm， 掃描速度240 nm·min-1， 電壓400 V。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取3 mg不同過(guò)熱蒸汽處理的OVM糖基化樣品， 加入少量KBr粉末(蛋白、 KBr質(zhì)量比為1∶50)， 在日光燈的照射下研磨均勻， 經(jīng)過(guò)液壓壓片后， 采用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行掃描， 每個(gè)樣品的紅外光譜為連續(xù)掃描32次的平均圖譜[8]。

1.2.6 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI TOF MS)分析

糖基化反應(yīng)后OVM的分子量變化采用MALDI-TOF MS(4800 Plus MALDI-TOF/TOF Analyzer， AB Science， 美國(guó))的方法分析[9]。 OVM樣品以1∶100的比例溶解于蒸餾水中。 將芥子酸(5 mg·mL-1)溶于含有50%乙腈和0.1%TFA的溶液中制備基質(zhì)溶液， OVM溶液與基質(zhì)溶液以1∶1的比例混合， 室溫下干燥， 然后將混合物(2.0 μL)滴到MALDI目標(biāo)板上進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 自由氨基含量變化

蛋白質(zhì)的糖基化修飾一般是基于美拉德反應(yīng)的化學(xué)修飾， 即蛋白質(zhì)中的自由氨基(位于賴氨酸、 精氨酸的側(cè)鏈和蛋白質(zhì)N-末端氨基)與還原糖(如核糖、 葡萄糖、 半乳糖等)的羰基發(fā)生共價(jià)結(jié)合， 使糖分子以共價(jià)鍵的形式連接到蛋白質(zhì)的主鏈或者側(cè)鏈[10]。

糖基化修飾會(huì)影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)活性， 改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、 靜電荷和疏水性等， 進(jìn)而對(duì)其乳化、 起泡、 凝膠等功能特性以及消化性、 致敏性等營(yíng)養(yǎng)特性造成影響。 糖基化反應(yīng)的主要?dú)埢鶠榈鞍踪|(zhì)的自由氨基， 蛋白質(zhì)的自由氨基含量可以作為糖基化反應(yīng)程度的指標(biāo)[11-12]。

研究了過(guò)熱蒸汽處理過(guò)程中， 不同還原糖類型對(duì)OVM糖基化程度的影響， 結(jié)果如表1所示。 由于還原糖的結(jié)構(gòu)和類型對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化修飾具有較大的影響， 選擇五碳糖、 六碳糖和二糖(即核糖、 葡萄糖和乳糖)進(jìn)行比較研究。 結(jié)果表明， 三種還原糖在過(guò)熱蒸汽處理后均會(huì)促使OVM發(fā)生糖基化修飾， 參照樣品中自由氨基含量為19.97 mg·mL-1， 經(jīng)過(guò)核糖、 葡萄糖和乳糖修飾之后， 其自由氨基含量分別最低降為2.93， 5.04和6.69 mg·mL-1。 可以得出如下結(jié)論： 在過(guò)熱蒸汽的微糖瞬時(shí)加熱過(guò)程中OVM的糖基化修飾快慢程度為核糖>葡萄糖>乳糖， 與采用普通的低溫糖基化、 高溫加熱糖基化得出的結(jié)論一致[13]。

表1 不同條件過(guò)熱蒸汽處理下OVM糖基化產(chǎn)物的自由氨基含量Table 1 Free amino contents of the glycated OVM treated by superheated steamat different conditions

從過(guò)熱蒸汽的處理溫度上來(lái)看， 采用110和120 ℃處理是實(shí)現(xiàn)OVM糖基化修飾的最佳溫度。 溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致OVM和還原糖的混合物瞬間發(fā)生反應(yīng)形成聚合物， 不適用于蛋白質(zhì)的糖基化修飾改性。 研究了110和120 ℃過(guò)熱蒸汽處理1、 2和3 min后， OVM的自由氨基含量的變化。 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)， 不同條件下不同樣品的自由氨基均逐漸減少， 如OVM+R和OVM+G混合物在110 ℃下處理不同時(shí)間， 自由氨基含量均發(fā)生降低。 在處理1 min時(shí)， OVM的自由氨基含量相比空白對(duì)照樣品發(fā)生了顯著降低， 處理2 min后， 自由氨基的含量降低率減少。 然而當(dāng)處理時(shí)間為3 min時(shí)， 自由氨基含量基本不發(fā)生變化。 有趣的是， 當(dāng)溫度升高到120 ℃時(shí)， OVM的自由氨基含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)均發(fā)生了顯著的降低。 這可能與水分丟失和還原糖的替換有關(guān)系。 Allison研究認(rèn)為在蛋白質(zhì)失水過(guò)程中， 還原糖可以快速代替蛋白質(zhì)中的水分子所在的空間位置， 并且與蛋白質(zhì)上的自由氨基發(fā)生糖基化修飾[14]。

蛋白質(zhì)上的親水區(qū)域是還原糖發(fā)生反應(yīng)的主要位置， 并且通過(guò)還原糖的位置替換， 可以保證蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)不發(fā)生損壞。 當(dāng)溫度低時(shí)， 無(wú)法使蛋白質(zhì)中的深層次水分瞬間帶走， 不能實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的糖基化修飾， 而較高溫度可以帶走蛋白質(zhì)中的深層次結(jié)合水， 并使還原糖代替其空間位置， 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的糖基化修飾。

2.2 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)的色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸等的側(cè)鏈基團(tuán)和肽鍵對(duì)一定波長(zhǎng)范圍的紫外光具有一定的吸收， 使得蛋白質(zhì)在280 nm處有最大吸收峰[15]。 通過(guò)分析發(fā)色團(tuán)的吸收峰和強(qiáng)度變化， 紫外光譜可用于揭示蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[16]。 OVM中含有苯丙氨酸和酪氨酸， 不含色氨酸， 紫外光譜主要分析苯丙氨酸和酪氨酸殘基及微環(huán)境變化。

如圖1(a—f)分別所示， 經(jīng)過(guò)不同溫度和時(shí)間處理得到的OVM糖基化產(chǎn)物的紫外掃描光譜的峰形變化不大， 且未見(jiàn)顯著的波峰位移， 但是最大吸收峰強(qiáng)度具有一定的變化， 這說(shuō)明OVM分子的球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 與天然對(duì)照OVM相比， OVM-還原糖混合物經(jīng)過(guò)熱蒸汽處理后， 紫外吸收峰大部分強(qiáng)度降低， 可能是由于還原糖的修飾掩蓋了OVM上的發(fā)色基團(tuán)， 其中OVM+R在120 ℃處理2和3 min的樣品的紫外吸收峰強(qiáng)度降低最顯著， 說(shuō)明該條件下苯丙氨酸和酪氨酸被還原糖掩蓋的量較多； 有趣的是， 當(dāng)OVM+R在120 ℃下處理1 min后， 其產(chǎn)物的紫外吸收峰值相比天然OVM有些提高， 可能是由于瞬間120 ℃高溫將蛋白質(zhì)中結(jié)合的水分子蒸發(fā)， OVM分子發(fā)生適當(dāng)展開(kāi)， 同時(shí)被核糖修飾的位點(diǎn)還不夠多， 使其吸收峰增強(qiáng)。

圖1 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下OVM糖基化產(chǎn)物紫外光譜的變化OVM+R： 卵類粘蛋白-核糖； OVM+G： 卵類粘蛋白-葡萄糖； OVM+L： 卵類粘蛋白-乳糖； Control： 未過(guò)熱蒸汽處理(a): 卵類粘蛋白-核糖110 ℃處理； (b): 卵類粘蛋白-核糖120 ℃處理； (c): 卵類粘蛋白-葡萄糖110 ℃處理； (d): 卵類粘蛋白-葡萄糖120 ℃處理； (e): 卵類粘蛋白-乳糖110 ℃處理； (f): 卵類粘蛋白-乳糖120 ℃處理Fig.1 Ultraviolet spectra of glycated OVM treated by superheated steam at different processing temperature and time(a): Ovomucoid-ribose processed at 110 ℃; (b): Ovomucoid-ribose processed at 120 ℃; (c): Ovomucoid-glucose processed at 110 ℃; (d): Ovomucoid-glucose processed at 120 ℃; (e): Ovomucoid-lactose processed at 110 ℃; (f): Ovomucoid-lactose processed at 120 ℃

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光光譜一般被用來(lái)揭示蛋白質(zhì)熒光團(tuán)附近的構(gòu)象變化和分子微環(huán)境變化[17]。 OVM分子中有10個(gè)苯丙氨酸殘基以及6個(gè)酪氨酸殘基， 其中5個(gè)苯丙氨酸主要位于OVM的信號(hào)序列上， 另外5個(gè)苯丙氨酸主要位于蛋白質(zhì)序 列上； 6個(gè)酪氨酸殘基均位于OVM蛋白質(zhì)序列上， 其內(nèi)源熒光光譜主要表征苯丙氨酸附近的構(gòu)象變化及其周邊的微環(huán)境變化。

如圖2所示， 與天然對(duì)照OVM相比， OVM+還原糖經(jīng)過(guò)熱蒸汽處理后， 內(nèi)源熒光峰值顯著降低， 其中OVM+R在120 ℃下處理3 min時(shí)， 其內(nèi)源熒光降低率最大， 其次為OVM+G， OVM+L。 根據(jù)變化規(guī)律可以看出， 該變化趨勢(shì)與還原糖的糖基化反應(yīng)程度具有顯著相關(guān)性。 一方面， 蛋白內(nèi)部暴露的熒光團(tuán)去折疊導(dǎo)致熒光猝滅。 另一方面， 還原糖作為猝滅劑滲透入蛋白質(zhì)框架中， 與熒光團(tuán)反應(yīng)， 抑制其熒光發(fā)射[18]。

圖2 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下OVM糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜的變化 OVM+R： 卵類粘蛋白-核糖； OVM+G： 卵類粘蛋白-葡萄糖； OVM+L： 卵類粘蛋白-乳糖； Control： 未過(guò)熱蒸汽處理Fig.2 Intrinsic fluorescence spectra of glycated OVM under different superheated steam processing temperature and time

2.4 傅里葉紅外光譜分析

紅外光譜能靈敏地反映出肽鏈結(jié)構(gòu)的變化， 蛋白質(zhì)的紅外圖譜有幾組特征吸收譜帶： 酰胺Ⅰ、 酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ， 其波長(zhǎng)分別對(duì)應(yīng)1 700～1 600， 1 530～1 550和1 260～1 300 cm-1范圍[19]。 研究了過(guò)熱蒸汽處理過(guò)程中， 不同還原糖類型對(duì)OVM糖基化產(chǎn)物紅外圖譜的影響， 進(jìn)一步表征其官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。

由圖3可知， 經(jīng)過(guò)熱蒸汽處理后的OVM-還原糖混合物的紅外光譜圖均發(fā)生了較大的變化。 酰胺A在紅外光譜中的吸收峰出現(xiàn)在3 300 cm-1附近， 為N—H的伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生。 與對(duì)照OVM樣品相比， 經(jīng)過(guò)熱蒸汽處理后的OVM-還原糖糖基化產(chǎn)物在3 300 cm-1處均出現(xiàn)一個(gè)非常尖細(xì)的單峰， 說(shuō)明該酰胺種類為仲胺， 且由于受到糖基化修飾的影響， 該峰變得更窄。 這可能是由于N—H的含量減少或者發(fā)生反應(yīng)， 從而使N—H伸縮振動(dòng)頻率降低。

圖3(a) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽鄲理下卵類粘蛋白-核糖(OVM+R)糖基化產(chǎn)物的紅外光譜Fig.3(a) Infrared spectroscopy of OVM+R glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

圖3(b) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下卵類粘蛋白-葡萄糖(OVM+G)糖基化產(chǎn)物的紅外光譜Fig.3(b) Infrared spectroscopy of OVM+G glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

圖3(c) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下卵類粘蛋白-乳糖(OVM+L)糖基化產(chǎn)物的紅外光譜Fig.3(c) Infrared spectroscopy of OVM+L glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

OVM+R， OVM+G和OVM+L三個(gè)樣品在110和120 ℃條件下處理不同時(shí)間后， 其產(chǎn)物的紅外光譜圖也發(fā)生不同的變化， 分別如圖3(a, b, c)所示， OVM+R在120 ℃下處理2和3 min后， 紅外光譜在2 000～2 500 cm-1附近出現(xiàn)了很多雜峰， 且在指紋圖譜部分500 cm-1處也出現(xiàn)了較多雜峰， 分析認(rèn)為高溫反應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生降解或者糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物形成紅外光譜峰。

另外， OVM+G， OVM+L經(jīng)過(guò)過(guò)熱蒸汽處理后， 2 356 cm-1附近的峰逐漸減小并消失。

2.5 OVM糖基化產(chǎn)物的MALDI TOF MS分析

蛋白質(zhì)通過(guò)氨基殘基-羧基共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)與糖的相互作用， 即為基于美拉德反應(yīng)的糖基化修飾， 該修飾通過(guò)蛋白質(zhì)上賴氨酸、 精氨酸的側(cè)鏈氨基或者N末端氨基連接一個(gè)或兩個(gè)還原糖分子而達(dá)到糖基化修飾的目的， 會(huì)使蛋白質(zhì)分子量顯著增大。 同時(shí)， 由于美拉德反應(yīng)極易通過(guò)糖類之間的相互作用而使蛋白質(zhì)形成共聚物， 如二聚體、 三聚體或聚合物等， 因此若分析過(guò)熱蒸汽處理下蛋白質(zhì)和不同還原糖之間反應(yīng)的差異， 需進(jìn)行分子量或聚合物的深入研究。

為了更準(zhǔn)確地分析OVM在不同過(guò)熱蒸汽處理?xiàng)l件下的分子量變化情況， 采用MALDI TOF MS技術(shù)研究其分子量和聚集狀態(tài)變化， 結(jié)果如圖4所示。 圖4(a)為OVM+R在110和120 ℃過(guò)熱蒸汽處理1, 2和3 min后產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜， 可以看出， 單聚體的分子量已經(jīng)增加到29 149～29 446 Da之間， 基本處于29 kDa以上， 與天然分子量28 554 Da相比增加882 Da。 每個(gè)核糖修飾會(huì)使蛋白質(zhì)的分子量增加144 Da， 該結(jié)果說(shuō)明在單個(gè)OVM分子上存在6.1個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)； 經(jīng)過(guò)熱蒸汽處理后的所有樣品均出現(xiàn)了二聚體、 三聚體的質(zhì)譜峰， 說(shuō)明產(chǎn)生了較多的聚合物； 并且， 120 ℃處理與110 ℃相比， 樣品聚合物的峰值更大， 尤其是三聚體的峰值相對(duì)更大， 可見(jiàn)溫度越高越容易使OVM+R形成高聚物。

圖4(a) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下卵類粘蛋白-核糖(OVM+R)糖基化產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜Fig.4(a) MALDI TOF MS of OVM+R glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

圖4(b) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下卵類粘蛋白-葡萄糖(OVM+G)糖基化產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜Fig.4(b) MALDI TOF MS of OVM+G glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

圖4(c) 不同溫度、 時(shí)間過(guò)熱蒸汽處理下卵類粘蛋白-乳糖(OVM+L)糖基化產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜Fig.4(c) MALDI TOF MS of OVM+L glycation products treated by superheated steam at different processing temperature and time

圖4(b)為OVM+G在110和120 ℃過(guò)熱蒸汽處理1, 2和3 min后產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜， 可以看出， OVM+G糖基化產(chǎn)物中單分子的質(zhì)荷比主要以二價(jià)和三價(jià)形式存在， 分子量最大增加到29 565 Da， 與天然分子量28 554 Da相比增加1 056 Da， 每個(gè)葡萄糖修飾會(huì)使蛋白質(zhì)的分子量增加162 Da， 說(shuō)明在單個(gè)OVM分子上存在6個(gè)左右的糖基化修飾位點(diǎn)； 并且經(jīng)過(guò)過(guò)熱蒸汽處理的所有樣品均出現(xiàn)了二聚體、 三聚體的質(zhì)譜峰， 說(shuō)明產(chǎn)生了較多的聚合物； 但是二聚體三聚體的質(zhì)譜峰強(qiáng)度相差不大， 說(shuō)明該條件下OVM和葡萄糖之間的共聚程度是有限的。

圖4(c)為OVM+L在110和120 ℃過(guò)熱蒸汽處理1， 2和3 min后產(chǎn)物的MALDI TOF MS圖譜， 可以看出， OVM+L糖基化產(chǎn)物中單分子的質(zhì)荷比也主要以二價(jià)和三價(jià)形式存在， 分子量最大增加到28 908 Da， 與天然分子量28 554 Da相比增加656 Da， 每個(gè)乳糖修飾會(huì)使蛋白質(zhì)的分子量增加324 Da， 說(shuō)明在單個(gè)OVM分子上存在約2個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)； 有趣的是， 經(jīng)過(guò)過(guò)熱蒸汽處理的所有樣品出現(xiàn)的聚合體形式比較少， 其中OVM+L在110 ℃條件下加熱1 min時(shí)， 質(zhì)譜圖上僅僅出現(xiàn)一個(gè)小的二聚體質(zhì)譜峰， 無(wú)三聚體質(zhì)譜峰， 說(shuō)明在該條件下不會(huì)生成較多的聚合體。 另外， 很多研究發(fā)現(xiàn)， 熱處理可以誘導(dǎo)OVM的氧化或聚集， 增加分子量以及形成二聚體、 三聚體或聚合物， 通過(guò)該質(zhì)譜峰也證明經(jīng)過(guò)110 ℃的短時(shí)熱處理基本不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚合， 也證實(shí)核糖和葡萄糖與OVM產(chǎn)生的聚合體是因?yàn)樘腔磻?yīng)而促發(fā)的共價(jià)結(jié)合[20]。

3 結(jié) 論

采用不同溫度(110和120 ℃)、 時(shí)間(1， 2和3 min)過(guò)熱蒸汽對(duì)OVM-還原糖混合體系進(jìn)行處理， 通過(guò)化學(xué)測(cè)定和光譜學(xué)分析研究過(guò)熱蒸汽對(duì)OVM糖基化反應(yīng)的影響。 結(jié)果表明： 過(guò)熱蒸汽可以促進(jìn)OVM的微量糖糖基化反應(yīng)， 不同糖的糖基化反應(yīng)活性順序?yàn)楹颂?五碳糖)>葡萄糖(六碳糖)>乳糖(二糖)。 OVM-還原糖混合體系在過(guò)熱蒸汽處理后球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生展開(kāi)， 造成內(nèi)部發(fā)色氨基酸殘基的暴露。 過(guò)熱蒸汽處理過(guò)程中， 由于瞬間120 ℃高溫將蛋白質(zhì)中結(jié)合的水分子蒸發(fā)， OVM分子發(fā)生適當(dāng)展開(kāi)， 同時(shí)被還原糖補(bǔ)上水分蒸發(fā)的空位， 達(dá)到修飾蛋白質(zhì)的目的。 OVM-還原糖的微糖混合體系在反應(yīng)后產(chǎn)物生成二聚體、 三聚體和聚合物等， 核糖和葡萄糖與OVM產(chǎn)生的聚合體是由于糖基化反應(yīng)而促發(fā)的共價(jià)結(jié)合。