百里香酚體外抗偽狂犬病毒活性評(píng)價(jià)及其作用方式

宋天浩，龐蓮鳳，陳凌霜，鄧惠丹，徐志文，朱 玲，任志華，鄧俊良，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.四川省涼山彝族自治州甘洛縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 甘洛 616850)

偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科(alpha-Herpesvirinae)水痘病毒屬(Varicellovirus)的成員[1]。我國(guó)在1950年首次報(bào)道豬PRV感染。目前，PRV感染已成為對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最大的疾病之一[2-3]。國(guó)內(nèi)外主要通過接種疫苗的方法來預(yù)防PRV感染，但該病毒擁有潛伏感染機(jī)制，會(huì)增大疫苗免疫的難度。2011年，在我國(guó)使用Bartha-61疫苗免疫的豬場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)一種新的PRV變種[4]，這就意味著需要研發(fā)新的疫苗。然而，疫苗研發(fā)始終落后于病毒的變異。目前，人用抗病毒西藥在食品動(dòng)物上已全面禁用。因此，尋找和開發(fā)有效的抗病毒藥物是防治PRV感染的必要手段。

牛至精油具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)活性[5-7]，其中，百里香酚(thymol)是牛至精油的主要活性成分之一。研究表明，百里香酚對(duì)包括單純皰疹病毒(HSV)、牛皰疹病毒(BoHV)在內(nèi)的多種皰疹科病毒具有良好的抗病毒活性[7-8]；然而，關(guān)于百里香酚對(duì)PRV的抗病毒活性目前還未見相關(guān)報(bào)道。為此，特圍繞百里香酚對(duì)PRV的抗病毒活性，以及可能的抗病毒作用方式等開展研究，旨在評(píng)價(jià)其作為抗PRV藥物的潛力，在為豬偽狂犬病防控提供新方法的同時(shí)，也為抗皰疹病毒藥物的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

百里香酚(純度>98%)，上海源葉生物科技有限公司；倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、PRV，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心徐志文教授惠贈(zèng)；新生牛血清，內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DNA提取試劑盒)，天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix(PCR預(yù)混液)，北京博邁德基因技術(shù)有限公司；PrefectStartTMGreen qPCR SuperMix(qPCR預(yù)混液)，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

Forma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱、SorvallTMST-16臺(tái)式高速離心機(jī)、Varioskan Flsah全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo；T100型PCR儀、CFX-96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad；DS-U3型倒置顯微鏡，日本尼康公司；CJ-2F型超凈工作臺(tái)，江蘇蘇州凈化設(shè)備公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 PRV半數(shù)組織培養(yǎng)物感染量(TCID50)的測(cè)定

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞，制備均勻的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL的規(guī)格接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)接毒。使用細(xì)胞維持液(高糖DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、青鏈霉素按98∶2∶1的比例混合制成)梯度稀釋PRV病毒液(10-1～10-9)，共計(jì)9個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)6個(gè)細(xì)胞孔重復(fù)，每孔接種100 μL PRV病毒液，于37 ℃、5% CO2條件下在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞板中的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)(圖1)，使用Reed-Muench法(RM法)計(jì)算病毒的TCID50(表示病毒的滴度大小)。

圖1 正常的BHK-21細(xì)胞(左)與感染PRV后的BHK-21細(xì)胞(右)的形態(tài)(200×)

1.3.2 無水乙醇對(duì)BHK-21無細(xì)胞毒性、對(duì)PRV無抑制作用的體積分?jǐn)?shù)確定

以不同體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇-細(xì)胞維持液作為試驗(yàn)組(無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、8%、6%、4%、2%)，以細(xì)胞維持液(無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為0)作為正常對(duì)照組，在每個(gè)無水乙醇體積分?jǐn)?shù)下設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每孔加100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h后棄去孔中液體，用PBS緩沖液洗滌3次，然后向每孔加入110 μL混合了CCK-8試劑的細(xì)胞維持液(細(xì)胞維持液與CCK-8按10∶1的體積比混合)，避光、繼續(xù)孵育30min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值(D450)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，確定不會(huì)對(duì)BHK-21的活性產(chǎn)生顯著影響的無水乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍，并據(jù)此進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

將病毒液與上一步確定的對(duì)BHK-21活性無明顯影響的無水乙醇-細(xì)胞維持液進(jìn)行等體積混合，使得混合液中病毒液的濃度為TCID50的100倍。上一步試驗(yàn)確定體積分?jǐn)?shù)不超過4%的無水乙醇對(duì)BHK-21細(xì)胞活性無明顯影響，以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)無水乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為4%、3%、2%、1%作為試驗(yàn)組。同時(shí)，設(shè)置病毒對(duì)照組(CK-1E，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)為0)和正常細(xì)胞對(duì)照組(CK-2E，僅有等體積的細(xì)胞維持液，病毒液、無水乙醇體積分?jǐn)?shù)均為0)。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2條件下吸附1.5 h，吸棄剩余液體，用PBS緩沖液洗滌3次，再向每孔分別加入100 μL混有對(duì)應(yīng)體積分?jǐn)?shù)無水乙醇(4%、3%、2%、1%、0)的細(xì)胞維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，使用CCK-8(操作同上)測(cè)定D450，計(jì)算溶劑對(duì)PRV的抑制率，確定對(duì)BHK-21、PRV都無抑制作用的無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3 百里香酚對(duì)BHK-21細(xì)胞活性的影響

使用細(xì)胞維持液梯度稀釋百里香酚，以百里香酚質(zhì)量濃度分別為256、128、64、32、16、8 μg·mL-1的作為試驗(yàn)組(通過預(yù)試驗(yàn)確定)，設(shè)置不加百里香酚的正常對(duì)照組。同1.3.2節(jié)操作計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率，得出百里香酚的最大無害濃度(MNTC)，并使用RM法計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

以細(xì)胞相對(duì)存活率和IC50來確定百里香酚對(duì)BHK-21細(xì)胞無毒性作用的質(zhì)量濃度(結(jié)果為64 μg·mL-1)，并據(jù)此進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.4 百里香酚對(duì)PRV的抑制作用

將病毒液與用細(xì)胞維持液稀釋的百里香酚進(jìn)行等體積混合，使得混合液中病毒液的終濃度為TCID50的100倍，百里香酚的質(zhì)量濃度分別為64、32、16、8、4、2 μg·mL-1，以其作為試驗(yàn)組。同時(shí)，設(shè)置病毒對(duì)照組(CK-1，接種100 μL濃度為TCID50100倍的PRV，不添加百里香酚)和正常細(xì)胞對(duì)照組(CK-2，不接種病毒液，不添加百里香酚)。使用RM法計(jì)算百里香酚的半數(shù)有效濃度(EC50)，并結(jié)合1.3.3節(jié)得出的百里香酚的IC50，計(jì)算百里香酚的治療指數(shù)(TI)，以初步評(píng)價(jià)百里香酚體外抗PRV的活性。

1.3.5 百里香酚對(duì)PRV滴度的影響

試驗(yàn)操作分組同1.3.4節(jié)，接毒后培養(yǎng)至72 h，將細(xì)胞板中的細(xì)胞、液體反復(fù)凍融3次，以釋放出全部的病毒粒子，分別收集每一個(gè)濃度梯度下所有細(xì)胞孔中的剩余液體，按1.3.1節(jié)方法測(cè)定各濃度梯度所對(duì)應(yīng)的病毒液的TCID50。

1.3.6 百里香酚對(duì)PRV在BHK-21中一步生長(zhǎng)曲線的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇抗PRV效果最明顯的百里香酚質(zhì)量濃度(試驗(yàn)結(jié)果為64 μg·mL-1)作為試驗(yàn)組(T)設(shè)定的質(zhì)量濃度，對(duì)照組(CK)中PRV病毒液的濃度為TCID50的100倍。

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞制備均勻的細(xì)胞懸液，以每孔1.0 mL的規(guī)格接種于12孔板中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，吸棄孔中培養(yǎng)液。每孔先接種1.0 mL PRV病毒液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中吸附1.5 h后，吸棄孔中液體，使用PBS緩沖液洗滌3次。試驗(yàn)組加入1.0 mL 64 μg·mL的百里香酚溶液，對(duì)照組加入1.0 mL的細(xì)胞維持液，開始記時(shí)，然后分別于2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h(共計(jì)10個(gè)時(shí)間點(diǎn))收集孔中剩余液體，測(cè)定TCID50。以試驗(yàn)組TCID50值(以0.1 mL作為基本體積單元)的負(fù)常數(shù)對(duì)數(shù)值為y軸，以各時(shí)間點(diǎn)為x軸，繪制各組的PRV體外生長(zhǎng)曲線。

1.3.7 百里香酚體外抗PRV的作用特征研究

試驗(yàn)共設(shè)置病毒對(duì)照組(CK-V)、空白對(duì)照組(CK-B)、試驗(yàn)組(百里香酚的質(zhì)量濃度分別為64、32、16 μg·mL-1，分別簡(jiǎn)記為T1、T2、T3)。其中，病毒對(duì)照組接種等體積的100倍TCID50的PRV病毒液，空白對(duì)照組僅加入等體積的細(xì)胞維持液。

(1)取生長(zhǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞六孔板，試驗(yàn)組先加相應(yīng)質(zhì)量濃度的百里香酚于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h后，吸棄孔中剩余液體，每孔使用PBS緩沖液洗滌；然后，試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組統(tǒng)一接種PRV病毒液2 mL，空白對(duì)照組接種2%細(xì)胞維持液2 mL，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h(即吸附培養(yǎng))，完成病毒吸附過程，吸棄孔中剩余液體，用PBS緩沖液洗滌，每孔加入2%細(xì)胞維持液2 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，研究百里香酚的體外抗PRV是否涉及預(yù)防保護(hù)作用。

(2)按照病毒對(duì)照組、空白對(duì)照組與試驗(yàn)組的設(shè)置，取5個(gè)5 mL離心管，加入相應(yīng)的藥劑，每管2 mL，其中，試驗(yàn)組中百里香酚與PRV病毒液等體積混合，病毒對(duì)照組中2%細(xì)胞維持液與PRV病毒液等體積混合。將離心管置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。取生長(zhǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞六孔板，每孔對(duì)應(yīng)加入上面孵育后的混合液，吸附培養(yǎng)。完成后，吸棄孔中剩余液體，用PBS緩沖液洗滌，每孔加入2%細(xì)胞維持液2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，研究百里香酚的體外抗PRV是否涉及直接殺滅作用。

(3)取生長(zhǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞六孔板，置于4 ℃冰箱中預(yù)冷30 min(溫度低導(dǎo)致病毒停留在吸附穿入階段)，吸棄孔中剩余液體，使用于4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌。按1.3.7節(jié)(2)中各處理設(shè)置于對(duì)應(yīng)孔中加入相應(yīng)的藥劑，每孔2 mL，繼續(xù)在4 ℃吸附培養(yǎng)。完成后，吸棄剩余液體，每孔加入2%細(xì)胞維持液2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，研究百里香酚體的外抗PRV是否涉及抗病毒侵入作用。

(4)取生長(zhǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞六孔板，向試驗(yàn)組和病毒對(duì)照組孔中先加入PRV病毒液2 mL，向空白對(duì)照組孔中接種2%細(xì)胞維持液2 mL，吸附培養(yǎng)1.5 h后，吸棄孔中剩余液體，用PBS緩沖液洗滌，然后向試驗(yàn)組中加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的百里香酚，向病毒對(duì)照組和空白對(duì)照組中加入細(xì)胞維持液，均為2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，研究百里香酚的體外抗PRV是否涉及抗病毒胞內(nèi)增殖作用。

經(jīng)過上述處理后，按照DNA提取試劑盒說明書方法提取DNA樣品，檢測(cè)DNA純度，選取合格樣品于-20 ℃保存，待測(cè)。利用本實(shí)驗(yàn)室基于PRV-gE基因建立的SYBR染料FQ-PCR檢測(cè)方法(絕對(duì)熒光定量)，計(jì)算不同樣品中PRV-gE基因的拷貝數(shù)以反映不同樣品中PRV的病毒量，從而判斷在不同處理方式下PRV在BHK-21中的增殖情況和百里香酚體外抗PRV可能的作用方式。

FQ-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix，10 μL；上、下游引物，各1 μL；模板，2 μL；ddH2O，6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s預(yù)熱；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)40次。上、下游引物序列(5′→3′)分別為CGTGTTCTTTGTGGCGGTG、AGCGTGGCGGTAAAGTTCTC。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV的TCID50測(cè)定結(jié)果

將10-1～10-9濃度梯度的PRV病毒稀釋液接種至細(xì)胞后，連續(xù)培養(yǎng)72 h，每24 h觀察并記錄一次CPE情況(表1)。依據(jù)RM法，計(jì)算出PRV的TCID50為10-6.636mL-1。

表1 PRV TCID50的測(cè)定統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 不影響B(tài)HK-21活性、不抑制PRV的無水乙醇體積分?jǐn)?shù)

在無水乙醇對(duì)BHK-21生長(zhǎng)的抑制試驗(yàn)中，當(dāng)無水乙醇在無水乙醇-細(xì)胞維持液中的體積分?jǐn)?shù)為4%及以上時(shí)，其與正常對(duì)照組的吸光值存在顯著(P<0.05)差異(表2)。據(jù)此，確定無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)不超過4%。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)無水乙醇對(duì)BHK-21生長(zhǎng)的抑制結(jié)果

在無水乙醇對(duì)PRV引起的BHK-21病變抑制效果試驗(yàn)中，僅當(dāng)無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，其與CK-2E的吸光值存在顯著(P<0.05)差異(表3)。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定后續(xù)試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組、對(duì)照組的無水乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)不超過2%。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)無水乙醇對(duì)PRV引起的BHK-21病變的抑制結(jié)果

2.3 百里香酚對(duì)BHK-21相對(duì)存活率和IC50的影響

使用CCK-8法測(cè)定百里香酚對(duì)BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(表4)，確定64 μg·mL-1為百里香酚對(duì)BHK-21的MNTC(相對(duì)存活率>90%)，并據(jù)此設(shè)計(jì)后續(xù)試驗(yàn)藥物的濃度梯度。另外，經(jīng)測(cè)定，百里香酚對(duì)BHK-21的IC50為(212.789±1.652)μg·mL-1。

表4 不同質(zhì)量濃度百里香酚對(duì)BHK-21相對(duì)存活率的影響

2.4 百里香酚對(duì)PRV的抗病毒活性

使用CCK-8法檢測(cè)百里香酚對(duì)PRV導(dǎo)致BHK-21出現(xiàn)CPE的抑制作用(表5)，其中，64 μg·mL-1的百里香酚對(duì)PRV具有最強(qiáng)的抑制作用。經(jīng)測(cè)算，百里香酚對(duì)PRV的EC50為(30.710±0.303)μg·mL-1，TI為6.929，說明百里香酚屬于高效低毒類抗PRV藥物，具有一定的開發(fā)潛力。

表5 不同質(zhì)量濃度百里香酚對(duì)PRV引起的BHK-21病變的抑制結(jié)果

2.5 百里香酚對(duì)PRV毒力的影響

在8～64 μg·mL-1范圍內(nèi)，百里香酚可以劑量依賴性地顯著(P<0.05)降低PRV在BHK-21中增殖后的毒力，且以64 μg·mL-1的作用效果最佳(表6)，與前文CCK-8的檢測(cè)結(jié)果一致。

表6 不同質(zhì)量濃度百里香酚作用后BHK-21中生長(zhǎng)的PRV的TCID50值的負(fù)常用對(duì)數(shù)值[-lg(TCID50)]

2.6 百里香酚對(duì)PRV體外一步生長(zhǎng)曲線的影響

對(duì)照組和試驗(yàn)組的-lg(TCID50)在前48 h都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)(圖2)，但試驗(yàn)組在0～4 h階段未出現(xiàn)CPE。48 h后，對(duì)照組和試驗(yàn)組的-lg(TCID50)均趨于穩(wěn)定，其中，對(duì)照組在48 h后TCID50穩(wěn)定于10-6.5mL-1左右，百里香酚組 TCID50維持于10-4.8mL-1左右，說明百里香酚具有抑制PRV在BHK-21中生長(zhǎng)的作用。

圖中的-lg(TCID50)值均以0.1 mL作為基本體積單元計(jì)算得到。

2.7 百里香酚體外抗PRV的作用方式

使用qPCR方法檢測(cè)不同的加藥、病毒感染方式下百里香酚對(duì)PRV在BHK-21不同感染階段的抑制效果(圖3)，其中，各處理下空白對(duì)照組的拷貝數(shù)均為0，不在圖中展示。

A，抗病毒胞內(nèi)增殖作用；B，直接殺滅作用；C，抗病毒侵入作用；D，預(yù)防保護(hù)作用。“*”表示與CK-V相比差異顯著(P<0.05)。

抗病毒胞內(nèi)增殖作用組中：不同質(zhì)量濃度(64、32、16 μg·mL-1)百里香酚試驗(yàn)組的PRV-gE基因拷貝數(shù)均顯著(P<0.05)低于病毒對(duì)照組。直接殺滅作用組中：64、32 μg·mL-1百里香酚試驗(yàn)組的PRV-gE基因拷貝數(shù)與病毒對(duì)照組差異顯著。在預(yù)防保護(hù)和抗病毒浸入兩種作用方式中，不同藥物濃度組與病毒對(duì)照組之間均無顯著性差異。

由此推測(cè)，16～64 μg·mL-1百里香酚抗PRV的主要作用方式是在抗病毒胞內(nèi)增殖階段發(fā)揮作用。同時(shí)，32～64 μg·mL-1的百里香酚還具有直接殺滅PRV的作用。

3 討論

3.1 百里香酚的體外抗PRV活性與評(píng)價(jià)方法

在藥物體外抗病毒試驗(yàn)中，受試藥物的溶解性和溶媒類型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有重要影響。一般地，水溶性較差的藥物通常會(huì)使用有機(jī)溶劑作為溶媒，如甲醇、乙醇、二甲基亞砜等，當(dāng)此類物質(zhì)在溶劑中占比過高時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞、病毒的生存(或活性)產(chǎn)生一定的抑制作用[9]。因此，本試驗(yàn)在進(jìn)行百里香酚體外抗PRV試驗(yàn)前，先檢測(cè)了所選溶媒——無水乙醇對(duì)BHK-21細(xì)胞的毒性和對(duì)PRV的抑制作用。結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)低于2%的無水乙醇對(duì)本試驗(yàn)選用的BHK-21無細(xì)胞毒性，對(duì)PRV無明顯的抑制作用。在本研究的后續(xù)試驗(yàn)中，均控制無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)不超過2%，以排除無水乙醇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可能造成的影響。

學(xué)界將可以維持90%以上細(xì)胞活力的藥物濃度定義為最大無害濃度，又稱最大工作濃度[10]。在研究中，藥物濃度梯度設(shè)置的最大值不宜超過最大工作濃度。本試驗(yàn)使用CCK-8法檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度的百里香酚對(duì)BHK-21細(xì)胞活性的影響。當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度為256、128 μg·mL-1時(shí)，BHK-21細(xì)胞的相對(duì)存活率分別僅為41.934%、72.165%，均低于90%；當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度為64 μg·mL-1時(shí)，BHK-21細(xì)胞的相對(duì)存活率為92.200%，且隨著百里香酚質(zhì)量濃度的進(jìn)一步降低，BHK-21細(xì)胞的相對(duì)存活率進(jìn)一步上升。這一結(jié)果表明，當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度為0～64 μg·mL-1時(shí)，其對(duì)BHK-21細(xì)胞的毒性小于10%。由此確定，本試驗(yàn)中百里香酚的最大工作濃度為64 μg·mL-1。后續(xù)試驗(yàn)均以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)百里香酚的質(zhì)量濃度梯度，以探究其可能的劑量依賴性。

百里香酚具有多樣的生物學(xué)活性。在抗病毒活性方面，研究表明，百里香酚對(duì)單純皰疹病毒(HSV)、牛皰疹病毒(BoHV)[7-8]、貓杯狀病毒(FCV)、鼠諾如病毒(MNV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、猿類免疫缺陷病毒(SIV)等均具有不同程度的抑制作用[11-14]。其中HSV、BoHV與PRV同屬于皰疹病毒科，所以百里香酚在抗PRV病毒的研究領(lǐng)域具有一定的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，百里香酚具有優(yōu)秀的體外抗PRV活性。當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度為64 μg·mL-1時(shí)，對(duì)PRV具有顯著的抑制作用，相對(duì)抑制率為78.881%，并且能將PRV的-lg(TCID50)值由6.545±0.079降低至4.775±0.121。而且，這種抑制效果與百里香酚的質(zhì)量濃度表現(xiàn)出劑量依賴性。

評(píng)價(jià)藥物體外抗病毒活性常用的3項(xiàng)指標(biāo)為IC50、EC50、TI。IC50指細(xì)胞活性維持于50%的受試藥物濃度，其值越高，說明該藥物的毒性越低。EC50指由病毒導(dǎo)致的CPE被抑制50%的受試藥物濃度，值越低，說明抑制效果越好。TI是IC50與EC50的比值，一般認(rèn)為當(dāng)藥物的TI>2時(shí)，該藥物對(duì)病毒屬于高效低毒類藥物；1≤TI≤2時(shí)，歸類為低毒有效類藥物；TI<1時(shí)，認(rèn)為該藥物無開發(fā)利用價(jià)值[9]。Pilau等[8]基于該評(píng)價(jià)體系，研究一種提取自墨西哥牛至草的精油對(duì)單純皰疹病毒一型(HSV-1)和牛皰疹病毒二型(BoHV-2)的抗病毒活性，使用MTT法檢測(cè)該牛至精油對(duì)HSV-1、BoHV-2的TI分別為13.1和9.7。本試驗(yàn)利用該評(píng)價(jià)體系，對(duì)百里香酚的體外抗PRV活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，百里香酚對(duì)BHK-21的IC50為(212.789±1.652 )μg·mL-1，對(duì)PRV的EC50為(30.710±0.303) μg·mL-1，TI為6.929。據(jù)TI判斷，百里香酚對(duì)于PRV屬于高效低毒類藥物，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

通過繪制病毒的一步生長(zhǎng)曲線，可以檢測(cè)病毒在細(xì)胞中的生長(zhǎng)復(fù)制情況。姚子璇[15]分離鑒定了一株偽狂犬病毒分離株，并繪制了該毒株的一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，該病毒滴度于接種后的0～36 h有明顯的上升，之后呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，至60 h時(shí)雖保持穩(wěn)定但表現(xiàn)出微弱的下降趨勢(shì)。方超等[16]繪制了經(jīng)典PRV RA株、分離株的一步生長(zhǎng)曲線，得出了相似的結(jié)論。本文采用類似的方法繪制了百里香酚作用下PRV于BHK-21中的一步生長(zhǎng)曲線。在64 μg·mL-1百里香酚作用下：0～4 h無法測(cè)定出PRV的病毒滴度；4～60 h，一步生長(zhǎng)曲線出現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明病毒開始快速增殖；60～72 h，-lg(TCID50)值逐漸穩(wěn)定，且明顯低于病毒對(duì)照組。結(jié)果說明，百里香酚能夠顯著地抑制PRV于BHK-21細(xì)胞中的生長(zhǎng)增殖，降低了PRV的病毒滴度。

3.2 百里香酚體外抗PRV的作用特征

病毒的復(fù)制周期大致可以分為以下幾個(gè)步驟：(1)成熟的病毒粒子吸附并且穿入宿主細(xì)胞；(2)mRNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，病毒蛋白質(zhì)合成；(3)新病毒粒子的組裝和出芽。上述病毒復(fù)制過程均可成為抗病毒藥物的直接作用靶點(diǎn)，對(duì)作用靶點(diǎn)的抑制會(huì)降低病毒的傳染性。一般地，判斷藥物對(duì)病毒的作用機(jī)制，通常通過控制添加藥物時(shí)間的方法來進(jìn)行初步的分析，這也是研究藥物于細(xì)胞間/細(xì)胞內(nèi)抑制特性時(shí)最廣泛、最常見的方法[17]。根據(jù)病毒的復(fù)制周期特征和前期試驗(yàn)結(jié)果，本研究將百里香酚體外抗PRV的作用特征分為4種類型——直接殺滅作用、預(yù)防保護(hù)作用、抗病毒侵入作用(即對(duì)病毒的吸附穿入階段作用)、抗病毒胞內(nèi)增殖作用，每種類型分別對(duì)應(yīng)于一種藥物添加時(shí)間和處理方式。采用FQ-PCR方法，通過測(cè)定各處理下樣品中PRV-gE基因拷貝數(shù)的變化，來判斷百里香酚對(duì)PRV的具體作用方式。

在直接殺滅作用研究中，百里香酚直接與病毒粒子作用，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育1 h時(shí)，以未加入百里香酚的PRV病毒液為病毒對(duì)照組，將上述病毒液接種于BHK-21細(xì)胞中，72 h后提取DNA，使用qPCR方法檢測(cè)病毒中相關(guān)基因的拷貝數(shù)，以此判斷百里香酚是否在預(yù)先處理中滅活了PRV。結(jié)果表明，較高質(zhì)量濃度(32～64 μg·mL-1)的百里香酚能夠在體外直接滅活部分PRV。在預(yù)防保護(hù)作用、抗病毒侵入作用研究中，不同的處理方式和百里香酚添加時(shí)間均不能降低PRV中相關(guān)基因的拷貝數(shù)，說明百里香酚并不是通過保護(hù)作用或阻止PRV吸附穿入BHK-21細(xì)胞來發(fā)揮抗病毒活性的。在抗病毒胞內(nèi)增殖作用研究中，將未經(jīng)過任何處理的PRV直接接種至BHK-21細(xì)胞，再加入不同濃度的百里香酚與接毒后的BHK-21細(xì)胞相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在該處理模式下，16～64 μg·mL-1的百里香酚均能顯著降低病毒PRV-gE基因拷貝數(shù)，說明百里香酚能夠在PRV進(jìn)入BHK-21細(xì)胞后的胞內(nèi)增殖階段發(fā)揮抗病毒作用。

S?kmen等[7]將主成分為香芹酚、百里香酚的牛至精油醇提取物以不同時(shí)間加入接種了HSV-1的MDBK細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制HSV-1的胞內(nèi)增殖；Zhang等[18]使用類似的處理模式，研究了百里香酚的同分異構(gòu)體——香芹酚對(duì)HSV-1的抗病毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香芹酚能抑制該病毒的胞內(nèi)增殖。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)，牛至精油能夠劑量依賴性地抑制HSV-2的胞內(nèi)增殖。Sharifi-Rad等[20]將百里香酚(40～640 μg·mL-1)直接與HSV-1混合處理2 h，之后接種至細(xì)胞中，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組形成的斑塊劑量依賴性地顯著少于對(duì)照組，表明百里香酚能夠劑量依賴性地直接殺滅HSV-1病毒粒子。上述研究結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果類似，但由于試驗(yàn)用到的病毒和細(xì)胞不同，具有顯著抑制作用的藥物劑量表現(xiàn)出一定的差異。

綜上所述， 16～64 μg·mL-1的百里香酚有良好的體外抗PRV活性，能夠劑量依賴性地抑制由PRV導(dǎo)致的BHK-21病變，并顯著地降低PRV的病毒滴度，抑制PRV于BHK-21中的生長(zhǎng)復(fù)制。百里香酚主要是通過抗病毒胞內(nèi)增殖發(fā)揮抗PRV活性作用的，且32～64 μg·mL-1的百里香酚還能夠直接殺滅PRV病毒粒子。百里香酚對(duì)PRV屬于高效低毒類抗病毒藥物，具有開發(fā)成為新型抗偽狂犬病毒感染防控藥物的潛力。