桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化及其風(fēng)味特征

季明月，龔建剛，羅建華，2，BIMAL CHITRAKAR，敖常偉，檀建新

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.懷來(lái)縣貴族莊園葡萄酒有限公司，河北 張家口 075400）

桑椹（Morus nigra）含有很多營(yíng)養(yǎng)素和有益健康的生物活性化合物[1]，如褪黑素[2]、多酚化合物[3]、白藜蘆醇[4]、類黃酮[5]、花青素[6]和多糖[7]。這些化合物具有多種生物活性，包括抗血栓[8]、抗氧化劑[9]、抗肥胖[10]、抗炎[11]、抗癌[12]和神經(jīng)保護(hù)[13]。因此，桑椹自古以來(lái)就被用作傳統(tǒng)藥物[14]，被中國(guó)藥典認(rèn)定為藥食同源的食物。新鮮桑椹常被加工成桑椹干、桑椹膏及桑椹酒等，桑椹酒因含有豐富的生物活性物質(zhì)而深受消費(fèi)者青睞。

桑椹酒和干紅葡萄酒顏色相似，都含有大量花青素[15-16]。但因?yàn)樵喜煌?，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味各有不同，兩者都含有豐富的抗氧化物，葡萄酒中的胡蘿卜素高于桑椹酒，但桑椹酒中的花青素、白藜蘆醇、黃酮類化合物、硒元素、維生素E等均要高于葡萄酒[17]。LIU S J等[18]研究表明，適宜的酵母菌株能減少桑椹酒發(fā)酵過(guò)程中花青素的降解、顏色褐變及抗氧化活性，提高果酒風(fēng)味和品質(zhì)。左勇等[19]以酵母A2為菌種釀造桑椹果酒，打漿時(shí)添加了適量的水、亞硫酸溶液和葡萄糖，在SO2質(zhì)量濃度為70 mg/L、糖度為170 g/L，接種量9%、26 ℃條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵。赫連遠(yuǎn)坤等[20]采用1%鹽水、1%淀粉液和自來(lái)水清洗赤霞珠葡萄，破碎后的葡萄漿接種活化后的活性干酵母ST進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明，用1%鹽水或1%淀粉液清洗能去除較多的霉菌和細(xì)菌，提高釀酒葡萄潔凈度，有利于葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)乙醇及風(fēng)味復(fù)雜性。OBERHOLSTERA等[21]研究明膠、蛋清和錯(cuò)流微濾對(duì)葡萄酒酚類物質(zhì)的影響，以期通過(guò)工藝改善提高葡萄酒品質(zhì)。

桑椹酒風(fēng)味獨(dú)特，但較葡萄酒顯得單一。此外，桑椹酒產(chǎn)量和認(rèn)同度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葡萄酒。如將桑椹和葡萄釀造成桑椹葡萄復(fù)合果酒，則可以集兩者之優(yōu)勢(shì)于一體，開發(fā)一款獨(dú)具特色的復(fù)合果酒。本研究以桑椹品種黑珍珠與釀酒葡萄品種赤霞珠為原料，制備桑椹葡萄復(fù)合果酒。探討不同比例桑椹葡萄混合發(fā)酵的果酒的風(fēng)味特征，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)篩選其最佳發(fā)酵工藝，并通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)分析桑椹葡萄復(fù)合果酒的香氣成分特征，研制桑椹葡萄復(fù)合果酒，可滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)保健、口感風(fēng)味、時(shí)尚生活的不同需求，為工業(yè)化生產(chǎn)桑椹葡萄復(fù)合果酒提供技術(shù)支撐。同時(shí)可在一定程度上解決桑椹深加工問題，豐富果酒產(chǎn)品，促進(jìn)果酒市場(chǎng)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹（品種黑珍珠）：河北金桑園農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；葡萄（品種赤霞珠）：市售；安琪牌果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；白砂糖（食品級(jí)）：市售；無(wú)水檸檬酸、偏重亞硫酸鉀（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-300-X電子天平：廈門百倫斯電子科技有限公司；HH-4恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；STARTER 3100 pH計(jì)：上海奧豪斯儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；安捷倫7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）系統(tǒng)：美國(guó)安捷倫公司；TG-WAXMS毛細(xì)管柱：美國(guó)賽默飛世爾（中國(guó)）科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑椹葡萄復(fù)合果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：將桑椹、葡萄清洗，瀝干水分后，按照一定質(zhì)量比混合、破碎，根據(jù)預(yù)設(shè)復(fù)合果酒15%vol的酒精度加糖，混合破碎好的果汁中加入偏重亞硫酸鉀（以SO2計(jì)，終濃度為60 mg/L）和300 mg/L的果膠酶，于10 ℃培養(yǎng)箱中浸漬16 h。稱取1 g的活性干酵母于燒杯中，再加入10 mL的桑葚葡萄混合果汁，在37 ℃條件下活化30～40 min，活化酵母接入混合果汁中，于23 ℃條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵（測(cè)定酒液比重，保持穩(wěn)定不變即為酒精發(fā)酵結(jié)束），酒精發(fā)酵結(jié)束后，用紗布進(jìn)行皮渣分離，在18 ℃條件下進(jìn)行20 d蘋果酸-乳酸發(fā)酵，30 mg/L蛋清粉下膠處理酒樣2 d，過(guò)濾澄清得到原酒，酒裝瓶后于水浴鍋70 ℃殺菌10 min，取出冷卻即為桑椹葡萄復(fù)合果酒成品。

1.3.2 桑椹與葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒品質(zhì)的影響

試驗(yàn)設(shè)6組處理，其桑椹與葡萄質(zhì)量比分別為1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、0∶1，編號(hào)為1～6號(hào)，每組3個(gè)重復(fù)。分別測(cè)定1～6號(hào)桑椹葡萄復(fù)合果酒樣品的初始糖含量及發(fā)酵參數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，確定最佳桑椹和葡萄質(zhì)量比。

1.3.3 分析檢測(cè)

酒精度、酸度、總糖、可溶性固形物等理化指標(biāo)與感官指標(biāo)的測(cè)定，參考國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 桑椹葡萄復(fù)合果酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of mulberry-grape compound fruit wine

1.3.4 桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：在確定桑椹和葡萄質(zhì)量比后，分別設(shè)置酵母添加量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，發(fā)酵時(shí)間為3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，發(fā)酵溫度為17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)，考察酵母添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒酒精度及感官評(píng)分的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵影響較大的發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）作為自變量，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2。

表2 桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine

1.3.5 復(fù)合果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析

通過(guò)固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）提取桑椹葡萄復(fù)合果酒樣品中的香氣化合物，采用GC-MS法進(jìn)行分析[23]。

樣品前處理：將含有7.5 mL桑椹葡萄復(fù)合果酒樣品、2 g NaCl和25 μL三辛醇內(nèi)標(biāo)的混合物放入18 mL樣品瓶中。將50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS萃取頭插入由聚四氟乙烯-硅隔膜密封的樣品瓶中，在40 ℃下溫浴52 min萃取，解吸6 min，使用安捷倫7890A-5975C GC/MS系統(tǒng)進(jìn)行揮發(fā)性香氣化合物分析[24]。

氣相色譜條件：TG-WAXMS毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He），流速為1 mL/min。升溫程序：在50 ℃的初始溫度下保持2 min，隨后，以3 ℃/min的速率將溫度升高至80 ℃，然后以5 ℃/min的速率再升高至230 ℃，230 ℃下保持6 min[25]。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：4 min；增益系數(shù)：1；質(zhì)量掃描范圍在20～450 m/z[26]。

定性定量方法：使用安捷倫科技公司5977A化學(xué)站軟件確定每個(gè)峰的面積。美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后參考相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光譜圖進(jìn)行化合物定性分析。采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，進(jìn)行定量分析[27]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2010和SPSS.20.0軟件，顯著性分析采用最小顯著差別（least significant dif ference，LSD）和Duncan（D）進(jìn)行假定方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑椹和葡萄質(zhì)量比的確定

2.1.1 不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒初始糖含量及發(fā)酵參數(shù)的影響

不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒理化指標(biāo)的影響見表3。由表3可知，隨著葡萄果實(shí)比例的增加，初始糖含量呈上升趨勢(shì)（90～250.3 g/L），表明葡萄比桑椹含糖量更高。為了將各組的初始糖含量調(diào)整為等量（250 g/L），在樣品1號(hào)至5號(hào)之間向各組添加適量蔗糖。酒精發(fā)酵結(jié)束后，1號(hào)樣品的酒精度為11.20%vol，是六組中的最低值，這意味著某些糖或其他有機(jī)物無(wú)法通過(guò)酵母完全轉(zhuǎn)化為酒精。桑椹和葡萄的質(zhì)量比越低，發(fā)酵后剩余的總糖越低。另一方面，1號(hào)樣品的可溶性固形物含量和總酸顯著高于其他組，其他各組樣品差異不大。考慮到白砂糖的添加量、桑椹葡萄復(fù)合果酒的風(fēng)味等因素，選擇最適桑椹和葡萄質(zhì)量比為1∶4。

表3 不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒初始含糖量及發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on the initial sugar contents and fermentation parameters of mulberry-grape compound fruit wine

2.1.2 不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒感官品質(zhì)的影響

不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒感官品質(zhì)的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，1號(hào)樣品色澤深紫，較澄清，桑椹香氣濃郁豐富，揮發(fā)酸高，愉悅度弱一些，感官評(píng)分為79分。2號(hào)樣品酒體澄清，有光澤，無(wú)沉淀，桑椹香氣濃郁豐富，感官評(píng)分為82分。3號(hào)樣品色澤深紫，較澄清，口感平衡，回味較好，感官評(píng)分為83分。4號(hào)樣品色澤深紫，比較澄清，口感爽凈，平衡協(xié)調(diào)，回味長(zhǎng)，感官評(píng)分為90分。5號(hào)樣品色澤紫紅，澄清透明，桑椹香氣濃郁，口感單薄，回味短，感官評(píng)分為87分。6號(hào)樣品色澤紫紅，澄清晶亮入口時(shí)酸，掩蓋了一部分香氣成分，整體表現(xiàn)略有欠缺，余味短，感官評(píng)分為82分。因此，最適桑椹和葡萄質(zhì)量比為1∶4。綜上，桑椹和葡萄質(zhì)量比1∶4最適合釀制桑椹葡萄復(fù)合果酒。

圖1 不同桑椹和葡萄質(zhì)量比對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of different mass ratio of mulberry and grape on sensory score of mulberry-grape compound fruit wine

2.1.3 桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在桑椹和葡萄質(zhì)量比為1∶4條件下，分別設(shè)置酵母接種量為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，發(fā)酵時(shí)間為3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，發(fā)酵溫度為17 ℃、20 ℃、23 ℃、26 ℃、29 ℃進(jìn)行復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 酵母接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒酒精度和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum (A),fermentation temperature (B)and time (C) on the alcohol content and sensory score of mulberry-grape compound fruit wine

由圖2A可知，在接種量為1.0%～2.0%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之增高；在接種量為2%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分最高，分別為13.2%vol和92分；在接種量為2.0%～3.0%時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之下降。因此，最適接種量為2.0%。由圖2B可知，在發(fā)酵溫度為17～23 ℃時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之增高；在發(fā)酵溫度為23 ℃時(shí)，酒精度和感官評(píng)分最高，分別為13.6%vol和92分；在發(fā)酵溫度為23～29 ℃時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之下降。因此，最適發(fā)酵溫度為23 ℃。由圖2C可知，在發(fā)酵時(shí)間為3～9 d時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之增高；在發(fā)酵時(shí)間為9 d時(shí)，酒精度和感官評(píng)定分?jǐn)?shù)最高，分別為13.6%vol和92分；在發(fā)酵時(shí)間為9～13 d時(shí)，酒精度和感官評(píng)分隨之下降。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為9 d。

2.2 桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析及模型方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵影響較大的發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）作為自變量，以酒精度（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of mulberry-grape compound fruit wine

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到酒精度和感官評(píng)分對(duì)發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）及發(fā)酵時(shí)間（C）的多元二次回歸方程：

由表5可知，模型顯著（P＜0.001），酒精度失擬項(xiàng)不顯著（P=0.292 9＞0.05），感官評(píng)分失擬項(xiàng)不顯著（P=0.133 8＞0.05），表明該模型在研究區(qū)域擬合度較好。以酒精度為響應(yīng)值，模型決定系數(shù)R2=0.955 8，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.899 0，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，模型決定系數(shù)R2=0.950 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.885 9，說(shuō)明該回歸模型具有較好的擬合水平。由P值可知，一次項(xiàng)B，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)酒精度影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A、C，二次項(xiàng)B2對(duì)酒精度影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)A2、C2對(duì)感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)B2對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，桑椹葡萄復(fù)合果酒中各因素對(duì)酒精度影響順序?yàn)榻湍附臃N量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間；各因素對(duì)感官評(píng)分影響順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間=酵母接種量＞發(fā)酵溫度。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析，桑椹與葡萄質(zhì)量比為1∶4時(shí)，最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度24.27 ℃、酵母接種量2.20%、發(fā)酵時(shí)間8.60 d。在此條件下，桑椹葡萄復(fù)合果酒的酒精度的理論值為13.63%vol，感官評(píng)分的理論值為93.59分?？紤]到實(shí)際操作可行性，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為：發(fā)酵溫度24 ℃、酵母接種量2.0%、發(fā)酵時(shí)間9 d，對(duì)桑椹葡萄復(fù)合果酒發(fā)酵工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得優(yōu)化后的酒精度實(shí)際值為13.60%vol，感官評(píng)分實(shí)際值為94分，與預(yù)測(cè)值相差不大，驗(yàn)證結(jié)果與響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明優(yōu)化工藝可行。

2.2.3 桑椹葡萄復(fù)合果酒中揮發(fā)性化合物種類及含量

通過(guò)固相微萃?。⊿PME）提取桑椹葡萄酒樣品中的香氣化合物，并通過(guò)GC-MS進(jìn)行分析[23]，結(jié)果見表6。由表6可知，桑椹葡萄復(fù)合果酒共檢出50種揮發(fā)性化合物，包括醇類20種、酯類9種、酸類10種、醛類3種、酚類3種、酮類1種、醚類2種、烯烴類2種。酯類如乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸異戊酯等具特有的水果香氣[29]；醇類如乙醇、苯乙醇、三辛醇等具有強(qiáng)烈的酒精味道和花香[30]；酸類如琥珀酸具有輕微的咸味和苦味[31]；醛類如苯乙醛具有能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的類似甜酒的風(fēng)味[32]；萜烯化合物能產(chǎn)生類似香橙花和玫瑰花的香氣，有時(shí)候也會(huì)有鳳梨的香氣[33]。這些香氣成分共同構(gòu)成了桑椹葡萄發(fā)酵酒獨(dú)特的香氣與風(fēng)格。

表6 桑椹葡萄復(fù)合果酒的香氣成分測(cè)定結(jié)果及香氣特征Table 6 Determination results of aroma compounds and aroma characteristics of mulberry-grape compound fruit wine

續(xù)表

3 結(jié)論

釀造桑椹葡萄復(fù)合果酒的最佳桑椹葡萄質(zhì)量比為1∶4。采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵工藝條件為：酵母接種量2.0%，發(fā)酵溫度24 ℃，發(fā)酵時(shí)間9 d。在此條件下，酒精度為13.6%vol，感官評(píng)分為90分。桑椹葡萄復(fù)合果酒共檢出50種香氣化合物，包括醇類20種、酯類9種、酸類10種、醛類3種、酚類3種、酮類1種、醚類2種、烯烴類2種。其中醇類、酯類和酸類是桑椹葡萄復(fù)合果酒的香氣成分。這款果酒的特點(diǎn)是色澤深紫色，果香穩(wěn)定和諧，酒體醇厚，回味豐富。桑椹葡萄復(fù)合果酒的開發(fā)將滿足人們對(duì)口感、風(fēng)味和保健的追求，為解決桑椹的貯藏問題和深加工提供可行的策略。