馥郁香型白酒三維熒光光譜特征分析研究

靳喜慶，殷 紅，諶松強，余 冰，高 燕，周 進

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209；3.酒鬼酒股份有限公司，湖南 吉首 416000；4.國家納米科學(xué)中心，北京 100190）

中國白酒具有悠久的歷史文化，因其獨特的發(fā)酵和蒸餾工藝，甘美醇厚的典型風格而享譽國內(nèi)外，地區(qū)的差異以及原料、輔料和釀造工藝的不同，形成了各自獨特的風格。白酒屬于成分復(fù)雜的混合物，其主體成分是水和乙醇，占體積分數(shù)為98%左右，另外還有2%左右的近千種決定酒體香型的微量風味物質(zhì)成分[1-3]，主要包括揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分，酒體的典型風格取決于微量風味成分的種類、含量及其比例關(guān)系。

中國不同香型的白酒都有著獨特的成分組成和風味特征，酒體中的成分復(fù)雜，目前行業(yè)主要是通過品酒師的感官品評和色譜風味分析對白酒的品質(zhì)和種類進行鑒定[4-5]，由此對品酒師的要求較高，且受人的感官和精神狀態(tài)影響較大，穩(wěn)定性和準確性難以保證。此外采用色譜技術(shù)進行定性、定量分析，存在檢測過程繁瑣，工作量大，且只能分析某些種類風味，缺少對風味的整體分析等缺點[1-3]。三維熒光光譜是一種快速分析的技術(shù)，具有靈敏度高、無需前處理、重現(xiàn)性好，具有整體分析等優(yōu)點，目前廣泛應(yīng)用于食品、藥物檢測等領(lǐng)域。在白酒領(lǐng)域，三維熒光光譜多用于鑒別不同香型[6-8]甚至不同品牌[7-11]以及不同年份酒[7，12-13]的研究，白酒中的微量風味物質(zhì)具有不同的三熒光光譜，導(dǎo)致不同香型酒體有著不同的指紋圖譜特征[13]，因此利用光譜分析法對白酒的種類和品質(zhì)進行鑒別成為近年來白酒鑒別領(lǐng)域研究的熱點。Aqualog熒光光譜儀采用吸光度和透射激發(fā)-發(fā)射矩陣（absorbance and transmission excitation emission matrix，A-TEEM）分子指紋技術(shù)，其是一種新的光學(xué)技術(shù)[14]，結(jié)合內(nèi)濾效應(yīng)校正，分析速度快，綜合成分分析更準確，最適用于溶液中含有熒光成分分析檢測。

馥郁香型白酒作為中國白酒十二大香型白酒之一，是湖南酒鬼酒公司將傳統(tǒng)的小曲釀造工藝和大曲釀造工藝相結(jié)合，依附獨特的地理環(huán)境、氣候條件等釀制而成，又以溶洞封藏自然老熟，獨創(chuàng)了馥郁香型白酒，其酒體風味具有“芳香秀雅、綿柔甘冽、醇厚細膩、后味怡暢、香味馥郁、酒體凈爽”的特點，造就了其“前濃、中清、后醬”的獨特口味特征[15-17]。本研究運用A-TEEM光譜技術(shù)對馥郁香型白酒進行測定和特征分析，提取特征熒光參數(shù)，通過熒光特征分析，建立馥郁香型白酒熒光特征參數(shù)，為馥郁香型白酒產(chǎn)品穩(wěn)定性和香型特征分析，實現(xiàn)酒體品質(zhì)提升，提供科學(xué)的檢測手段和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇（光譜純）：美國Sigma公司；乙酸、己酸、丁酸、乳酸、乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇、正丙醇、異丁醇、乙醛、乙縮醛（純度均＞98%）：國家標準物質(zhì)中心；馥郁香型三種白酒（湘泉、酒鬼及內(nèi)參）酒樣：酒鬼酒股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HORIBA Aqualog同步吸收-三維熒光光譜儀：美國HORIBA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

白酒樣品直接檢測。

將單體香風味物質(zhì)與體積分數(shù)為50%乙醇溶液配制成與酒體中相應(yīng)物質(zhì)濃度基本相同的溶液（55～65 μmol/L），室溫存放待檢測。

1.3.2 三維熒光光譜的檢測

本實驗采用200～500 nm的激發(fā)波長測定三種馥郁香型白酒樣品，以體積分數(shù)為50%的乙醇水溶液為背景，每隔5nm激發(fā)一次獲得一張圖譜，扣除背景后將得到的所有二維光譜圖轉(zhuǎn)換得到相應(yīng)的三維熒光光譜圖，研究馥郁香型三種白酒樣品在200～800 nm發(fā)射波長范圍的發(fā)射熒光光譜。

在中等增益和0.2 s積分時間下使用Horiba Scientific Aqualog同步吸收-三維熒光光譜儀，Aqualog將其數(shù)據(jù)采集功能直接與Origin 8.6軟件集成，在統(tǒng)計分析前對內(nèi)部濾波效應(yīng)（internal filtering effect，IFE）和瑞利掩蔽效應(yīng)的影響進行校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜檢測結(jié)果

2.1.1 乙醇水溶液

配制體積分數(shù)為50%的乙醇水溶液，進行三維熒光光譜檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 體積分數(shù)為50%乙醇水溶液三維熒光光譜Fig.1 Three dimensional fluorescence spectra of volume fraction 50% ethanol aqueous solution

由圖1可知，在激發(fā)波長212 nm左右有一熒光峰，其發(fā)射波長在290 nm左右，該熒光峰為其乙醇溶液的主熒光峰，此外在激發(fā)波長255 nm左右有一熒光峰，其發(fā)射波長在300 nm左右，該結(jié)果與文獻[8]的研究結(jié)果一致。

2.1.2 馥郁香型白酒

白酒的三維熒光光譜一般有一個或幾個熒光峰，且都有一個相對強度最大的較突出的熒光峰，稱其為主熒光峰，此時激發(fā)波長為最佳激發(fā)波長。湘泉、酒鬼和內(nèi)參系列三種類型馥郁香白酒的三維熒光光譜見圖2。

圖2 三種馥郁香型白酒的三維熒光光譜Fig.2 Three dimensional fluorescence spectra of three kinds of Fuyu-flavor Baijiu

由圖2可知，激發(fā)波長在200～300 nm范圍激發(fā)時，湘泉酒有著3個熒光峰，λex/λem分別在224 nm/305 nm、242 nm/426 nm和299 nm/408 nm左右；酒鬼酒有2個熒光峰，λex/λem分別在224 nm/305 nm和242 nm/426 nm左右；而內(nèi)參酒只有一個熒光峰，λex/λem 在227 nm/305 nm左右。激發(fā)波長在300 nm以上激發(fā)時均出現(xiàn)了兩個熒光峰，λex/λem分別在359 nm/433 nm和371 nm/436 nm左右，這兩個熒光峰強度都很高，是這三種類型酒的主熒光峰，三種類型的酒僅存在強度上的差異，表明同一品牌白酒其熒光光譜具有相似性。

從上述熒光光譜圖中提取3種酒的三維熒光特征參數(shù)，分別為對應(yīng)的激發(fā)波長、熒光峰波長和熒光強度，結(jié)果見表1。

表1 馥郁香型白酒三維熒光光譜特性Table 1 Three dimensional fluorescence spectrum characteristics of Fuyu-flavor Baijiu

2.1.3 主要微量成分

與馥郁香型白酒熒光峰有關(guān)系的風味物質(zhì)主要有四大酯類、四大酸類及異戊醇、正丙醇、異丁醇、乙醛和乙縮醛[17]，將主要單體香風味物質(zhì)按照1.3.1所述方法配制成相應(yīng)溶液，測定不同單體香風味物質(zhì)溶液的三維熒光光譜并提取特征熒光參數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 主要風味物質(zhì)熒光光譜特性Table 2 Fluorescence spectrum characteristics of main flavor substances

酒體中風味物質(zhì)對其三維熒光光譜有著較大的影響，尤其是酯類物質(zhì)對酒體整體熒光光譜影響最大，其次是酸類物質(zhì)、醛酮類和醇類物質(zhì)[18]，這些風味物質(zhì)均具有較強的呈香呈味作用，其中有機酸是主要的呈味物質(zhì)，酯類物質(zhì)主要是呈香物質(zhì)，醇類物質(zhì)主要呈現(xiàn)香與味的調(diào)和作用，醛類物質(zhì)主要使酒體芳香[19]。

2.2 分析討論

2.2.1 白酒產(chǎn)生熒光的機理

由熒光峰產(chǎn)生的機理可知[20]，有機化合物分子能發(fā)射熒光，其結(jié)構(gòu)中必須要具有熒光基團（如C、O、N、S等形成的雙鍵或三鍵）或者熒光助色團（如-OH、-NH2、-COOH、-OR等），當光束照射到分子上，熒光分子吸收外界高能量輻射后導(dǎo)致內(nèi)部電子能級躍遷，重新釋放出低能量的長波光。

白酒的主體成分主要是乙醇與水，另外含有占據(jù)體積分數(shù)2%左右的微量風味有機物，這些微量成分主要有酯類、酸類、醇類與醛類等[1-3]，是白酒香味和風格特征的基礎(chǔ)物質(zhì)。白酒中的風味物質(zhì)，受激發(fā)輻射的熒光強度與有機物的分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，熒光較強的物質(zhì)通常具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)，具有剛性平面結(jié)構(gòu)以及取代基通常為供電子基團等特點。有機物受激輻射后產(chǎn)生π→π*或n→π*躍遷，然后經(jīng)過非輻射躍遷后，發(fā)生π*→π或π*→n躍遷進而產(chǎn)生熒光。其中π→π*躍遷在受激輻射時吸光的摩爾系數(shù)是n→π*的上百倍，且π→π*躍遷的壽命是n→π*躍遷的百分之一，所以發(fā)生π→π*躍遷的熒光效率較高。分子中共軛雙鍵結(jié)構(gòu)體系越大則電子的離域性越大，具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu)的有機物熒光較強。剛性平面結(jié)構(gòu)的分子可以減少分子的振動，因此可以減少該分子與溶液中其他分子的碰撞來降低能量損失，產(chǎn)生較強的熒光。此外有供電子基團的分子，這類基團包括-OH、-OR、-CN、-NH2等，它們會形成p-π共軛來擴大共軛體系，具有該種基團的分子也會產(chǎn)生較強的熒光。酒體中的乙醇分子與水分子本身不產(chǎn)生熒光[21]，當乙醇和水混合時乙醇分子與水分子間形成氫鍵，締合形成分子團簇，該團簇分子具有一定的剛性，可以吸收200～300 nm波長范圍的紫外光并發(fā)射出熒光[22]。白酒中的微量成分主要有酯類、酸類、醇類與醛類等，這些有機物中含有-OH、-COR、C=O、COOH等基團，這些基團是供電子體系，并且能和乙醇-水體系有氫鍵作用，形成更大的共軛體系，使熒光峰位紅移。

由于中國白酒釀酒原料的種類與含量不同，釀酒工藝各有特色，不同香型有其特有的香味物質(zhì)成分和量比關(guān)系[23-25]，因此具有不同的三維熒光特征。

2.2.2 體積分數(shù)為50%乙醇水溶液三維熒光光譜分析

據(jù)研究分析，乙醇和水均為非熒光物質(zhì)，但是當乙醇與水混合后，激發(fā)波長在200～300 nm范圍的紫外光并向外發(fā)射熒光[18]，其原因是乙醇和水分子間通過氫鍵締合作用，形成具有一定剛性的締合分子即團簇分子，該團簇分子可以吸收紫外光并發(fā)射熒光。

研究結(jié)果表明，體積分數(shù)為50%乙醇溶液有λex/λem（212 nm/290 nm）和λex/λem（255 nm/300 nm左右）兩個熒光峰，且λex/λem（212 nm/290 nm）熒光峰為主熒光峰[8，26]，該熒光峰是一個乙醇分子與2個水分子形成的乙醇-水團簇分子，該團簇分子吸收紫外光向外發(fā)射熒光，該團簇分子質(zhì)量子產(chǎn)率最高，溶液中該團簇分子的濃度也最大，故發(fā)射波長290 nm熒光的強度最大，為主熒光峰。而λex/λem（255 nm/300 nm）熒光峰是由一個乙醇和5個水分子通過氫鍵形成的另一種團簇分子的熒光峰。乙醇分子和水分子之間通過分子間氫鍵形成大的分子體系，在激發(fā)光照射的條件下吸收能量發(fā)出熒光[27]。

2.2.3 馥郁香型白酒三維熒光光譜分析

馥郁香型白酒中有湘泉、酒鬼和內(nèi)參三大品類白酒，其不同品類酒體在其激發(fā)波長（λex）200～500 nm范圍內(nèi)均可發(fā)出熒光，其熒光峰特征既有相似性又有區(qū)別。

根據(jù)乙醇溶液的研究結(jié)果，馥郁香型三大系列酒體中在波長300 nm以下的短波長激發(fā)時，均產(chǎn)生λex/λem（227 nm/305 nm）左右的熒光峰，與體積分數(shù)為50%乙醇溶液λex/λem（212 nm/290 nm）左右熒光峰相比較，白酒溶液的此處熒光峰λex/λem（227 nm/305 nm）左右具有一定的紅移現(xiàn)象，這是由于酒體溶液中含有多種微量風味物質(zhì)，其與乙醇-水團簇分子形成新的締合成更大分子簇，且微量風味成分之間也會發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，酒體中其他風味物質(zhì)與乙醇和水分子簇共同形成氫鍵作用，導(dǎo)致分子簇越來越大，分子團增大分子團簇的結(jié)構(gòu)更加剛性，體系能量有所降低，形成的新團簇分子熒光峰的熒光波長紅移，而乙醇-水的特性熒光峰的峰強度減弱[28]，這些新的締合分子簇體系能量降低，使得熒光峰發(fā)生紅移，是酒體中多種微量風味成分和水及乙醇綜合作用的結(jié)果[8]。文獻[29]研究表明，隨著大曲酒的年份的不同，乙醇團簇分子增大，在波長307 nm處乙醇的特征峰強度將隨著陳化年份顯著減弱。分析三大品類馥郁香型白酒乙醇λex/λem（224 nm/305 nm）左右的特征熒光峰強度表明，湘泉酒中熒光峰強度最高，酒體的酒體柔和感適中，而酒鬼酒在該處熒光峰減弱，其酒體柔和感較強，內(nèi)參酒此處熒光峰強度最弱，酒體達到最佳的綿順、柔和的口感，與口味口感品評相符合。

湘泉酒和酒鬼酒中產(chǎn)生λex/λem（242 nm/426 nm）左右的熒光峰，其相比于λex/λem（224 nm/305 nm）左右的乙醇熒光峰強度低很多。根據(jù)與表2中酒體主要微量風味單體熒光峰相比較[18]，該熒光峰形成的原因是酒體中乙醇-水及酒體中微量酯類物質(zhì)締合形成新的分子簇熒光峰[28，30]。文獻[31]研究發(fā)現(xiàn)，當250 nm左右的近紫外光激發(fā)乙醇溶液時，由乙醇分子中雜原子基團C-OH 中的孤對電子產(chǎn)生395 nm較強的熒光發(fā)射峰。白酒中酯類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有C=O、C-O-C、OH等產(chǎn)生熒光基團，其與酒體中乙醇-水分子簇在氫鍵的作用下，參與形成新的分子團簇，導(dǎo)致熒光峰值波長紅移，從而產(chǎn)生λex/λem（242 nm/426 nm）熒光峰。而內(nèi)參酒中沒有該熒光峰，主要原因是因為內(nèi)參酒所用的基酒儲存時限較長，酒體儲存過程中存在酯降酸增的動態(tài)變化過程[32-34]，酒體中酯類物質(zhì)含量逐漸減少，微量酯類風味物質(zhì)與乙醇-水形成的分子簇越來越小，酯-酸-乙醇-水多種單體物質(zhì)協(xié)同作用形成了新的分子團簇，在內(nèi)參酒主要呈現(xiàn)在λex/λem（359 nm/433 nm）和λex/λem（371 nm/436 nm）左右長波長的熒光峰。

湘泉酒系列酒體中λex/λem（299 nm/408 nm）左右熒光峰，酒鬼和內(nèi)參系列酒體中則不出現(xiàn)此熒光峰，此處的的熒光峰為乙醇特征熒光峰的二級衍射峰，在湘泉酒中乙醇熒光峰λex/λem（224 nm/305 nm）強度最強，有二級衍射峰，而酒鬼及內(nèi)參酒中較弱，不顯示該熒光峰的二級衍射峰[28，30]。

不同系列馥郁香型白酒在激發(fā)波長300 nm以下產(chǎn)生的熒光峰的不同反映了馥郁香型白酒在儲存過程中乙醇-水團簇分子的差別，其熒光峰的不同體現(xiàn)著三種酒在口感柔和度上的差異，而激發(fā)波長在300 nm以上波長激發(fā)時卻有著較強的相似性。

三種馥郁香型白酒三維熒光光譜中，在激發(fā)波長300 nm以上均有兩個熒光峰，分別在λex/λem（359 nm/433 nm）和λex/λem（371 nm/436 nm）左右，兩個熒光峰強度基本一致，且兩個熒光峰強度在湘泉、酒鬼及內(nèi)參酒體中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，這是因為同屬于一種類型的酒其風味物質(zhì)相似，因此具有相似的光譜特征峰。

白酒酸類物質(zhì)和酯類物質(zhì)熒光光譜對白酒整體三維熒光光譜有著較大的影響，尤其是酯類物質(zhì)對白酒整體三維熒光光譜的影響最大[18]。根據(jù)與酒體微量風味單體熒光峰相比較，推測該處兩個熒光峰主要是由酒體中的主要的酸類物質(zhì)與乙醇-水形成新的分子簇而產(chǎn)生，此外疊加熒光光譜影響最大的酯類以及醛酮類、醇類等風味物質(zhì)的熒光綜合作用的結(jié)果[18，28，30]。馥郁香型白酒中含有多種微量風味物質(zhì)成分，在儲存過程中，具有一定的陳化作用，主要包含氧化、酯化和水解反應(yīng)，醇經(jīng)過氧化變成醛類物質(zhì)，醛經(jīng)過氧化變成酸類物質(zhì)，酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)之間存在酸酯平衡[32-34]，隨著酒體儲存陳化過程變化導(dǎo)致酒體中的有機風味成分相對含量的變化，因此形成具有較高含量的有機酸類，同時形成有別于其他香型的四大酯類（己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯）的獨特的量比關(guān)系，己酸乙酯和乙酸乙酯近乎平衡的比例關(guān)系，較高含量的丁酸乙酯，適量的高級醇及醛酮類構(gòu)成了馥郁香型白酒獨特的風味特征[9]，這些物質(zhì)都具有較強的呈香呈味作用，是決定馥郁香型白酒的口味口感和香型的主要物質(zhì)，化合物中含有的OH、C=O、OR、COOH、SH等產(chǎn)生熒光基團或熒光助色基團可使酒體在適當?shù)牟ㄩL激發(fā)下發(fā)出熒光，同時也可以與醛類或酮類及芳香類化合物反應(yīng)產(chǎn)生可發(fā)出熒光的風味物質(zhì)，形成馥郁香型白酒獨特的三維熒光光譜特征，因此馥郁香型白酒λex/λem（359 nm/433 nm）和λex/λem（371 nm/436 nm）左右兩個熒光峰恰好反映了馥郁香型白酒的熒光光譜特征，這兩個熒光峰可歸為酸類物質(zhì)疊加酯類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)的熒光峰。

馥郁香型白酒光譜圖中的兩個熒光峰與三大基礎(chǔ)香型白酒熒光峰有一定的相似度，其中λex/λem（371 nm/436 nm）的熒光峰與清香型、濃香型白酒熒光峰[6，9，11]較為相似，體現(xiàn)著風味兼具清香醇甜、窖香濃郁、綿甜柔和、協(xié)調(diào)的“前濃、中清”的特點，而λex/λem（359 nm/433 nm）處熒光峰與醬香型成品酒主熒光峰λex/λem（350 nm/430 nm）基本一致[35]，說明馥郁香型白酒醇厚細膩、后味怡暢“后醬”的特點。與三大基礎(chǔ)香型白酒熒光光譜只有其中的一個熒光峰相比較，馥郁香型白酒出現(xiàn)兩個特征熒光峰，體現(xiàn)著酒體風味物質(zhì)的濃郁、均衡程度，體現(xiàn)著馥郁香型白酒的獨特風味特征。

3 結(jié)論

馥郁香型白酒中，λex/λem（224 nm/305 nm）反映的是游離乙醇-水的團簇分子特征熒光峰，λex/λem（242 nm/426 nm）反映的是酯類物質(zhì)與乙醇-水形成新的分子簇熒光峰，該兩個熒光峰主要體現(xiàn)著三種酒體口味口感的柔和度以及香氣微小差異。λex/λem（359 nm/433 nm）和（371 nm/436 nm）兩個強度幾乎一致的熒光峰，是多種微量風味組分熒光峰疊加綜合作用的結(jié)果，反映著酒體的香氣和風味整體質(zhì)量品質(zhì)，體現(xiàn)著馥郁香型白酒獨特典型、風味馥郁的特征，是馥郁香型白酒的特征熒光峰。

馥郁香型白酒三維熒光光譜包含了豐富的物質(zhì)組成信息，具有其獨特的熒光光譜特性，可為后續(xù)馥郁香型白酒風味特征分析、品質(zhì)穩(wěn)定性控制及提升提供科學(xué)化的量化標準理論依據(jù)。