李 巖,孫康娜,宋曉凡,陳富章,金蘇宇,院珍珍,2
(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810000;2.青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,青海 西寧 810000)
青稞俗稱裸大麥,是青藏高原一種常見的糧食作物,具有耐高寒、適應(yīng)性強、高產(chǎn)早熟等特點[1]。特殊的生長環(huán)境賦予其高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖的三高兩低特性和富含β-葡聚糖等功能因子,具有很好的營養(yǎng)功能[2-3],對預(yù)防心血管疾病、糖尿病等有顯著作用[4-6]。
淀粉是青稞的重要組成成分,被人體分解利用,供給人體熱量,因其消化性不同可以分為快消化淀粉(ready digestible starch,RDS)、慢消化淀粉(slowly digestible starch,SDS)和抗性淀粉(resistant starch,RS)三類[7],快消化淀粉是指在小腸中20 min內(nèi)消化;慢消化淀粉是指能在小腸中20~120 min內(nèi)才能被消化;抗性淀粉指120 min內(nèi)無法在小腸中消化吸收。研究表明,快消化淀粉(RDS)作為日常主食的主要成分,使人很快饑餓增加食欲從而容易引致肥胖和影響脂類新陳代謝;慢消化淀粉(SDS)能夠緩慢釋放能量,可以保證飯后血糖的相對穩(wěn)定,避免造成大幅度的波動引起血糖過高和過低的現(xiàn)象,有益于高血壓、糖尿病和肥胖患者病情調(diào)控[8-9];抗性淀粉(RS)作為一種新型的膳食纖維功能性成分,具有降低血糖指數(shù)、改善結(jié)腸微生物群落的潛力[10]。因此,降低快消化淀粉含量、提高慢消化淀粉含量的研究對人體健康有重要意義。青稞淀粉約占青稞籽粒干質(zhì)量的70%左右[11],而快消化淀粉占青稞淀粉的75.17%、慢消化淀粉占青稞淀粉的12.32%、抗性淀粉占青稞淀粉的12.51%??赏ㄟ^改性而改變淀粉的分子結(jié)構(gòu)、功能性、消化性等,制備成為青稞改性淀粉,從而擴大青稞淀粉的應(yīng)用[12]。改變淀粉結(jié)構(gòu)的方法有物理法、化學(xué)法、酶法、加工處理(如常壓、高壓蒸煮)等[13]。其中酶法具有效率高、能耗低、污染小等特點[14]。安攀宇[15]使用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶制備青稞慢消化淀粉,發(fā)現(xiàn)當(dāng)普魯蘭酶添加量為200 U時慢消化淀粉含量達到最高值;張倩倩[11]利用酶解法制備青稞慢性消化淀粉并進行工藝優(yōu)化研究,發(fā)現(xiàn)普魯蘭酶的添加量200 U,酶解時間10 h,冷藏回生時間1 d,淀粉含量為15%時,慢消化淀粉含量為32.72%。GURAYA H S等[16]利用普魯蘭酶處理大米淀粉,結(jié)果顯示慢消化淀粉的含量增加。
本試驗以青稞為原料,通過普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉(RDS)含量??疾烀柑砑恿?、料液比、酶解時間和溫度對青稞快消化淀粉含量的影響,在單因素試驗基礎(chǔ)上,以快消化淀粉含量為響應(yīng)值,選擇3因素3水平的響應(yīng)面試驗探究最優(yōu)酶解工藝參數(shù),以期拓展青稞在食品上的應(yīng)用,推進高原健康食品的發(fā)展,對糖尿病患者及需低糖飲食人群有一定意義。
萌芽黑青稞粉:青海漢和生物科技股份有限公司;普魯蘭酶(酶活力1 500 U/mL)、糖化酶(酶活力10萬U/mL):江蘇銳陽生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活力70萬U/mL):上海吉至生化科技有限公司;豬胰α-淀粉酶(酶活力50 U/mg):合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;淀粉含量檢測試劑盒(50T/48S):北京索萊寶科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
LR10M 冷凍離心機、H/T16MM 臺式高速離心機:湖南赫西儀器裝備有限公司;THZ-82恒溫振蕩器:國華實業(yè)有限公司;UV-1780紫外可見分光光度計:島津儀器(蘇州)有限公司;Tissuelyser-96多樣品組織研磨儀:上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;MULTISKAN Sky全波長酶標儀:北京平利洋經(jīng)貿(mào)有限公司。
1.3.1 改性青稞粉的制備
酶改性青稞粉的制備參照王曉燕等[17]的方法并稍作修改。稱取6 g青稞粉溶于50 mL蒸餾水中并攪拌至無結(jié)塊,加入1 mol/L pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液(稱取6.804 g乙酸鈉蒸餾水溶解,后加入1.118 5 mL的乙酸,定容至50 mL)5 mL,加入一定量的普魯蘭酶和α-葡萄糖苷酶,然后立即放入溫度為65 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩器中振蕩2 h。反應(yīng)結(jié)束后立即將錐形瓶放入沸水浴鍋里滅酶10 min,冷卻后將錐形瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到300 mL離心管中再入50 mL洗滌液,放入離心機中5 000 r/min離心10 min,得到的固體用蒸餾水洗滌并再次離心,重復(fù)2次,結(jié)束后取出沉淀物于平皿中,然后放入60 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干,采用多樣品組織研磨儀,在50 Hz條件下研磨70 s,備用。
1.3.2 酶添加量的確定
普魯蘭酶添加量的確定:在酶解溫度為65 ℃、料液比為1∶10(g∶mL)、酶解時間為2 h條件下,分別測定普魯蘭酶添加量分別為120 U/g、160 U/g、200 U/g、240 U/g、280 U/g時的快消化淀粉含量。
α-葡萄糖苷酶添加量的確定:選取最適普魯蘭酶添加量,在酶解溫度為65 ℃、料液比為1∶10(g∶mL)、酶解時間為2 h條件下,分別測定葡萄糖苷酶添加量分別為20 U/g、50 U/g、80 U/g、110 U/g、140 U/g時的快消化淀粉含量。
1.3.3 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗
在選出最佳雙酶添加量基礎(chǔ)上,以快消化淀粉含量為評價指標,分別考察酶解溫度(45℃、55℃、65℃、75℃、85℃)、酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)及料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶mL))對酶解效果的影響。
1.3.4 酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗
在單因素試驗基礎(chǔ)上,固定普魯蘭酶添加量為200 U/g,酶解溫度為55 ℃,選取α-葡萄糖苷酶添加量(A)、料液比(B)以及酶解時間(C)3個因素為自變量,以快消化淀粉含量(Y)為響應(yīng)值,采用3因素3水平中心組合設(shè)計,優(yōu)化酶降解青稞快消化淀粉酶解工藝,響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平見表1。
表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design
1.3.5 總淀粉含量的測定
采用淀粉含量檢測試劑盒法測定總淀粉(total starch,TS)含量。以0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.04mg/mL、0.03mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標,以波長620 nm處測定的吸光度值(y)為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線,得到標準曲線線性回歸方程:y=12.192x+0.002,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2??偟矸酆坑嬎愎饺缦拢?/p>
式中:TS為總淀粉含量,mg/g;X為測得的吸光度值對應(yīng)標準曲線的葡萄糖含量,mg/mL;D為稀釋倍數(shù)1 000;V為提取后總體積,mL;W為稱取的改性青稞粉質(zhì)量,g。1.11為換算系數(shù)。
1.3.6 快消化淀粉含量的測定
快消化淀粉含量體外模擬消化參考繆銘等[18]的方法,并稍作修改。稱取酶改性青稞粉0.2 g,加入0.2 mol/L pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液(稱取6.804 g乙酸鈉蒸餾水溶解,后加入1.118 5 mL的乙酸,定容至250 mL)15 mL,同時加入5顆玻璃珠,加入混酶液10 mL。立即放入37 ℃的恒溫振蕩鍋中150 r/min分別反應(yīng)0、20 min后,取出沸水浴滅酶10 min,放入冷水中冷卻至常溫。取體外模擬消化后的溶液2 mL于離心管中,放入離心機4 500 r/min離心15 min,取上清液100 μL,加入900 μL蒸餾水后,加2 mL 3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS),沸水浴反應(yīng)5 min后,冷水循環(huán)冷卻至室溫后加入12 mL蒸餾水,混勻,使用紫外分光光度儀在波長540 nm處測定吸光度值,每個樣品分別做3組平行,并設(shè)置空白對照組,取平均值,快消化淀粉含量計算公式如下:
式中:G20為樣品酶解20 min時的葡萄糖含量,mg/g;G0為樣品酶解0 min 時葡萄糖的含量,mg/g;0.9為還原糖(以葡萄糖計)換算成淀粉的換算系數(shù);TS為總淀粉含量,mg/g。
式中:G為葡萄糖含量,mg/g;At為吸光度值;D為稀釋倍數(shù)1 500;W為測定時稱取的青稞粉質(zhì)量,g。
1.3.7 改性青稞粉體外降血糖活性測定
(1)α-淀粉酶抑制率測定
參照梁宗瑤等[19]的方法,準備150 μL的樣品液和0.5 mg/mL的α-淀粉酶液150 μL,混合均勻后于37 ℃孵育10 min,然后將250 μL的1%的可溶性淀粉溶液加入混合液中,并在37 ℃繼續(xù)孵育10 min,加入500 μL的DNS停止反應(yīng),在沸水浴中反應(yīng)5 min。冷卻后取200 μL于96孔板中,使用酶標儀在波長540 nm處測定吸光度值,每個樣品做3個平行,并設(shè)置空白對照,取平均值,α-淀粉酶抑制率計算公式如下:
式中:a為含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值;b為不含α-葡萄糖苷酶溶液含有待測樣品的測定吸光度值;c為含有α-葡萄糖苷酶溶液卻不含待測樣品的測定吸光度值。
(2)α-葡萄糖苷酶抑制率測定
參照賴曉樺等[20]的方法,稱取0.05 g改性青稞粉,加入0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(pH 6.8)600 μL,滴加300 μL 20 mmol/L的對硝基苯-α-D-吡咯葡萄糖苷(p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside,pNPG)溶液;并在37 ℃振蕩水浴鍋中反應(yīng)20 min,后滴加0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液200 μL,室溫反應(yīng)10 min后,加入反應(yīng)終止液0.1 mol/L Na2CO31.65 mL,并在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速條件下離心10 min,吸取200 μL上清液于96孔板中,用酶標儀于波長405 nm處測定其吸光度值。本試驗中的空白對照為pH 6.8、0.05 mol/L PBS溶液。α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式如下[18]:
式中:a為含有α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值;b為不含α-葡萄糖苷酶溶液含待測樣品的測定吸光度值;c為含有α-葡萄糖苷酶溶液不含樣品的測定吸光度值;d為不含α-葡萄糖苷酶溶液和待測樣品的測定吸光度值。
由圖1可知,當(dāng)普魯蘭酶添加量在120~200 U/g時,快消化淀粉含量隨著普魯蘭添加量的增大而下降;當(dāng)普魯蘭酶添加量在200 U/g時,快消化淀粉含量最低,為57.14%;當(dāng)普魯蘭酶添加量>200 U/g之后,快消化淀粉含量有所上升。酶解產(chǎn)物積累至一定程度會反向抑制酶解,隨著添加量的增加,快消化淀粉含量逐漸增加,增加趨勢較大。普魯蘭酶酶解會增加直鏈淀粉含量[21],直鏈淀粉比例與抗性淀粉含量呈正相關(guān)[22-24],從而造成快消化淀粉含量減少。綜上,確定最適的普魯蘭酶添加量為200 U/g。
圖1 普魯蘭酶添加量對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.1 Effect of pullulanase addition on rapid digestible starch contents of highland barley
由圖2可知,在α-葡萄糖苷酶添加量為20~80 U/g時,隨著α-葡萄糖苷酶添加量的增加,快消化淀粉的含量減少;當(dāng)普魯蘭酶添加量在80 U/g時,快消化淀粉含量最低,為57.01%;當(dāng)普魯蘭酶添加量>80 U/g之后,快消化含量有所上升。因為α-葡萄糖苷酶可將游離的葡萄糖基轉(zhuǎn)移到其他底物上,并形成α-1,6-糖苷鍵,得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等[25]。因此,最佳α-葡萄糖苷酶的添加量為80 U/g。
圖2 α-葡萄糖苷酶添加量對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.2 Effect of α-glucosidase addition on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3.1 料液比對青稞快消化淀粉含量的影響
由圖3可知,當(dāng)料液比為1∶5~1∶15(g:mL)時,快消化淀粉含量隨之減少;當(dāng)料液比為1∶15(g∶mL)時,快消化淀粉含量最低,為60.21%;當(dāng)料液比為1∶15~1∶25(g∶mL)時,隨著料液比的減小,酶解效果減弱??赡苁且驗榱弦罕冗^小時,導(dǎo)致溶液中的酶濃度降低,酶與淀粉的接觸機率減少;當(dāng)料液比較大時,酶與淀粉之間的流動性較低,不易酶解,快消化淀粉含量降低較少[26]。因此,確定最佳酶解料液比為1∶15(g∶mL)。
圖3 料液比對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.3 Effect of solid and liquid ratio on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3.2 酶解溫度對青稞快消化淀粉含量的影響
由圖4可知,快消化淀粉的含量隨著酶解溫度在45~85 ℃內(nèi)的升高呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。當(dāng)酶解溫度為45~55 ℃時,快消化淀粉含量隨之減少;當(dāng)酶解溫度達到55 ℃時,青稞快消化淀粉的含量最低,為59.09%。當(dāng)酶解溫度高于55 ℃之后,隨著酶解溫度升高,快消化淀粉含量升高,可能是因為溫度過高導(dǎo)致了淀粉的降解造成[27]。因此,確定最佳酶解溫度為55 ℃。
圖4 酶解溫度對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on rapid digestible starch contents of highland barley
2.3.3 酶解時間對青稞快消化淀粉含量的影響
由圖5可知,當(dāng)酶解時間為1~3 h時,青稞快消化淀粉的含量逐漸降低;當(dāng)酶解時間為3 h時,快消化淀粉含量最低,為56.39%;當(dāng)酶解時間>3 h之后,青稞快消化淀粉含量逐漸升高。可能是因為酶解時間過長,支鏈淀粉含量減少,后期快消化淀粉酶解的速度大于慢消化淀粉,導(dǎo)致快消化淀粉的含量增加[28]。因此,確定最佳酶解時間為3 h。
圖5 酶解時間對青稞快消化淀粉含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on rapid digestible starch contents of highland barley
基于單因素試驗結(jié)果,以α-葡萄糖苷酶添加量(A)、料液比(B)、酶解時間(C)為自變量,以快消化淀粉含量(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken模型設(shè)計出包括17個試驗點的試驗方案,響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments
續(xù)表
2.4.1 回歸模型的建立與顯著性分析
對表2數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸擬合得到回歸模型方程如下:
對上述回歸模型進行顯著性檢驗,方差分析結(jié)果見表3。由表3可知,該模型F值等于26.55,且P值<0.000 1,表明擬合模型具有顯著性。失擬項是模型數(shù)據(jù)變異的體現(xiàn),失擬項P值=0.791 3>0.05,不顯著,說明該回歸方程無失擬因素,試驗結(jié)果的擬合度是比較好的[28]。變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示試驗的精確度,CV越大越不可靠,本試驗中CV值(2.17%)較小,結(jié)果可靠。模型的決定系數(shù)R2為0.972 5,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.935 0,說明該模型可以解釋大概94%響應(yīng)值的變化。由P值可知,該模型的二次項A2、B2、C2對青稞快消化淀粉含量影響極顯著(P<0.01),一次項B、交互項AB、BC對青稞快消化淀粉含量影響顯著(P<0.05),一次項A、C和交互項AC對青稞快消化淀粉含量影響不顯著(P>0.05)。由F值可知,影響青稞快消化淀粉含量因素順序為B(料液比)>A(α-葡萄糖苷酶添加量)>C(酶解時間)。
表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model
2.4.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析
由圖6可知,α-葡萄糖苷酶添加量和料液比、料液比和酶解時間對青稞快消化淀粉含量有顯著影響(P<0.05),α-葡萄糖苷酶添加量和酶解時間對青稞快消化淀粉含量影響不顯著(P>0.05),這與表3的方差分析結(jié)果一致。
圖6 各因素間交互作用對青稞快消化淀粉含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on rapid digestible starch contents of highland barley
2.4.3 驗證試驗
由Design-Expert 8.0.6軟件分析后,得到最優(yōu)酶解工藝條件為:α-葡萄糖苷酶添加量80.3 U/g、料液比為1∶15(g∶mL)、酶解時間為2.9 h。在此優(yōu)化條件下,青稞快消化淀粉含量預(yù)測值為57.85%。為了便于實際操作,將最優(yōu)酶解工藝條件修正為:α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15(g∶mL)、酶解時間3.0 h。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗,青稞快消化淀粉含量實際值為54.95%,與預(yù)測值差別不大。
淀粉等先在人體內(nèi)被α-淀粉酶水解為麥芽糖等雙糖,再被α-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖、果糖等單糖,之后被小腸吸收,因此抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以降低餐后血糖。由圖7可知,改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為90.94%和91.89%,比原粉分別增加了68.1%和50.4%,說明經(jīng)過普魯蘭酶和α-葡萄糖苷酶雙酶酶解后,青稞淀粉的體外降血糖活性得到了明顯提高,可以為后期低血糖生成指數(shù)(glycemic index,GI)食品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
圖7 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.7 Inhibitory rate of α-amylase and α-glucosidase
本試驗研究普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的酶解工藝條件,在單因素試驗的基礎(chǔ)上,設(shè)計響應(yīng)面試驗分析優(yōu)化α-葡萄糖苷酶添加量、料液比、酶解時間對快消化淀粉含量的影響。結(jié)果表明,普魯蘭酶協(xié)同α-葡萄糖苷酶降低青稞快消化淀粉含量的最佳酶解工藝條件為:普魯蘭酶添加量200 U/g、α-葡萄糖苷酶添加量80 U/g、料液比1∶15(g∶mL)、酶解時間3 h、酶解溫度55 ℃。在此優(yōu)化條件下,改性青稞粉快消化淀粉含量為54.95%,比未處理過的青稞粉中快消化淀粉含量(75.17%)降低了20.22%。體外降血糖活性測定結(jié)果表明,改性青稞粉的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為90.94%和91.89%,比原粉分別增加了68.1%和50.4%,說明經(jīng)過雙酶協(xié)同酶解后,青稞淀粉的體外降血糖活性得到了明顯提高,為后期研發(fā)低GI青稞產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)。