中溫大曲產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

胡曉龍，馮大鴻，田瑞杰，王永亮，曹滿堂，魏 濤，韓素娜，沈祥坤，何培新

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.賈湖酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司，河南 漯河 462400；3.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；4.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450053）

中國(guó)白酒品種繁多，不同白酒釀造工藝中采用的酒曲也不盡相同。根據(jù)酒曲所用的原料和形狀的不同可分為大曲、小曲和麩曲[1]。大曲常以小麥為主要原料（大麥、豌豆等為輔料），采用生料制曲、自然接種，自然發(fā)酵而成[2]，主要用于釀造醬香型、濃香型和清香型等白酒。根據(jù)大曲品溫的不同，可分為高溫大曲（60～70 ℃）、中溫大曲（45～50 ℃）及低溫大曲（40～45 ℃）[3]。中溫大曲是濃香型白酒發(fā)酵中使用的糖化發(fā)酵劑，因此也稱濃香型大曲[4]。

大曲含有豐富的微生物酶系，淀粉酶是水解谷物原料的重要酶類[5-7]，其酶活力的高低是影響原料利用率和出酒率的重要因素之一[8]。大曲中產(chǎn)淀粉酶微生物的種類繁多，芽孢桿菌屬（Bacillussp.）細(xì)菌和曲霉屬（Aspergillussp.）真菌是大曲中淀粉酶的主要產(chǎn)生菌，其中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是白酒釀造中常見的功能菌，具有很強(qiáng)的分泌降解酶的能力，其分泌的淀粉酶能快速將原料中的淀粉水解為還原糖，進(jìn)而發(fā)酵為醇、酯和各種有機(jī)酸，不僅能提高淀粉質(zhì)原料的利用率還能增加白酒的香氣[9-10]。而來源于芽孢桿菌屬微生物所產(chǎn)淀粉酶最為常見，如貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velesi），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）等芽孢桿菌[11-14]。王屈祎等[12]從高溫大曲中篩選得到一株產(chǎn)淀粉酶貝菜斯芽孢桿菌LT-2，經(jīng)優(yōu)化后酶活達(dá)到972.88 U/mL，魯珍等[15]從高溫大曲獲得產(chǎn)淀粉酶假蕈狀芽孢桿菌（Bacillus pseudomycoides）GX05，優(yōu)化后酶活達(dá)到180.12 U/g，毛祥等[16]從醬香型大曲中獲得產(chǎn)淀粉酶枯草芽孢桿菌1#，優(yōu)化后酶活為8 667.79 U/mL。中溫大曲作為濃香型白酒釀造的重要組成部分，篩選產(chǎn)淀粉酶功能微生物，優(yōu)化其發(fā)酵條件后并應(yīng)用到濃香型白酒釀造中，對(duì)白酒出酒率和品質(zhì)的提升具有非常重要的意義。較之于放線菌、霉菌等產(chǎn)淀粉酶微生物，芽孢桿菌具有產(chǎn)酶量高、發(fā)酵周期短、成本低和易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，其更有發(fā)展前景[12]。

本研究利用淀粉水解圈法初篩、搖瓶發(fā)酵法復(fù)篩從中溫大曲中篩選獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色和16S rRNA同源序列分析，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化其產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)條件，以期提高中溫大曲的液化力和糖化力，豐富產(chǎn)淀粉酶功能微生物資源庫(kù)，為提升白酒出酒率和品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

中溫大曲：取自河南某酒企。

蛋白胨、牛肉粉、酵母粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；可溶性淀粉（生化試劑）、Na2PHO4、MgSO4、葡萄糖（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉（生化試劑）、NaCl（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；土壤基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒FastDNASPIN kit for Soil：美國(guó)MP biomedicals公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH值7.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，可溶性淀粉20 g/L，Na2PHO45 g/L，MgSO40.1 g/L，NaCl 0.1 g/L，pH值7.0。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS型蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZWY-100H型恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器有限公司；DH-400型恒溫培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；HH-S型水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；TGL-20M型離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；721S型分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：鄭州利研儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的分離與初篩

取10 g大曲樣品加入90 mL無菌水，180 r/min振蕩混勻20 min；進(jìn)行10倍梯度稀釋，將10-3、10-4、10-5梯度的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；在培養(yǎng)基中滴加0.05%的盧戈式碘液，測(cè)定菌落透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d），進(jìn)行初篩，取D/d值較大的菌株進(jìn)行純化，用于后續(xù)復(fù)篩試驗(yàn)[17]。

1.3.2 產(chǎn)淀粉酶菌株復(fù)篩

將初篩的D/d＞2.5的菌株接種至100 mL種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，至OD600nm值達(dá)到1.0左右，以5%（V/V）接種量接種到裝液量為100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，收集發(fā)酵液于5 000 r/min離心5 min，取上清液（粗酶液）測(cè)定淀粉酶活力，進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 高產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，細(xì)胞經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢觀察。

分子生物學(xué)鑒定：復(fù)篩后淀粉酶活最高的菌株按照FastDNASPIN kit for Soil試劑盒說明書提取DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′）為上、下游引物，對(duì)其16S rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體參照劉延波等[19]的方法。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)與已知序列進(jìn)行比對(duì)，通過基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進(jìn)行比對(duì)搜索，選擇與待測(cè)物種序列相似性最大的同源序列，使用MEGA7.0軟件通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.4 高產(chǎn)淀粉酶菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的繪制

將高產(chǎn)淀粉酶菌株的種子液按5%（V/V）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值7.0，裝液量100 mL/250 mL，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)，每6 h取樣一次，24 h以后每隔1 d取樣一次，測(cè)定菌液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值，并取發(fā)酵液于5 000 r/min離心5 min，測(cè)定上清液的淀粉酶活力，分析該菌株的生長(zhǎng)規(guī)律及產(chǎn)淀粉酶特點(diǎn)。

1.3.5 高產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定基本培養(yǎng)基成分的碳源為20 g/L可溶性淀粉，氮源為20 g/L蛋白胨，基本培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，初始pH值7，裝液量100 mL/250 mL，接種量5%，發(fā)酵時(shí)間8 d。單因素試驗(yàn)中只改變其中一個(gè)因素，其他8個(gè)因素固定不變。分別考察碳源種類（可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、小麥、高粱、糯米）及其質(zhì)量濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）、氮源種類（蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、尿素、硫酸銨、硝酸鈉）及其質(zhì)量濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L）、發(fā)酵溫度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、轉(zhuǎn)速（120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min、240 r/min、270 r/min）、初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、裝液量（25 mL/250 mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL、150 mL/250 mL）及接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%）9個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)淀粉酶酶活力的影響。

1.3.6 高產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取碳源質(zhì)量濃度（X1）、氮源質(zhì)量濃度（X2）、初始pH值（X3）、接種量（X4）、轉(zhuǎn)速（X5）、發(fā)酵溫度（X6）、裝液量（X7）7個(gè)因素，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素選取高低2個(gè)水平，以-1和+1編碼各值，利用Design Expert10.0.8軟件對(duì)其進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以淀粉酶活（Y）為響應(yīng)值，篩選對(duì)菌株產(chǎn)淀粉酶具有顯著影響的因子，試驗(yàn)因素與水平見表1。1.3.7 高產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化最陡爬坡試驗(yàn)

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for culture conditions optimization

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，從7個(gè)因素中選取對(duì)淀粉酶活影響較大的3個(gè)顯著因素，采用最陡爬坡試驗(yàn)進(jìn)一步確定各因素水平、爬坡方向和步長(zhǎng)，確定用于Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

1.3.8 高產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選取影響淀粉酶活力最大的因素氮源質(zhì)量濃度（X2）、轉(zhuǎn)速（X5）、裝液量（X7）進(jìn)行優(yōu)化，以淀粉酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，其因素與水平見表2。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for culture conditions optimization

1.3.9 淀粉酶活力的測(cè)定[20]

取粗酶液1 mL，于65 ℃水浴預(yù)熱5 min，加1 mL淀粉含量為1%的磷酸檸檬酸緩沖液（pH值6.0），65 ℃恒溫水浴保溫30 min，加入2 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴加熱5 min，立即在冰水中冷卻，加水定容至10 mL，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值。對(duì)照組為在1 mL粗酶液中先加2 mL DNS，之后加入1 mL淀粉含量為1%的磷酸檸檬酸緩沖液，其他步驟相同，由實(shí)驗(yàn)組吸光度值減去對(duì)照組吸光度值，計(jì)算淀粉酶活力?？瞻捉M為2 mL蒸餾水加2 mL DNS試劑，其他步驟相同，定容至10 mL，在波長(zhǎng)540 nm處調(diào)節(jié)零點(diǎn)。

淀粉酶酶活定義：在65 ℃、pH值6條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的分離及篩選

經(jīng)篩選培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行稀釋涂布分離，從中溫大曲樣品中共分離純化得到70株不同形態(tài)的產(chǎn)淀粉酶菌株，經(jīng)盧戈式碘液染色，測(cè)量D/d值進(jìn)行初篩，并通過測(cè)定其產(chǎn)淀粉酶活力進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果見表3。由表3可知，得到D/d值＞2.5的菌株共6株，分別編號(hào)為菌株BM-34、SHBQ-36、DQ47、SHAM-7、SHAM-8及SHAM-28。經(jīng)復(fù)篩獲得菌株DQ47產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)，D/d值與淀粉酶活力均為最高值，分別為2.98、552.78 U/mL。因此，對(duì)該菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

表3 高產(chǎn)淀粉酶菌株的初篩及復(fù)篩結(jié)果Table 3 Results of preliminarily screening and second screening of high yield amylase strains

2.2 菌株DQ47的鑒定

2.2.1 菌株DQ47的形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)菌株DQ47進(jìn)行劃線培養(yǎng)及革蘭氏染色，其菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株DQ47的菌落形態(tài)（A）及細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain DQ47

由圖1A可知，菌株DQ47的菌落較大且不規(guī)則，表面粗糙有褶皺，顏色為灰白色；由圖1B可知，菌株DQ47經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體為桿狀，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定菌株DQ47為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.2.2 菌株DQ47的分子生物學(xué)鑒定

使用MEGA7.0軟件基于16S rRNA基因序列構(gòu)建菌株DQ47的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列菌株DQ47的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain DQ47 based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株DQ47與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）IAM12118親緣關(guān)系相近，結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，菌株DQ47被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株DQ47的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)淀粉酶酶活曲線的測(cè)定

由圖3可知，菌株DQ47的生長(zhǎng)趨勢(shì)和產(chǎn)淀粉酶活力變化不完全同步。菌株DQ47的遲滯期為0～6 h，生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期為6～24 h，1～6 d進(jìn)入穩(wěn)定期，6～8 d進(jìn)入衰亡期。發(fā)酵時(shí)間在0～8 d范圍內(nèi)增加，淀粉酶活力逐漸增加，在第8天達(dá)到最大值（2 723 U/mL），發(fā)酵時(shí)間＞8 d之后，淀粉酶活力下降。淀粉酶合成受到底物淀粉的誘導(dǎo)，在菌株生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期后，依舊延續(xù)合成淀粉酶，據(jù)此，推斷菌株DQ47所產(chǎn)淀粉酶酶生物合成模式為延續(xù)合成型，選擇酶活力達(dá)到最大時(shí)終止發(fā)酵，即發(fā)酵周期為8 d。在目前研究中，從大曲中篩選得到的產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌發(fā)酵周期多在36～96 h范圍內(nèi)[14-15，18]。

圖3 菌株DQ47的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)淀粉酶曲線Fig.3 Growth curve and amylase production curve of strain DQ47

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖4A可知，以可溶性淀粉為碳源時(shí)，淀粉酶活力最高為3 231.35 U/mL，與胡紅偉等[21]的研究結(jié)果一致，這可能是由于淀粉易于被微生物直接利用，其提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促使菌體量不斷增加，進(jìn)而提高淀粉酶產(chǎn)量[22]，因此，確定最佳碳源為可溶性淀粉。由圖4B可知，酵母粉作為氮源時(shí)淀粉酶活力（5 170.56 U/mL）顯著高于其他氮源種類（P＜0.05），相比于無機(jī)氮源，有機(jī)氮源更能促進(jìn)菌株產(chǎn)淀粉酶，因?yàn)橛袡C(jī)氮源含有豐富的氨基酸、維生素及生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于菌體生長(zhǎng)[23]，而酵母粉分子比其他有機(jī)氮源分子小，更有利于菌體吸收，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此，確定最佳氮源為酵母粉。

由圖4C可知，隨可溶性淀粉質(zhì)量濃度在10～60 g/L范圍內(nèi)的升高，淀粉酶活力不斷提高；可溶性淀粉質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，淀粉酶活力最高達(dá)到7 022.69 U/mL；可溶性淀粉質(zhì)量濃度＞60 g/L，淀粉酶活力開始降低。因此，確定可溶性淀粉最佳質(zhì)量濃度為60 g/L。由圖4D可知，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度在10～30g/L范圍內(nèi)的升高，淀粉酶活力不斷提高；當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值（7 119.82 U/mL）；當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度＞30 g/L之后，淀粉酶活力開始降低。在微生物生長(zhǎng)過程中，碳源和氮源的濃度起著十分重要的作用，濃度過低，微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，濃度過高，又會(huì)出現(xiàn)底物反饋抑制，進(jìn)而影響微生物的產(chǎn)酶[24]。因此，確定最佳酵母粉質(zhì)量濃度為30 g/L。

發(fā)酵溫度可直接影響微生物的生長(zhǎng)和淀粉酶的產(chǎn)生，溫度過高或過低都會(huì)抑制酶的表達(dá)[25]。由圖4E可知，隨著發(fā)酵溫度在31～39 ℃范圍內(nèi)的升高，淀粉酶酶活力顯著升高；當(dāng)發(fā)酵溫度增加至39 ℃時(shí)，淀粉酶活力達(dá)到最大值，4 175.83 U/mL；發(fā)酵溫度＞39 ℃之后，淀粉酶活力下降。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為39 ℃。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)淀粉酶酶活力的影響Fig.4 Effects of different culture conditions on amylase activity

由圖4F可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在120～180 r/min范圍內(nèi)增加，淀粉酶活力提高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，淀粉酶活力提高達(dá)到最大值4 120.38 U/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞180 r/min之后，淀粉酶活力下降。因此，確定最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。由圖4G可知，裝液量在25 mL/250 mL～100 mL/250 mL范圍內(nèi)增加，淀粉酶活逐漸增加；當(dāng)裝液量為100 mL/250 mL時(shí)，淀粉酶活達(dá)到最大值，為3 267.72 U/mL；當(dāng)裝液量＞100 mL/250 mL之后，淀粉酶活下降。由于枯草芽孢桿菌是兼性厭氧菌，當(dāng)氧氣供應(yīng)不足時(shí)會(huì)進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵途徑，進(jìn)而影響產(chǎn)酶效率；當(dāng)氧氣供應(yīng)過量時(shí)，會(huì)存在一定的氧毒性，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和酶的表達(dá)[26]。因此，確定最佳裝液量為100 mL/250 mL。

由圖4H可知，當(dāng)初始pH值在4～6范圍內(nèi)增加，淀粉酶活逐漸增加；當(dāng)初始pH值為6時(shí)，達(dá)到最大值，為4 708.36U/mL；當(dāng)初始pH值＞6之后，淀粉酶活逐漸下降，其原因可能是在白酒發(fā)酵過程中，原料中的淀粉和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，使得整個(gè)發(fā)酵環(huán)境偏酸性從而抑制微生物的活性[27]，與毛祥等[16]的研究結(jié)果一致。因此，確定最佳初始pH值為6。

由圖4I可知，當(dāng)接種量在1%～3%范圍內(nèi)增加，淀粉酶活逐漸增加；當(dāng)接種量為3%時(shí)，淀粉酶活力達(dá)到最大值，為3 214.60 U/mL；接種量＞3%之后，淀粉酶活力有所下降。因此，確定最佳接種量為3%。

2.4.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

由表5可知，7個(gè)因素中對(duì)響應(yīng)值影響的重要性順序?yàn)檗D(zhuǎn)速＞裝液量＞氮源質(zhì)量濃度＞發(fā)酵溫度＞碳源質(zhì)量濃度＞初始pH值＞接種量，其中，氮源質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速、裝液量是對(duì)淀粉酶酶活力影響顯著的因素（P＜0.05），該模型的P值為0.039，影響顯著，決定系數(shù)R2為0.925 1，表明該方程的擬合度較好，因此選擇氮源質(zhì)量濃度（X2）、轉(zhuǎn)速（X5）、裝液量（X7）做進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of Plackett-Burman tests

2.4.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化最陡爬坡試驗(yàn)

為逼近響應(yīng)面中心點(diǎn)，提高淀粉酶活，選取氮源質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)速、裝液量這3個(gè)顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳水平范圍，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。由表6可知，在試驗(yàn)組2的培養(yǎng)條件下，淀粉酶活力最高，為8 093.85 U/mL。因此，選擇試驗(yàn)組2的培養(yǎng)條件作為響應(yīng)面中心點(diǎn)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest climbing tests

2.4.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)及結(jié)果

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以淀粉酶活力（Y）為響應(yīng)值，以氮源質(zhì)量濃度（X2）、轉(zhuǎn)速（X5）、裝液量（X7）為自變量，利用Design Expert10.0.8軟件進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表7 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of Box-Behnken tests for culture conditions optimization

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert10.0.8軟件對(duì)表7的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，獲得淀粉酶酶活力（Y）對(duì)氮源質(zhì)量濃度（X2）、轉(zhuǎn)速（X5）、裝液量（X7）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=8 020.29+225.17X2+485.73X5-1 275.74X7+311.55X2X5-2 01.37X2X7-22.57X5X7+169.19X22-2 176.31X52-2 701.58X72。

由表8可知，該回歸模型極顯著（P=0.000 1＜0.01），說明擬合回歸方程有意義，模型達(dá)到極顯著水平；且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.072 9＞0.05），回歸模型決定系數(shù)R2=0.995 3，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較小，試驗(yàn)精度高，能夠較好描述試驗(yàn)結(jié)果且用于預(yù)測(cè)考察因素與淀粉酶活力之間的關(guān)系。由P值可知，一次項(xiàng)X5、X7，二次項(xiàng)X52、X72對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)X2，交互項(xiàng)X2X5對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響淀粉酶活的因素主次順序?yàn)閄7＞X5＞X2，即裝液量＞轉(zhuǎn)速＞氮源質(zhì)量濃度。各因素間交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素間交互作用對(duì)淀粉酶活力影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on amylase activities

由圖5可知，氮源質(zhì)量濃度（X2）與轉(zhuǎn)速（X5）間交互作用曲面較陡，等高線較密集，說明其交互作用對(duì)淀粉酶活力影響顯著（P＜0.05），而裝液量（X7）與氮源質(zhì)量濃度（X2）、轉(zhuǎn)速（X5）與裝液量（X7）有一定交互作用，但交互作用對(duì)淀粉酶活力影響不顯著（P＞0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)Design-Expert10.0.8軟件分析得到的最優(yōu)培養(yǎng)條件為氮源質(zhì)量濃度36.84 g/L，轉(zhuǎn)速175.25 r/min，裝液量85.98 mL/250 mL。在此條件下，淀粉酶活力的預(yù)測(cè)值為8 285.45 U/mL。為方便實(shí)際操作，將培養(yǎng)條件修正為氮源質(zhì)量濃度37 g/L，轉(zhuǎn)速175 r/min，裝液量85 mL/250 mL。以此最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得淀粉酶活力的實(shí)際值為8 158.23 U/mL，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型可行。

3 結(jié)論

本研究從中溫大曲中篩選出一株淀粉酶活力較高的菌株DQ47，通過形態(tài)觀察與16S rRNA同源序列分析，被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。通過測(cè)定菌株DQ47生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)淀粉酶酶活曲線，確定其發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶的周期為8 d，且其酶合成模式為延續(xù)合成型，這種持續(xù)生長(zhǎng)、持續(xù)產(chǎn)酶的發(fā)酵特性可使其在白酒釀造具有較高的應(yīng)用價(jià)值。采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定其最優(yōu)培養(yǎng)條件為：可溶性淀粉60 g/L、酵母粉37 g/L、發(fā)酵溫度39 ℃、裝液量85 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速175 r/min、初始pH值6、接種量3%，在此最佳培養(yǎng)條件下，淀粉酶活力達(dá)到8 158.23 U/mL，是優(yōu)化前的14.75倍。在后續(xù)研究工作中，將進(jìn)一步考察菌株DQ47對(duì)濃香型白酒出酒率的影響，以期為產(chǎn)淀粉酶功能微生物在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。