具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的玉米須發(fā)酵液制備及穩(wěn)定性研究

包 影，王俊彤，2，姜彩霞，鄭喜群，2， *，劉曉蘭

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；4.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由胰島素代謝障礙或分泌不足引起的以血糖濃度偏高為特征的代謝性疾病[1]。我國是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，患病人群已超過2億[2]，近年來糖尿病患病率不斷攀升，已高達10.9%[3]。目前，市面上的多種降血糖藥物雖然治療效果明顯，但存在著引起腹脹腹瀉、皮膚過敏等不良反應(yīng)和市場價格較高等問題[4]。因此，從天然植物中制備出安全、有效且價格低廉的活性物質(zhì)用于代替藥物治療和預(yù)防糖尿病是當(dāng)前研究和探索的熱點。

玉米須是玉蜀黍（Zea mays）的花柱和花頭，形如發(fā)絲狀，呈棕黃色[5]，在我國屬于傳統(tǒng)中藥材。玉米須富含黃酮及其苷類、甾醇類、糖類、多酚類、有機酸等化學(xué)成分，具有降血糖、抗氧化、抗疲勞、抑菌抗炎等作用[6-9]，通常被用于防治腫瘤[10]和治療肥胖、糖尿病等代謝綜合征[11]。黨婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，玉米須水提取物具有降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的作用；宋燁等[13]研究發(fā)現(xiàn)，玉米須水煎液能緩解Ⅰ型糖尿病小鼠的高血糖癥狀，降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖值；李敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌（Lactobacillus）玉米須發(fā)酵液對糖尿病小鼠具有良好的體內(nèi)外降血糖作用并可調(diào)節(jié)其血脂異常。在我國玉米產(chǎn)量較大，大田玉米采用機器收割，玉米須無法單獨回收而被廢棄。近年來，隨著鮮食玉米的市場份額增加，其嫩青玉米須被很好的保留了下來。但嫩青玉米須需晾曬、干燥后才能儲存，并且干燥玉米須儲存占地空間較大，導(dǎo)致人力、物力資源的極大浪費。因此，如何將豐富的玉米須資源充分、合理的高值化利用，已成為值得探討和研究的重點問題。

類干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）屬于乳酸桿菌屬，具有促進糖、蛋白質(zhì)和脂肪的分解代謝，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及調(diào)節(jié)免疫等作用[15]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）屬于酵母菌屬，酵母菌的存在對乳酸菌生長代謝具有促進作用，并且能夠提高乳酸菌的穩(wěn)定性，另外，酵母菌的參與還可抑制有害菌的生長，對人體產(chǎn)生潛在的益生作用[16]。本研究利用多菌種發(fā)酵的方法，以玉米須發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標(biāo)，采用單因素及正交試驗探究最佳發(fā)酵工藝條件和發(fā)酵液的穩(wěn)定性，以期為開發(fā)具有降血糖功能性的產(chǎn)品提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須：市售；類干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：上海滬崢生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（酶活50 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucoside，PNPG）：美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：北京酷來搏科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、酵母膏麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；人工胃液、人工小腸液：上海樊克生物科技有限公司；所有試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、SHP-250F生化培養(yǎng)箱、DR-M2阿貝斯折光儀、TNZ5-WS低速多管架自動平衡離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PA紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CG-2 FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-100G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米須前處理條件優(yōu)化

玉米須經(jīng)清水漂洗2次，45 ℃烘干4 h，粉碎，分別將不過篩、過40目篩和過60目篩的玉米須用蒸餾水以料液比1∶10（g∶mL）進行提取，提取條件為80 ℃、90 ℃、100 ℃各回流提取2 h和浸泡提取12 h、24 h。提取液冷卻后過濾2次，濾液4 000 r/min離心20 min，取上清液并抽濾。抽濾液121 ℃滅菌15 min后冷卻至室溫。用阿貝斯折光儀檢測無菌抽提液中固形物含量[17]。

1.3.2 菌種篩選

分別以類干酪乳桿菌單菌、釀酒酵母單菌、復(fù)合菌種（釀酒酵母∶類干酪乳桿菌=1∶3）為玉米須水提液發(fā)酵劑，根據(jù)1.3.1方法，在料液比1∶15（g∶mL）、菌種接種量8%、各菌種在最適發(fā)酵時間和溫度條件下進行玉米須水提液發(fā)酵，對照組用玉米須水提液代替發(fā)酵樣品。以α-葡萄糖苷酶的抑制率為評價指標(biāo)，篩選最佳發(fā)酵菌種。

1.3.3 玉米須發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

選取上述最佳菌種進行發(fā)酵，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL））、復(fù)合菌種接種量（4%、6%、8%、10%、12%）、發(fā)酵時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）、發(fā)酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，篩選最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 玉米須發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選定最佳發(fā)酵條件范圍，設(shè)計4因素3水平L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，正交試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 玉米須發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for corn stigma fermentation process optimization

1.3.5 玉米須發(fā)酵液的穩(wěn)定性分析

熱穩(wěn)定性：發(fā)酵液分別在20℃、40℃、60℃、80℃、100℃、120 ℃加熱30 min后冷卻至室溫，以未加熱樣品作為對照組，測定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并表示為相對于對照組的活性。

pH穩(wěn)定性：用1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH分別為2、4、6、8、10、12、14，在室溫條件下孵育30 min后調(diào)節(jié)樣品溶液pH至7.0，以未處理樣品作為對照組，測定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并表示為相對于對照組的活性。

體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性：參考文獻[18]，取200 mL人工胃液加入20 mL發(fā)酵液在37 ℃條件下恒溫振蕩2 h。取100 mL人工小腸液加入經(jīng)胃部消化過的發(fā)酵液在37 ℃條件下恒溫繼續(xù)振蕩2 h。在體外消化過程中分別取消化0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h消化液，將取得的消化液快速放入沸水浴中10 min，測定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并表示為相對于對照組的活性。

1.3.6 測定方法

α-葡萄糖苷酶抑制率的測定：參照文獻[19]，略有改動：用0.1 mol/L pH 6.8的PBS將α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）和PNPG分別配制成0.2 U/mL和10 mmol/L的溶液備用。取3 mL PBS、100 μL樣品、0.5 mL PNPG于試管中混合并攪拌均勻，在37 ℃保溫5 min后，加入0.5 mLα-葡萄糖苷酶并保溫60 min后，加入5 mL 0.2 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。陽性對照用阿卡波糖，調(diào)零組用蒸餾水，空白組用緩沖溶代替樣品和α-葡萄糖苷酶，對照組用緩沖液代替樣品。溶液在波長400 nm處測吸光度值，并記錄數(shù)值。依據(jù)下式計算玉米須發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：A樣品、A樣品、A空白分別為對照組、樣品組、空白組吸光度值。

相對活性的檢測：根據(jù)1.3.6方法檢測處理后樣品α-葡萄糖苷酶抑制率，對照組用未經(jīng)過處理的發(fā)酵液代替樣品。依據(jù)下式計算處理后的發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率相對活性：

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS19.0和Origin2019進行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須前處理條件優(yōu)化

由圖1可知，在同一提取條件下，玉米須水提液固形物含量隨過篩目數(shù)增加而顯著升高（P＜0.05），其中過60目篩（粒徑＜300 μm）的玉米須水提液中固形物含量最高，其次是過40目篩（粒徑＜630 μm）的玉米須水提液，而未過篩的玉米須水提液最低。這說明玉米須粉碎后的粒度大小對于提取效率有顯著的影響。對于不同的提取條件，回流提取的水提液中固形物含量顯著高于浸泡提?。≒＜0.05）。在90 ℃和100 ℃回流提取2 h的過60目篩玉米須提取液中固形物含量最高，分別達到（3.69±0.05）%和（3.72±0.05）%，但兩者無顯著差異（P＞0.05）。因此綜合成本因素，玉米須前處理最優(yōu)條件為玉米須粉碎、過60目篩，于90 ℃回流提取2 h。

圖1 不同前處理條件對玉米須水提液固形物含量的影響Fig.1 Effect of different pretreatment conditions on solid content of water extract of corn stigma

2.2 菌種篩選

由圖2可知，玉米須水提液的α-葡萄糖苷酶抑制率為（42.00±2.11）%。發(fā)酵后，其發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率顯著增加（P＜0.05）。3種菌種按玉米須發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率大小排序為復(fù)合菌種[（62.13±2.10）%]＞類干酪乳桿菌[（53.87±1.91）%]＞釀酒酵母[（47.97±2.03）%]。玉米須復(fù)合菌種發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶的抑制率表現(xiàn)出較大差異。類干酪乳桿菌和釀酒酵母存在著互利共生的關(guān)系[20]，兩種菌混合培養(yǎng)過程中富集了大量的肽，提高了培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，促進乳酸的產(chǎn)生?；旌吓囵B(yǎng)過程中釀酒酵母可以不斷中和代謝物中的乳酸，從而降低乳酸對類干酪乳桿菌生長的抑制，使得產(chǎn)物不斷富集。因此，選擇復(fù)合菌種（釀酒酵母∶類干酪乳桿菌=1∶3）作為玉米須液態(tài)發(fā)酵的最適菌株。

圖2 不同菌種玉米須發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effect of different strains on α-glucosidase inhibition rate of corn stigma fermentation broth

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 料液比對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

料液比對玉米須發(fā)酵液的α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖3。

圖3 料液比對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on α-glucosidase inhibition rate of corn stigma fermentation broth

由圖3可知，α-葡萄糖苷酶抑制率在料液比為1∶10（g∶mL）到1∶15（g∶mL）區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢，溶劑的增多能有效加快玉米須內(nèi)部物質(zhì)的擴散速度，增加溶出度；在料液比為1∶15（g∶mL）時，α-葡萄糖苷酶抑制率達到峰值（42.13±1.10）%，可能是因為液料比達到了平衡[21]；在1∶15（g∶mL）到1∶30（g∶mL）區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢，可能是在達到平衡后溶劑的增多使溶液被稀釋，從而使α-葡萄糖苷酶抑制率下降。綜上考慮，確定玉米須發(fā)酵液最佳的料液比為1∶15（g∶mL）。

2.3.2 復(fù)合菌種接種量對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

復(fù)合菌種接種量對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響如圖4所示，當(dāng)復(fù)合菌種接種量在低于8%范圍內(nèi)，α-葡萄糖苷酶抑制率隨復(fù)合菌種接種量增加呈現(xiàn)上升趨勢。其原因可能是隨復(fù)合菌種接種量增加，使底物與復(fù)合菌種結(jié)合的概率增大，復(fù)合菌種在單位時間內(nèi)發(fā)酵能力增加致反應(yīng)充分[22]；當(dāng)復(fù)合菌種接種量為8%時，α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值，為（47.94±1.11）%；當(dāng)復(fù)合菌種接種量高于8%，隨復(fù)合菌種接種量增加，α-葡萄糖苷酶抑制率呈下降趨勢。其原因可能是，接種量過大則導(dǎo)致在有限的營養(yǎng)物質(zhì)下菌種生長受到限制，致使后續(xù)進行發(fā)酵的動力不足，也可能由于菌種的不斷產(chǎn)生并不斷積累一些抑制產(chǎn)物，從而限制了發(fā)酵過程中菌種的正常生長[23]。綜上考慮，確定玉米須發(fā)酵液最佳的復(fù)合菌種接種量為8%。

圖4 復(fù)合菌種接種量對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of compound strains inoculum on α-glucosidase inhibition rate of corn stigma fermentation broth

2.3.3 發(fā)酵溫度對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

發(fā)酵溫度對玉米須多菌種發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響結(jié)果如圖5所示，當(dāng)發(fā)酵溫度在28～34 ℃范圍內(nèi)，隨發(fā)酵溫度升高α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升的趨勢，其原因可能是隨溫度升高，類干酪乳桿菌生長速度和代謝能力增加，類干酪乳桿菌內(nèi)部活動加劇，有利于抑制α-葡萄糖苷酶的活性物質(zhì)積累[24]；當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃時，α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值，為（50.64±1.12）%；當(dāng)發(fā)酵溫度高于34 ℃時，α-葡萄糖苷酶抑制率隨發(fā)酵溫度升高呈下降趨勢。其原因可能是發(fā)酵溫度過高，釀酒酵母生長繁殖能力受到限制，使發(fā)酵副產(chǎn)物積累過多影響復(fù)合菌種的發(fā)酵能力和α-葡萄糖苷酶的抑制率[25]。綜上考慮，確定玉米須多菌種發(fā)酵液最佳的發(fā)酵溫度為34 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on α-glucosidase inhibition rate of corn stigma fermentation broth

2.3.4 發(fā)酵時間對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響

發(fā)酵時間對玉米須多菌種發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響如圖6所示，當(dāng)發(fā)酵時間在24～72 h范圍內(nèi)，α-葡萄糖苷酶抑制率呈上升趨勢，其原因可能是在發(fā)酵初期，發(fā)酵液中能源物質(zhì)充足，可以提供足夠的物質(zhì)使復(fù)合菌種進行發(fā)酵；當(dāng)發(fā)酵時間為72 h時，α-葡萄糖苷酶抑制率達到最大值，為（55.61±1.12）%；當(dāng)發(fā)酵時間高于72 h時，隨發(fā)酵時間延長α-葡萄糖苷酶抑制率呈下降趨勢。其原因可能是隨發(fā)酵時間延長菌種進入衰亡期，致使后續(xù)進行發(fā)酵的動力不足，發(fā)酵副產(chǎn)物積累過多，pH下降，從而具有α-葡萄糖苷酶抑制功能的活性物質(zhì)受到影響。綜上考慮，確定玉米須發(fā)酵液最佳的發(fā)酵時間為72 h。

圖6 發(fā)酵時間對玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on α-glucosidase inhibition rate of corn stigma fermentation broth

2.4 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 玉米須發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for corn stigma fermentation process optimization

表3 正交試驗結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

由表2可知，通過方差分析各因素對發(fā)酵液影響大小依次為料液比＞接種量＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度；通過極差分析發(fā)現(xiàn)最優(yōu)組合為A2B2C2D3。當(dāng)玉米須發(fā)酵液工藝參數(shù)料液比為1∶15（g∶mL），復(fù)合菌種接種量為8%；發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵時間為96 h。該條件下玉米須發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶抑制率最高，為（62.13±2.10）%，具有良好的降低血糖作用。由表3可知，接種量、料液比和發(fā)酵時間對發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率具有顯著性影響（P＜0.01）。

2.5 玉米須發(fā)酵液的穩(wěn)定性

2.5.1 熱穩(wěn)定性

由圖7可知，發(fā)酵液經(jīng)過不同溫度處理后，對α-葡萄糖苷酶抑制率相對活性影響不顯著（P＞0.05），仍保持較高的抑制活性。結(jié)果表明，發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性，可以應(yīng)用到熱處理食品中。

圖7 玉米須發(fā)酵液熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of corn stigma fermentation broth

2.5.2 pH穩(wěn)定性

由圖8可知，當(dāng)pH＜6或者pH＞8時，處理后的發(fā)酵液對α-葡萄糖苷酶抑制活性略有損失。這可能是由于發(fā)酵液中的活性物質(zhì)在酸性或堿性過強的條件下降解成非活性片段[26]。表明發(fā)酵液可以應(yīng)用到寬pH范圍的食品體系中，其生物活性不易受pH值影響。

圖8 玉米須發(fā)酵液pH穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of corn stigma fermentation broth

2.5.3 體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

為了發(fā)酵液中的活性物質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮其活性，要滿足的要求之一就是能抵抗胃腸道消化和降解的能力。體外模擬胃腸道消化可用于研究玉米須發(fā)酵液在體內(nèi)的生物利用度。

由圖9可知，在胃環(huán)境中消化2 h，玉米須發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶抑制率相對活性由（98±1.02）%降低至（89±1.20）%，在十二指腸環(huán)境中α-葡萄糖苷酶抑制活性趨于穩(wěn)定。這可能是因為胃部的酸性環(huán)境導(dǎo)致發(fā)酵液中的活性物質(zhì)發(fā)生降解[27-28]。小腸的環(huán)境近中性對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響較小。

圖9 玉米須發(fā)酵液體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性Fig.9 Simulated gastrointestinal digestive stability in vitro of corn stigma fermentation broth

3 結(jié)論

玉米須水提液中含有多糖、生物堿、黃酮、皂苷等多種生物活性物質(zhì)，通過多菌種復(fù)合發(fā)酵技術(shù)處理后，多糖、皂苷和黃酮等活性物質(zhì)的分子質(zhì)量、化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高了生物活性。其α-葡萄糖苷酶抑制活性一定溫度和pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，且在模擬胃腸道系統(tǒng)中，消化后的α-葡萄糖苷酶抑制活性有所下降，但還是保留了較高的活性。本研究獲得的玉米須發(fā)酵液表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降糖作用。為人體降血糖功能膳食的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。此發(fā)酵液制備方法不添加任何化學(xué)試劑，制作成本低廉，解決了玉米須資源浪費問題，也為玉米副產(chǎn)物深加工提供了新途徑。