乳清添加對馬蘇里拉奶酪成熟過程中風味物質及其品質的影響

張榮榮，龐 博，馬 玲

（山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

馬蘇里拉奶酪屬于帕斯塔菲拉塔（Pasta Filata）中的一種，其在制作時需要經(jīng)歷一個特殊的熱燙拉伸過程，此過程會使奶酪具備纖維狀的蛋白結構以及融化拉絲的功能特性[1]。熱燙拉伸會使奶酪凝塊具備良好的拉伸、延展能力，且能賦予其獨特的口感及特點[2]。馬蘇里拉奶酪具有獨特的纖維狀結構和高營養(yǎng)價值，在國際市場上占有重要地位。

乳清是在奶酪、干酪素制作時出現(xiàn)的附帶產(chǎn)物，其固形物含量為6.0%～6.5%，包含有牛乳中55%的營養(yǎng)成分，此外乳清中的乳清蛋白屬于全價蛋白，含有20種氨基酸，其中硫基酸含量偏低，剩下其余類型的必需氨基酸含量均較高[3-6]。乳清中除了含有乳礦物質以及乳清蛋白等基本營養(yǎng)成分外，其中還殘留有一部分制作奶酪時的凝乳酶，因而回收利用乳清不但能極大程度的再利用乳清中的營養(yǎng)成分，降低乳清直接排放帶來的環(huán)境污染[7]，同時可以再利用其中的凝乳酶。在全球每年生產(chǎn)干酪素和奶酪所產(chǎn)生的乳清可達到1.5×109～1.7×109t[8-9]，所以合理再利用乳清成為亟待解決的問題。

目前，關于乳清的再利用主要是制備乳清蛋白產(chǎn)品，如乳清濃縮蛋白、乳清粉、乳清分離蛋白[10-11]，將乳清濃縮后制作乳清發(fā)酵乳[12]或將乳清蛋白添加在牛乳中制作奶酪。GAMLATH C J等[13]將加熱后的乳清蛋白聚合物加入低脂牛奶中制成低脂奶酪，發(fā)現(xiàn)加熱處理后的乳清蛋白可以改善低脂奶酪原本堅硬的質地，且奶酪的微觀結構更加緊密；CAGNO R D等[14]采用微粒乳清蛋白濃縮物（microparticulated whey protein concentrate，MWPC）制作Caciotta奶酪，研究發(fā)現(xiàn)，加入MWPC的奶酪風味及口感更佳；遲濤等[15]將乳清蛋白作為脂肪替代物加入奶酪中可以提高奶酪的水解程度，且能改善奶酪的風味；閆文杰等[16]直接將大豆蛋白加入乳清中，再添加檸檬酸使其酸化制成乳清干酪；但還未見有乳清在奶酪制作中的再利用研究。

本研究以不添加乳清制備的奶酪為對照組，研究乳清添加對奶酪成熟過程中乳酸菌活菌數(shù)、油脂析出性、氨基酸及風味物質種類及含量的影響，旨在提高乳清中乳清蛋白等營養(yǎng)物質、凝乳酶的回收利用率，為乳清再利用開辟新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckilsubsp.bulgaricus）∶唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）=1∶1）：山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院乳品實驗室；凝乳酶（活力150 000 U/g）：丹尼斯克（中國）有限公司；食鹽（食品級）：晉中市太谷區(qū)家家利超市；鮮牛乳（抗生素檢測均為陰性）：山西農(nóng)業(yè)大學牧場；乳清：本實驗室自制奶酪后排出的副產(chǎn)物。

1.1.2 試劑

硫酸錳、硫酸鎂、氫氧化鈉、P-磷酸甘油二鈉、磷酸氫二鉀、抗壞血酸、檸檬酸銨、聚山梨酯-80、硫酸鐵銨、氯化鈉、乙醇（均為分析純）：天津市申泰化學試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；大豆粉木瓜酶消化物、酪蛋白胰酶消化物、肉胃酶消化物、MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

VORTEX-5漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；5804R高速離心機：德國Eppendorf公司；BVPJ-500TS真空包裝機：嘉興艾博實業(yè)股份有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HPP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BS224S電子分析天平：北京賽多利斯儀器有限公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；日本日立L-8900氨基酸分析儀：柜谷科技發(fā)展（上海）有限公司；LS-75HD蒸汽壓力滅菌鍋：濱江醫(yī)療設備有限公司；ISQ氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 馬蘇里拉奶酪的制作工藝

操作要點：

將鮮牛乳倒入奶酪槽中，于水浴鍋中63 ℃巴氏殺菌30 min，將滅菌后鮮牛乳牛奶快速冷卻至42 ℃，加入0.5%（V/V）的發(fā)酵劑，于42 ℃恒溫發(fā)酵30 min。在發(fā)酵完成的牛乳中加入3‰（V/V）的凝乳酶溶液（1%的食鹽水配制），攪拌均勻后在42 ℃條件下靜置30 min凝乳。待牛奶凝集成塊狀且不粘壁即可切割，將每組奶酪切成1.5 cm3的凝塊，靜置10 min后排出乳清。42 ℃條件下靜置堆釀30 min。乳清充分排出后，加入1.5%的食鹽，然后在92 ℃、75%的食鹽水中熱燙拉伸，將其壓成長方體，冷卻至常溫后真空包裝。貼標并在4 ℃冰箱中成熟90 d得到馬蘇里拉奶酪成品。

乳清奶酪的制作方法除了在加凝乳酶之前加入25%的乳清，并將凝乳酶的添加量降低為2.25‰外，其他工藝與對照奶酪的制作工藝相同。分別在0 d、30 d、60 d、90 d取樣，將對照奶酪編號為CK-0 d、CK-30 d、CK-60 d、CK-90 d，將乳清奶酪編號為RQ-0 d、RQ-30 d、RQ-60 d、RQ-90 d對照，測定各項指標。

1.3.2 活菌數(shù)的測定

取25 g奶酪于225 mL滅菌后的生理鹽水中，在勻漿機中以10 000 r/min的轉速勻漿1 min，然后用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取稀釋液進行平板計數(shù)。乳酸球菌和乳酸桿菌分別用M17和LBS培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)48 h，取菌落數(shù)在30～300個/平板的平板計數(shù)，結果以lg（CFU/g）表示。

1.3.3 油脂析出性的測定

參照李紅娟等[17]的方法進行測定。將奶酪樣品切成高度為7 mm、直徑為15 mm的圓柱形，將切好的圓柱形奶酪樣品放在預先鋪好濾紙的培養(yǎng)皿中，將其放于110 ℃的烘箱中加熱1 h后取出，恢復室溫后，測量濾紙上形成的油圈的直徑。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質的測定

參考趙赟等[18]的GC-MS法測定。前處理條件：取奶酪樣品5 g，將其切成芝麻粒大小，加入25 mL萃取瓶中，再將萃取瓶蓋迅速蓋緊，將其加熱到60 ℃水浴平衡30 min，再將老化完成的固相微萃取（solid-phase micro-extraction，SPME）萃取頭（65 μm DVB/PDMS）插入萃取瓶中萃取30 min。

GC條件：進樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣（He），流速為1.0 mL/min；升溫程序為初始柱溫40 ℃，維持3 min，以6 ℃/min升至200 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，維持10 min。

MS條件：離子源溫度230 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，檢測器的電壓1 000 V，質譜掃描范圍35～400 m/z。

1.3.5 游離氨基酸含量的測定

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中的方法測定奶酪中的游離氨基酸含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均有3個生物學重復，結果用“平均值±標準差”表示。采用Microsoft Excel 2007整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析，采用SIMCA 14.0軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。氨基酸組成熱圖及相關性熱圖用Hiplot進行繪制，其余圖形用Origin 8.0軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 不同奶酪成熟期內活菌數(shù)的變化

對照奶酪和乳清奶酪在成熟期間（0～90 d）活菌數(shù)的變化見表1。由表1可知，乳清奶酪與對照奶酪在成熟過程中乳酸菌活菌數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，且在同一個成熟期內，乳清奶酪的活菌數(shù)顯著高于對照奶酪中活菌數(shù)（P＜0.05）。在成熟期30 d時，乳清奶酪和對照奶酪中的乳酸菌活菌數(shù)均達到最大值，其中對照奶酪中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)增加9%，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)增加10%。乳清奶酪中保加利亞乳桿菌活菌數(shù)增加10%，嗜熱鏈球菌活菌數(shù)增加11%[19]。

表1 不同奶酪成熟期期間活菌數(shù)的變化Table 1 Changes of viable bacterial count of different cheeses during the ripening period

奶酪在成熟初期活菌數(shù)呈增長趨勢，增長的主要原因可能是奶酪中含有的大量營養(yǎng)物質適合微生物生長繁殖；在奶酪成熟中后期，隨著奶酪成熟時間的增長，其水分含量下降，從而導致奶酪中鹽濃度增大，在此階段，奶酪中可供微生物生長繁殖的營養(yǎng)物質含量也在下降，從而抑制了微生物的生長，所以在奶酪成熟后期，活菌數(shù)量減少[20]。在成熟期，乳清奶酪的乳酸菌活菌數(shù)＞對照奶酪，分析主要原因可能是乳清中含有一部分乳糖，乳糖為乳酸菌提供了大量底物，可以促進乳酸菌的增長繁殖[21]。

2.2 不同奶酪成熟期內油脂析出性的變化

奶酪加熱溫度達到40 ℃以上時，其融化性、拉伸性、流動性、油脂析出性等性質會隨加熱溫度的上升而顯現(xiàn)出來，奶酪的油脂析出性既反映出了奶酪加熱后的流動分散能力，還能體現(xiàn)出奶酪內部的膠束結構的完整性[20]。對照奶酪和乳清奶酪在成熟期間（0～90 d）油脂析出性的變化見圖1。

由圖1可知，在奶酪成熟期間，油脂析出性一直呈上升趨勢，而且在同一成熟期間，對照奶酪的油脂析出性＜乳清奶酪。在0～90 d的成熟期內，乳清奶酪的油脂析出性增加62.0%，對照奶酪的油脂析出性增加58.8%。乳清奶酪的油脂析出性高于對照奶酪，分析原因可能是添加乳清后，乳清中含有的乳清蛋白使酪蛋白的結構順序發(fā)生了改變；奶酪油脂析出性的變化與蛋白質降解及蛋白質結構有很大的關系，酪蛋白基質的結構受到奶酪液相狀態(tài)和酪蛋白鈣的影響，與此同時酪蛋白基質的結構可控制脂肪的包裹從而可以影響到酪蛋白網(wǎng)絡結構的拉伸特性[22]。在奶酪成熟期內由于蛋白質的降解，減弱了蛋白之間的相互作用，使蛋白膠束間的結構也變弱，從而導致了蛋白膠束結構之間的乳漿中存在脂肪，這些脂肪逐漸聚團會形成較大的脂肪顆粒，在較高的溫度情況下，大脂肪顆粒很容易被釋放出來，因此會增加奶酪的油脂析出性。

圖1 不同奶酪在成熟期間油脂析出性的變化Fig.1 Changes of oil release properties of different cheeses during the ripening period

2.3 不同奶酪成熟期內揮發(fā)性風味物質的變化

2.3.1 揮發(fā)性風味物質檢測結果

對照奶酪和乳清奶酪在成熟期間（0～90 d）揮發(fā)性風味物質GC-MS檢測結果見表2。由表2可知，從兩種奶酪中共檢測到61種揮發(fā)性風味物質，包括酸類22種、醇類9種、醛類7種、酯類16種、酮類7種。其中對照奶酪中共檢出43種，包括酸類14種、醇類8種、醛類4種、酯類13種、酮類4種；其中乳清奶酪中共檢出55種，包括酸類22種、醇類7種、醛類7種、酯類13種、酮類6種。在剛制備好奶酪（0 d）時，乳清奶酪相較于對照奶酪而言，酯類、酸類、酮類相對含量更多。當成熟到30 d時，兩種奶酪中的醛、酸、酯、酮類物質相對含量及種類均增加，除醇類物質外，對照奶酪中的風味物質種類及含量均少于乳清奶酪。當成熟到60 d時，奶酪中的醇、酸、酯類物質相對含量及種類相較于30 d時呈增加的趨勢；醛和酮類物質呈下降趨勢，因為醛和酮類物質均為羰基類化合物，在奶酪中不穩(wěn)定，停留時間較短，會很快轉換為相應的酯和酸[23]。當成熟到90 d時，奶酪中的酮、醛類物質相對含量呈下降趨勢，酯類物質相對含量呈上升趨勢，原因可能是在奶酪成熟后期酸類物質分解為酯類物質[24]，酯類物質可賦予奶酪香氣，所以酯類物質含量的增加可以直接影響奶酪的香味[25]。在奶酪成熟后期酸類物質含量下降，表明酸類物質在脂肪降解和蛋白水解的作用下可以分解生成酯類物質，可提升奶酪的風味[24，26]。乳清奶酪中風味物質含量高于同期對照奶酪，可以說明在成熟期間，乳清奶酪的風味強于同時期的對照奶酪。

表2 不同奶酪成熟期間主要揮發(fā)性風味物質的變化Table 2 Changes of main volatile flavor substances of different cheeses during the ripening period

續(xù)表

酸類物質對奶酪的風味物質有重要影響，在檢測出的酸類物質中，乙酸、丁酸、辛酸、癸酸的揮發(fā)性較強，且這些酸在馬蘇里拉奶酪中均可以被檢測出，乙酸帶有醋味[27]，是由奶酪中微生物所代謝的乳糖所產(chǎn)生的；丁酸以及辛酸帶有強烈的奶油氣味[27-29]；己酸帶有奶香氣味并略帶油脂氣[27]；癸酸帶有蠟脂香[30]。酸類物質主要可以降低奶酪的pH值抑制腐敗菌的生長，是其他物質的前體物質，在奶酪成熟中后期酸類物質可被降解氧化生成其他風味物質。兩種奶酪的酯類物質種類及含量均較多，酯類物質可為奶酪提供花香味及果香味，丁酸乙酯帶有蘋果味[30]、正己酸乙酯帶有果香[31]、丁位十一內酯帶有果香味[32]，酯類物質對奶酪整體香味影響較大[33-34]。酮類及醛類物質的閾值較低，在奶酪中的存留時間很短，但是影響奶酪風味的重要因素且酮類物質大多是由不飽和脂肪酸氧化而形成的，是產(chǎn)生牛奶香味的重要來源[35]，己醛帶青草香味[36]、壬醛帶有油脂香氣[37]、2-十一酮帶有牛奶香味[35]、3-辛酮帶有甜橙香氣[38]。本實驗在馬蘇里拉奶酪中共檢測出7種醛類物質，且這些醛類物質大多是在成熟前中期檢測到的，因為此類物質會很快被還原為相應的醇和酸。醇類物質在0 d時很少被檢測出來，在奶酪成熟過程中醇類物質主要由乳糖代謝、酮類物質還原、氨基酸的代謝以及脂肪酸降解產(chǎn)生[39]。

結果表明，在奶酪成熟過程中（0～90 d），越到成熟后期，奶酪的風味物質更多，酸類物質明顯減少，分解為酯類和醇類物質，且所有揮發(fā)性物質中乳清奶酪所占比例更大，說明乳清奶酪中的揮發(fā)性風味物質優(yōu)于對照奶酪。

2.3.2 揮發(fā)性風味物質的主成分分析

基于揮發(fā)性風味物質進一步對乳清奶酪與對照奶酪成熟期樣品進行主成分分析，結果見圖2。

圖2 不同奶酪成熟期揮發(fā)性風味物質主成分分析結果Fig.2 Principal component analysis results of volatile flavor components of different cheeses during the ripening period

由圖2可知，PC1的方差貢獻率為61.6%，PC2的方差貢獻率為17.6%，累計方差貢獻率為79.2%，說明此模型預測能力可靠，可以說明整體的樣本信息。乳清奶酪與對照奶酪分布在不同區(qū)域，乳清奶酪集中在第一、二象限，對照奶酪則集中在第三、四象限；結果表明，乳清奶酪與對照奶酪中的揮發(fā)性風味物質有明顯區(qū)別。

2.4 不同奶酪成熟期內氨基酸含量的變化

對照奶酪和乳清奶酪在成熟期間（0～90 d）氨基酸含量的變化見圖3。

圖3 不同奶酪成熟期間氨基酸含量的變化Fig.3 Changes of amino acid contents of different cheese during the ripening period

由圖3可知，從乳清奶酪和對照奶酪成熟期間均分別檢測到15種游離氨基酸，兩種奶酪的氨基酸含量存在差異，乳清奶酪中氨基酸含量明顯高于對照奶酪。兩種奶酪在成熟0～30 d期間氨基酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢；在成熟期30～90 d內，伴隨成熟時間的增長，并不是所有類型氨基酸的含量都可隨著奶酪成熟期的增長而變高。除苯丙氨酸、蘇氨酸的含量隨著成熟時間的延長而增大之外，在成熟期30～60 d之間其余氨基酸含量均呈現(xiàn)出下降的趨勢，探究其原因可能是奶酪中仍殘留有部分凝乳酶及奶酪中微生物代謝所產(chǎn)生的部分酶將奶酪中氨基酸轉化為其他風味物質如醛、酸、酮、醇、酯類物質[24]，除苯丙氨酸、蘇氨酸外的其他氨基酸在成熟期60～90 d期間含量呈上升趨勢，主要是因為隨著成熟時間的增加，蛋白質的水解程度不斷增加，奶酪中微生物的活性降低，從而導致成熟后期奶酪中氨基酸的含量再次呈上升的趨勢[40]。

2.5 不同奶酪成熟期內揮發(fā)性風味物質與氨基酸的相關性分析

為了研究氨基酸與奶酪風味之間的關系，對不同奶酪成熟期內揮發(fā)性風味物質與氨基酸進行相關性分析，結果見圖4。由圖4可知，精氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在奶酪成熟期間對奶酪的風味物質起重要作用，精氨酸和酪氨酸與苦味有關，丙氨酸和蘇氨酸屬于甜味氨基酸[41]；苯丙氨酸在奶酪成熟期間會分解為有奶香味的醇類物質[42]。除精氨酸、絲氨酸、酪氨酸、天冬氨酸外，其余氨基酸對亞油酸、肉豆蔻酸、十三烷酸、月桂酸、己酸、乙酸、十一烷酸、癸酸、2-癸醇、1,3-丁二醇、2,3-丁二醇、2-十四烷醇、2-辛醇、2-辛炔酸乙酯、油酸甲酯、丁位十一內酯、甘油單油酸酯、亞油酸乙酯、辛酸-1-甲基乙醇酯及順-11-十六碳醛具有積極的作用。

圖4 不同奶酪氨基酸及揮發(fā)性風味物質相關性分析熱圖Fig.4 Correlation analysis heat map of amino acid and volatile flavor substances of different cheese

3 結論

本研究考察乳清添加對Mozzarella奶酪成熟期（0 d、30 d、60 d、90 d）乳酸菌活菌數(shù)、油脂析出性、揮發(fā)性風味物質及氨基酸含量變化的影響，結果表明，在成熟期0～90 d，兩種Mozzarella奶酪中乳酸菌活菌均先增加后減小，油脂析出性增大；兩種奶酪中共檢測到61種揮發(fā)性風味物質，對照奶酪中共檢出43種，乳清奶酪中共檢出55種，醛、酸、酮類物質的含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，醇類物質的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，酯類含量有不同程度的增加；總氨基酸含量呈現(xiàn)先上升，再小幅度下降，最后又上升的波動式變化。在成熟期間，與未添加乳清的對照奶酪相比，乳清奶酪的乳酸菌活菌數(shù)及油脂析出性均高于對照奶酪；兩種奶酪成熟期間均分別檢測出15種游離氨基酸，成熟期90 d時，乳清奶酪的氨基酸總含量（848.92 mg/kg）高于對照奶酪（663.44 mg/kg）。通過揮發(fā)性風味物質與氨基酸間的相關性分析發(fā)現(xiàn)，除精氨酸、絲氨酸、酪氨酸、天冬氨酸外，其余氨基酸對20種揮發(fā)性風味物質具有積極作用。綜上說明添加乳清對提升馬蘇里拉奶酪的風味具有重大意義，結果為乳清的再利用提供了理論依據(jù)。