浙江地區(qū)中溫大曲貯存過(guò)程細(xì)菌群落多樣性及功能預(yù)測(cè)分析

陳樂(lè)樂(lè)，王乙伊，汪怡寧，虞 敏

（1.寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315800；2.寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800）

大曲是白酒生產(chǎn)過(guò)程中重要的糖化發(fā)酵劑，是在開(kāi)放環(huán)境下以未經(jīng)高壓滅菌的原料自然接種生產(chǎn)而成的，對(duì)白酒產(chǎn)品品質(zhì)有重要影響[1-2]。生產(chǎn)過(guò)程中的微生物主要來(lái)自未滅菌的原料和生產(chǎn)環(huán)境[3]。大曲的制備需經(jīng)過(guò)谷物潤(rùn)濕、粉碎混合、固定成型、堆積發(fā)酵、貯存成熟等多個(gè)步驟[4]。通常，大曲的貯存過(guò)程所需時(shí)間較長(zhǎng)，需存放在通風(fēng)良好的開(kāi)放環(huán)境下經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)數(shù)個(gè)月之久[5]。目前，大曲成熟時(shí)間仍取決于個(gè)體生產(chǎn)者的經(jīng)驗(yàn)，導(dǎo)致大曲產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊且穩(wěn)定性差。因此，了解大曲在貯存期間的微生物變化規(guī)律極為重要，已成為行業(yè)關(guān)注重點(diǎn)。

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于研究大曲的微生物群落組成[6]。陳曉茹等[7]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，魏斯氏菌屬（Weissella）、刺糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是大曲貯存過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，但細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化顯著。GUAN T等[1]分析了濃香型大曲貯存6個(gè)月期間的細(xì)菌群落變化規(guī)律，魏斯氏菌屬（Weissella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）是大曲貯存期間的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，且不同貯存時(shí)間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。由此可知，貯存過(guò)程是大曲最復(fù)雜、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，大量微生物在自然環(huán)境變化下不斷演替而趨于平衡，為后續(xù)釀酒的多邊發(fā)酵提供重要的微生物基礎(chǔ)[7]。然而，當(dāng)前研究多集中于大曲貯存過(guò)程中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，忽視了大曲貯存過(guò)程的功能演替，尤其是利用生物信息學(xué)對(duì)大曲貯存過(guò)程細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

當(dāng)前關(guān)于大曲貯存過(guò)程細(xì)菌群落多樣性及功能的研究還相對(duì)較少，導(dǎo)致大曲貯存過(guò)程的微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制研究仍存在不足，尤其是在南方沿海地區(qū)生產(chǎn)的大曲。大部分研究者都是以我國(guó)比較著名的白酒生產(chǎn)所用大曲為研究對(duì)象，但是不同地域由于氣候環(huán)境的不同，環(huán)境中微生物群落差異較大，而大曲通常是在相對(duì)干燥、通風(fēng)良好，溫濕度恒定的曲房進(jìn)行貯藏，不可避免的會(huì)受到當(dāng)?shù)丨h(huán)境的影響。目前，針對(duì)沿海地區(qū)生產(chǎn)的大曲還尚未報(bào)道。本研究以浙江地區(qū)生產(chǎn)的中溫大曲為研究對(duì)象，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分析中溫大曲貯存過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的演替規(guī)律，并基于多元統(tǒng)計(jì)分析揭示影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成變化的理化因素，同時(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)細(xì)菌功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，從微生物生態(tài)學(xué)視角全面深入理解大曲貯存過(guò)程的重要性，旨在為生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的成熟中溫大曲提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取自浙江省某白酒大曲生產(chǎn)車(chē)間，成曲常溫貯存90 d，每隔30 d取樣。

鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞、氫氧化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNeasyPowerSoil Pro Kit：德國(guó)QIAGEN公司；BMS1000-2核酸純化磁珠：無(wú)錫百邁格生物科技有限公司；Taq脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）聚合酶：上海生工生物工程股份有限公司；細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物（343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和806R：5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′）：上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司；Nextera XT DNA Sample Preparation Kit：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB-50型電子分析天平、FE28型pH計(jì)：瑞士Mettler-Toledo公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器廠(chǎng)；VORTEX-3型旋渦混勻儀：德國(guó)IKA公司；NanoDrop 2000型紫外微量分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀電泳槽：北京六一儀器廠(chǎng)；SEDI G型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、KETA G型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Wealtec公司；Illumina PE250測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品收集

為消除曲房空間差異和大曲個(gè)體差異，分別從曲房中間的曲堆上、中和下層取樣，并粉碎混勻，將粉碎混勻的大曲分為兩份，分別置于-20 ℃和-80 ℃保存，一份用于理化檢測(cè)，一份用于DNA提取，每份樣品設(shè)置三個(gè)平行樣本。

1.3.2 理化特性分析

參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[8]測(cè)定樣品的pH、酸度和含水量。

1.3.3 DNA提取及高通量測(cè)序

1.3.4 生物信息學(xué)分析

原始序列使用Qiime2 pipeline[11]進(jìn)行處理，具體如下：利用Demux插件對(duì)原始序列進(jìn)行解復(fù)用，使用Cutadapt插件去除測(cè)序引物，并過(guò)濾低質(zhì)量堿基，隨后采用DADA2插件合并序列并去除嵌合體，通過(guò)預(yù)訓(xùn)練SILVA 138數(shù)據(jù)庫(kù)[12]對(duì)序列進(jìn)行注釋?zhuān)玫椒菃螖U(kuò)增序列變異體（amplicon sequence variants，ASV），將葉綠體、線(xiàn)粒體和不能注釋到門(mén)水平的ASV刪除。以最少樣本序列數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抽平處理，分析不同樣品的多樣性差異。利用R軟件實(shí)現(xiàn)基于A(yíng)SVs的柱狀圖、樣本聚類(lèi)分析、主坐標(biāo)分析和冗余分析。

根據(jù)樣品中各ASV代表序列及其豐度表，使用Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States 2（PICRUSt2）算法的標(biāo)準(zhǔn)集成基因組數(shù)據(jù)庫(kù)推斷16S rRNA基因的功能組成[13]。該方法是將樣品的16S rRNA基因序列定位到京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋?zhuān)⑼ㄟ^(guò)PICRUSt2算法預(yù)測(cè)群落的代謝途徑豐度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0和Excel 2017繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存期間大曲理化特征變化

大曲在自然環(huán)境變化脅迫下會(huì)發(fā)生復(fù)雜的理化反應(yīng)，故從理化角度揭示大曲貯存過(guò)程中的各理化特征的差異。大曲貯存過(guò)程中pH、酸度和含水量的變化見(jiàn)圖1。

圖1 大曲貯存期間pH（A）、酸度（B）和含水量（C）的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of pH (A),acidity (B) and moisture (C)during Daqu storage

由圖1可知，在90 d貯存過(guò)程中，大曲樣品的pH和含水量隨貯存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)而逐漸降低，而酸度則逐漸增加。成曲的pH和含水量分別為6.69和11.97%。貯存90 d后，大曲樣品的pH和含水量分別下降至5.93和9.98%，顯著低于成曲樣品的pH和含水量（P＜0.05）。此外，大曲的酸度在貯存90 d后可達(dá)0.96 mmol/10 g，比貯存前的成曲樣品提高了95.92%，二者的酸度差異顯著（P＜0.05）。這一結(jié)果與GUAN T等[1]的研究結(jié)果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)濃香型白酒大曲貯存6個(gè)月后會(huì)引起含水量和pH的降低以及酸度的升高。造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于每塊大曲磚塊之間都留有一定的縫隙，而曲房是一個(gè)相對(duì)干燥、通風(fēng)良好、溫濕度恒定的空間[14]。pH的降低及酸度的增加與乳酸菌、醋酸菌等細(xì)菌的相對(duì)豐度持續(xù)較高有關(guān)[1]。故貯存會(huì)造成大曲的pH、酸度和含水量發(fā)生顯著變化。

2.2 貯存期間大曲中細(xì)菌群落多樣性變化

使用Observed指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估大曲貯存過(guò)程中細(xì)菌群落的α-多樣性變化，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大曲貯存期間細(xì)菌群落序列數(shù)量和α-多樣性分析結(jié)果Table 1 Bacterial community sequence numbers and alpha-diversity analysis results during Daqu storage

由表1可知，12個(gè)大曲樣品的Illumina高通量測(cè)序共得到663 332條有效序列，平均42 188～65 079條/大曲樣品。各大曲樣品的測(cè)序覆蓋率均較高（＞98%），說(shuō)明這些有效測(cè)序序列可真實(shí)反映大曲中細(xì)菌群落的物種組成和多樣性。成曲細(xì)菌群落的Observed指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為348、3.69和0.77。隨著貯存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，大曲樣品細(xì)菌群落的Observed指數(shù)和Shannon指數(shù)呈先下降后逐漸增加的變化趨勢(shì)，而Simpson指數(shù)則呈逐漸增加的變化趨勢(shì)。貯存90 d后，大曲細(xì)菌群落的Observed指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為411、4.22和0.90，與成曲細(xì)菌群落的α-多樣性結(jié)果相比差異顯著（P＜0.05）。這與陳曉茹等[7]研究結(jié)果相一致。大曲樣品細(xì)菌群落α-多樣性的變化與大曲貯存環(huán)境有關(guān)，通常pH和酸度會(huì)顯著影響微生物群落的α-多樣性，表現(xiàn)為一些不耐酸的微生物不能適應(yīng)該環(huán)境而消亡[15]。由于曲房具有良好的通風(fēng)性，環(huán)境中耐酸的微生物可附著在大曲表面，利用高粱、小麥中的糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，從而提高貯存后期大曲樣品的α-多樣性。

基于Bary-Curtis算法計(jì)算各大曲樣品的距離，隨后采用主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）比較不同貯存時(shí)間大曲樣品中細(xì)菌群落的差異，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 大曲貯存期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.2 Principal coordinate analysis results of bacterial community structure during Daqu storage

由圖2可知，主坐標(biāo)第一軸方差貢獻(xiàn)率為49.83%，而主坐標(biāo)第二軸方差貢獻(xiàn)率為31.11%，由此可知，物種差異的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.94%，可利用前兩個(gè)主成分來(lái)解釋該模型的變量。不同貯存時(shí)間的大曲樣品在主坐標(biāo)前兩軸的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明各貯存時(shí)間的大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，尤其是成曲樣品和其他貯存時(shí)間的大曲樣品差異最大。這一結(jié)果與陳曉茹等[7]研究結(jié)果相一致，表明大曲樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)而不斷變化。

2.3 貯存期間大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成演替

不同貯存時(shí)間大曲樣品中細(xì)菌群落門(mén)水平的演替規(guī)律見(jiàn)圖3。由圖3可知，經(jīng)物種分類(lèi)注釋后，12個(gè)大曲樣品共檢測(cè)到來(lái)自11個(gè)門(mén)水平的物種，其中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）是大曲樣品貯存期間相對(duì)豐度最高的三個(gè)門(mén)。厚壁菌門(mén)在大曲貯存期間占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，其相對(duì)豐度范圍在86.83%～97.61%，表明貯存期間的大曲樣品具有相對(duì)穩(wěn)定的門(mén)水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果與唐賢華等[16]研究結(jié)果相似，說(shuō)明來(lái)自厚壁菌門(mén)的微生物普遍具有耐酸、分解高粱和小麥中淀粉和蛋白等特性。

圖3 大曲貯存期間細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of relative abundance of bacterial phyla during Daqu storage

為進(jìn)一步更為準(zhǔn)確的描述大曲樣品在不同貯藏時(shí)間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，從屬水平揭示其組成差異。不同貯存時(shí)間大曲樣品中細(xì)菌群落屬水平的演替規(guī)律見(jiàn)圖4。由圖4可知，所有大曲樣品共檢測(cè)到79個(gè)屬，其中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯式菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和乳球菌屬（Lactococcus）等是大曲貯存期間的優(yōu)勢(shì)屬。此外，在屬水平的聚類(lèi)分析也發(fā)現(xiàn)同一貯存時(shí)間的大曲樣品被聚在一起，且整個(gè)貯存期間的大曲樣品可主要分為兩簇，成曲樣品簇和其他貯存時(shí)間大曲樣品簇，這一結(jié)果與圖2的結(jié)果相一致，說(shuō)明成曲和其他貯存時(shí)間的大曲樣品在屬水平組成上差異較大。成曲樣品中乳酸桿菌屬和魏斯式菌屬的相對(duì)豐度最大，分別為47.56%和42.77%。隨著貯存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度逐漸升高，而魏斯式菌屬的相對(duì)豐度則逐漸降低。貯存90 d后，大曲樣品中乳酸桿菌屬和魏斯式菌屬的相對(duì)豐度分別為63.44%和25.16%。乳酸桿菌屬是一類(lèi)兼性厭氧的微生物，是谷物類(lèi)產(chǎn)品發(fā)酵所必需的微生物之一，廣泛存在于大曲及白酒釀造中，其可通過(guò)自身代謝系統(tǒng)將谷物中淀粉轉(zhuǎn)化為乳酸[17-18]。這可能是促使大曲樣品在貯存期間酸度增加的主要因素。魏斯式菌屬也被確定為大曲中最豐富的細(xì)菌類(lèi)群之一，其能夠降解纖維二糖并在酸性發(fā)酵環(huán)境中生長(zhǎng)代謝[17]。片球菌屬和明串珠菌屬的相對(duì)豐度在貯存30 d前逐漸升高，分別從2.71%和2.22%升高至5.57%和3.49%，之后隨著貯存時(shí)間的增加逐漸降低，貯存90 d后，二者的相對(duì)豐度分別僅為1.89%和0.89%。這一結(jié)果與GUAN T等[1]研究結(jié)果相一致，表明片球菌屬和明串珠菌屬受其他微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)抑制，不能在貯存期間大量生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)不到相對(duì)較高的相對(duì)豐度。據(jù)報(bào)道，從葡萄酒中分離出的片球菌具有酯化能力[19]。明串珠菌屬通常附著在谷物原料表面，可將原料中糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甘露糖和葡聚糖，為其他乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)[20]。芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬在貯存期間的相對(duì)豐度范圍分別為0.64%～2.07%和0～6.28%，這些少量的芽孢桿菌屬具有產(chǎn)生蛋白水解酶和淀粉酶等特征，可提高大曲中有機(jī)酸和吡嗪類(lèi)化合物的含量[21-23]。而不動(dòng)桿菌屬在大曲中的作用目前尚不清楚。此外，醋酸桿菌屬和克羅彭斯特菌屬的相對(duì)豐度則隨貯存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)而逐漸升高，二者分別從成曲樣品的0.11%和0.04%升高至貯存90 d后大曲樣品的2.04%和2.35%。醋酸桿菌屬是一類(lèi)好氧的微生物，可將谷物原料中糖類(lèi)和酒精氧化成醋酸，從而提高大曲樣品的酸度?？肆_彭斯特菌屬?gòu)V泛存在各種不同香型的大曲中，可作為大曲成熟的生物標(biāo)志微生物[24-25]。

圖4 大曲貯存期間細(xì)菌屬的相對(duì)豐度動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of relative abundance of bacterial genera during Daqu storage

2.4 貯存期間大曲理化因子與細(xì)菌群落的冗余分析

冗余分析（redundancy analysis，RDA）是一種回歸分析結(jié)合主成分分析的排序方法，可用于揭示響應(yīng)變量和解釋變量的線(xiàn)性關(guān)系。不同貯存時(shí)間大曲樣品理化因子與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的冗余分析見(jiàn)圖5。

圖5 大曲貯存期間理化因子與優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical factors and dominant bacterial genera during Daqu storage

由圖5可知，貯存期間大曲理化因子對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)群屬的總解釋度為60.44%，其中冗余分析第一軸的解釋度為45.76%，可較好的區(qū)分不同貯存時(shí)間的大曲樣品。魏斯式菌屬相對(duì)豐度與含水量和pH呈正相關(guān)，與酸度呈負(fù)相關(guān)，而酸度則與乳酸桿菌屬、醋酸桿菌屬和克羅彭斯特菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)。此外，通過(guò)條件限制分析闡明每個(gè)理化因子對(duì)大曲貯存期間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響程度，發(fā)現(xiàn)pH、含水量和酸度對(duì)大曲細(xì)菌群落主要優(yōu)勢(shì)屬演替的貢獻(xiàn)度相差無(wú)幾，說(shuō)明多個(gè)理化因子共同調(diào)控貯存期間大曲樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替變化。綜上可知，貯存期間大曲樣品細(xì)菌群落組成和理化因子變化顯著，這些理化因子共同影響了大曲細(xì)菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而促進(jìn)了大曲的成熟。

2.5 貯存期間大曲細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt2算法預(yù)測(cè)細(xì)菌的代謝功能，是宏基因組分析的一種代替方法，具有成本低，精度較高等特點(diǎn)。不同貯存時(shí)間大曲樣品細(xì)菌群落的功能預(yù)測(cè)分析見(jiàn)圖6。

由圖6可知，貯存期間大曲樣品共涉及6類(lèi)一級(jí)功能層，包括代謝（L1）、遺傳信息處理（L2）、環(huán)境信息處理（L3）、細(xì)胞過(guò)程（L4）、有機(jī)系統(tǒng)（L5）和人類(lèi)疾?。↙6），其中代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理是主要功能，貯存期間的相對(duì)豐度分別為60.11%～61.82%、20.21%～21.05%和14.22%～14.84%。此外，這6類(lèi)一級(jí)功能層的相對(duì)豐度在不同貯存時(shí)間的大曲樣品中均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。進(jìn)一步對(duì)二級(jí)功能層進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)貯存期間大曲樣品共涉及27個(gè)二級(jí)功能層，其中碳水化合物代謝（24.79%～26.85%），翻譯（10.52%～11.02%）和膜轉(zhuǎn)運(yùn)（9.86%～10.21%）是最主要的三個(gè)二級(jí)功能層。通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)27個(gè)二級(jí)功能層可被分為兩簇，其中運(yùn)輸和代謝、消化系統(tǒng)、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能力代謝等11個(gè)二級(jí)功能層的相對(duì)豐度在貯存90 d時(shí)相對(duì)高于其他貯存時(shí)間。而折疊、分選和降解、衰老、脂類(lèi)代謝、萜類(lèi)和聚酮類(lèi)化合物代謝、翻譯等9個(gè)二級(jí)功能層在貯存30 d時(shí)富集；膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)5個(gè)二級(jí)功能層則在成曲樣品中富集。

圖6 大曲貯存期間細(xì)菌群落的PICRUSt2功能預(yù)測(cè)分析Fig.6 PICRUSt2 functional predictive analysis of bacterial communities during Daqu storage

3 結(jié)論

本研究利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)探究浙江地區(qū)大曲貯存過(guò)程中理化特征和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的演替變化，并結(jié)合PICRUSt2預(yù)測(cè)貯存期間細(xì)菌群落功能差異。研究發(fā)現(xiàn)大曲的pH和含水量隨著貯存時(shí)間的不斷延長(zhǎng)逐漸降低，而酸度呈相反的變化趨勢(shì)。貯存90 d后，大曲樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異顯著（P＜0.05）。門(mén)水平上，貯存期間的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Firmicutes），其相對(duì)豐度＞85%。屬水平上，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯式菌屬（Weissella）是大曲貯存期間的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度范圍分別為47.56%～63.44%和25.16%～42.77%。冗余分析結(jié)果表明魏斯式菌屬相對(duì)豐度與含水量和pH呈正相關(guān)，而酸度與乳酸桿菌屬、醋酸桿菌屬和克羅彭斯特菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)。此外，PICRUSt2預(yù)測(cè)結(jié)果表明大曲貯存期間的基因功能主要與代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理等功能相關(guān)。本研究旨在為生產(chǎn)品質(zhì)穩(wěn)定的成熟大曲提供理論和數(shù)據(jù)參考。