乳酸菌發(fā)酵紅樹莓山楂復合果汁品質(zhì)分析

張倩茹，尹 蓉，王俊宇，茹建生，楊德宇，梁志宏

（山西農(nóng)業(yè)大學 果樹研究所 果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

紅樹莓（Rubus idaeusL.）為薔薇科懸鉤子屬漿果植物，含有多種對人體有益的功能性成分，包括必需氨基酸，樹莓酮等黃酮類，鞣花酸、花青素、黃烷-3-醇衍生物等多酚類，有機酸，超氧化物歧化酶等[1-3]。由于其味道鮮美、營養(yǎng)價值高，已成為當代飲食中的新寵，同時其功能活性也是國內(nèi)外學者研究的熱點。如紅樹莓具有抗氧化和抗炎特性，從而起到保護皮膚免受中波紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）引起的損傷[4]，具有保護肝臟[5]、抑制多種類型腫瘤生長的作用[6]，防止體質(zhì)量增加的作用等[7]。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）為薔薇科山楂屬仁果植物，含有原花色素等多酚類化合物、果膠、黃酮類化合物、三萜酸等多種生物活性成分[8-10]，是我國特有的藥食兼用樹種，具有調(diào)節(jié)免疫力[11]、降血糖[12]、抗腫瘤、抗氧化、減少黑色素生成[13]及健脾開胃、消食化滯、活血化瘀等作用。紅樹莓多以鮮食或鮮果速凍后出口，不耐儲運、附加值低，而國內(nèi)對于紅樹莓的加工又相對滯后，制約紅樹莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展。山楂加工產(chǎn)業(yè)雖然起步早，但多年來發(fā)展緩慢，仍然以糖葫蘆、蜜餞為主，同樣制約著山楂產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

益生菌發(fā)酵果蔬汁不僅可以增加其有機酸、香氣物質(zhì)等功能性成分的種類及含量、改善風味，而且可以提高降血糖、抗氧化、抗腫瘤等保健功效，是近年來功能性食品研究的熱點之一[14-15]。綦菲等[16]以新鮮紅樹莓為原料，研究了紅樹莓酵素的最佳發(fā)酵工藝；劉麗娜等[17]以紅樹莓、牛奶為主要原料，研究了紅樹莓發(fā)酵乳飲料的最佳配方；常曼曼等[18]采用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）發(fā)酵紅樹莓果汁，并測定了其總酚和黃酮含量。黃豪等[19]選用6種乳酸菌發(fā)酵山楂汁，并研究了發(fā)酵對山楂汁理化性質(zhì)、酚類物質(zhì)、體外抗氧化性、色值和風味物質(zhì)的影響。張巧等[20]以大果山楂和紅糖為主要原料制備酵素，并測定了自然發(fā)酵過程中pH值、總糖、總酚含量及抗氧化活性的變化。目前，紅樹莓、山楂多采用酵母菌和醋酸菌發(fā)酵或添加牛奶用以乳酸發(fā)酵，且多研究其發(fā)酵配方及工藝，而采用復合乳酸菌發(fā)酵紅樹莓山楂純果汁（即不添加含乳成分，包括動物蛋白、植物蛋白等）并研究其功能活性成分及理化指標的研究鮮有報道。

本研究利用紅樹莓和山楂混合果汁為原料，采用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）三種乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合發(fā)酵制備紅樹莓山楂復合果汁，分析發(fā)酵前后的成分變化，并進行感官分析，以期為紅樹莓和山楂的綜合加工利用、品質(zhì)分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓、山楂：均采摘于山西農(nóng)業(yè)大學果樹所資源圃；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）300B、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）500B、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）500B（均為直投式）：北京和益源生物技術(shù)有限公司；丙酮、濃硫酸、氯化鋰、碳酸鈉、鎢酸鈉、磷鉬酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；有機酸標準品、氨基酸標準品、維生素C（vitamin C，VC）標準品（純度均＞98%）：上海源葉生物有限公司；葡萄糖、小蘇打粉、果葡糖漿（均為分析純）、果膠酶（10 000 U/g）：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

930 Compact IC Flex智能集成型離子色譜：瑞士萬通有限公司；S-433全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司；QP2010Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：日本島津公司；UV-752型紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；ZYZ-V11原汁機：九陽股份有限公司；HG-400V實驗室高速均質(zhì)機：德國WIGGENS公司；XK97-A菌落計數(shù)器：杭州齊威儀器有限公司；C18SPE固相萃取柱（十八烷基硅膠填充物500 mg）：北京吉瑞森科技有限責任公司；FE28 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的加工工藝流程及操作要點

紅樹莓、山楂→篩選→清洗→山楂去籽→稱取質(zhì)量比為1∶1的紅樹莓和山楂果肉→加入紅樹莓和山楂果肉3倍質(zhì)量的純凈水→打漿→過濾備用→酶解（果膠酶添加量0.1 g/100 g）→過濾→調(diào)配（加入紅樹莓山楂果肉質(zhì)量25%的葡萄糖）→滅菌（85 ℃、18 min）→冷卻（冷卻后的紅樹莓山楂汁即為發(fā)酵原液）→接種（接種比例為植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌∶副干酪乳桿菌為1∶1∶1，接種量為1%）→發(fā)酵（37 ℃恒溫發(fā)酵36 h）→調(diào)配→復合發(fā)酵飲料成品

1.3.2 理化指標分析檢測

總酚含量：采用福林-酚法[21]測定；氨基酸含量：采用GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》規(guī)定的方法測定；活菌數(shù)：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》規(guī)定的方法測定；pH值：采用酸度計測定；維生素C含量：采用離子色譜法測定。

揮發(fā)性風味物質(zhì)含量測定：采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)。將10 mL樣品加入20 mL頂空瓶中，在60 ℃條件下平衡30 min，吸附45 min后進行GC-MS分析。氣相色譜條件：進樣口溫度240 ℃；柱溫起始溫度35 ℃，保持3 min，升溫程序：以10 ℃/min升至75 ℃，再以5 ℃/min升至200 ℃，再以8 ℃/min升至240 ℃，保持10 min，載氣為氦氣（He），流速2.0 mL/min。質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度220 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～500 m/z。定性定量分析：通過與美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）及匹配度的分析，并結(jié)合已報道的國內(nèi)外文獻對其進行分析比較，采用峰面積歸一化法計算各組成分相對含量。

有機酸含量測定：采用離子色譜法，Metrosep Organic Acids-250/7.8有機酸柱和電導檢測器，50 mmol/L的氯化鋰再生液，含有15%丙酮的2 mmol/L硫酸淋洗液，測定有機酸種類與含量[22]。

1.3.3 感官分析

感官評分標準的制定參考白桂英等[23]的方法及輕工行業(yè)標準QB/T 5323—2018《植物酵素》及企業(yè)標準Q/RHJS 0003S—2022《果蔬酵素飲》，評定小組由10名（5名女性，5名男性，不同年齡段）受過感官評定培訓的人員組成，從色澤與狀態(tài)、香氣、口感3個方面對紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料進行感官評分，滿分100分，取平均分，感官評分標準見表1。

表1 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成及含量分析

紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料游離氨基酸含量見表2。由表2可知，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料中游離基酸的總量為732.68 mg/kg，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中游離氨基酸含量≥33 mg/100 g 的要求。除胱氨酸外，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料含有16種氨基酸，包括人體8種必需氨基酸，由此可見，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料中氨基酸種類豐富。由于發(fā)酵時間較短，發(fā)酵前后游離氨基酸的總量相差不大，但酸味氨基酸含量差異明顯，其中天冬氨酸含量由發(fā)酵前的81.11 mg/kg增至143.78 mg/kg，谷氨酸由發(fā)酵前的118.69 mg/kg增至139.57 mg/kg，谷氨酸和天冬氨酸是發(fā)酵液中含量最高的兩種氨基酸，是酸味氨基酸，同時也是鮮味物質(zhì)形成的前提，由此可見經(jīng)過發(fā)酵后，發(fā)酵液酸味、鮮味等風味更加濃郁。

表2 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料游離氨基酸的測定結(jié)果Table 2 Determination results of free amino acids in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

2.2 揮發(fā)性風味成分的組成及含量分析

由表3可知，紅樹莓山楂發(fā)酵原液中共檢測出揮發(fā)性風味物質(zhì)44種，主要包括醇類、酯類、酮類以及酚類化合物等，發(fā)酵后共檢出揮發(fā)性風味物質(zhì)40種，主要包括酯類、酸類、酮類以及酚類化合物等。紅樹莓山楂發(fā)酵原液主要揮發(fā)性成分包括苯乙醇、α-松油醇、甲基丙酸-1-苯乙酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、δ-十一烷酸內(nèi)酯等，與張強等[24]的研究結(jié)果相一致。發(fā)酵后的紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料中風味物質(zhì)主要為丁香酚、異甲基紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、δ-十一烷酸內(nèi)酯、2,4-二（1,1-二甲基）苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯，這些物質(zhì)構(gòu)成了紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的主要風味。其中丁香酚、異甲基紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、δ-十一烷酸內(nèi)酯、2,4-二（1,1-二甲基）苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯等揮發(fā)性成分均在發(fā)酵后有所增加，此外經(jīng)過發(fā)酵，還增加了乙酸、苯甲酸、γ-癸內(nèi)酯、辛二烯、鄰苯二甲酸異丁基辛酯、乙酰檸檬酸三丁酯等風味物質(zhì)，其中丁香酚有甘甜的花香和辛香，異甲基紫羅蘭酮有紫羅蘭香氣，α-紫羅蘭酮有甜香、果香、木香，β-紫羅蘭酮有果香、木香，δ-十一烷酸內(nèi)酯有奶油香味、椰子及桃子樣的果香香氣。說明乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生多種新的風味物質(zhì)，另外一些原有的香氣物質(zhì)也有增加，使得紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料風味濃郁。

表3 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料揮發(fā)性風味成分的測定結(jié)果Table 3 Determination results of volatile flavor components in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

2.3 有機酸組成及含量分析

紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料發(fā)酵前后有機酸的種類及含量見表4。由表4可知，發(fā)酵后紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料主要含有7種有機酸，檸檬酸含量降低，乳酸和乙酸含量增加。乳酸菌能夠利用葡萄糖，代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸，從而導致發(fā)酵后乳酸和乙酸含量增加；檸檬酸可能作為碳源被微生物消耗[25]，從而導致發(fā)酵后檸檬酸含量降低。發(fā)酵后乳酸含量為3 215.24 mg/L，符合QB/T 5323—2018《植物酵素》中乳酸含量≥660 mg/kg的要求。乳酸口感相較于檸檬酸更為柔和，略帶乳香味，經(jīng)過發(fā)酵后紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料口感柔和。

表4 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料有機酸含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of organic acid contents in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

2.4 其他指標的測定結(jié)果

紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料其他指標測定結(jié)果見表5。

表5 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料其他指標測定結(jié)果Table 5 Determination results of other indexes in red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

由表5可以看出，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的pH為3.47、活菌數(shù)含量為2.2×107CFU/mL。酚類物質(zhì)和維生素C是紅樹莓和山楂中最為重要的抗氧化物質(zhì)，能起到抗氧化、預防腫瘤等作用，是評價果汁飲料品質(zhì)和功能的重要指標[26]。由表5可以看出，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料中總酚含量略有下降，這一結(jié)果與趙男等[27]的研究結(jié)果一致。不同乳酸菌發(fā)酵不同果蔬汁對酚類物質(zhì)含量影響不同，ESCUDERO-LOPEZ B等[28]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵橙汁后總酚含量基本不變；盧嘉懿等[29]研究發(fā)現(xiàn)，芒果、青瓜汁的總酚含量有較明顯上升，西瓜、番茄、蜜柚和臍橙基本持平，蘋果和蜜梨的總酚含量則稍有降低。導致發(fā)酵前后酚類物質(zhì)含量變化的原因可能是乳酸菌能夠代謝果蔬汁中的酚類物質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化為具有較高的生物可利用性和生物活性的小分子酚類化合物[30]，從而導致發(fā)酵前后果蔬汁中總酚含量變化。此外酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中容易被氧化導致含量降低，而酸性環(huán)境又能夠減緩酚類物質(zhì)的氧化[31]。紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料維生素C的含量降低，可能是由于維生素C本身極容易被氧化而導致維生素C降低。

2.5 感官評價結(jié)果

將發(fā)酵36 h后的紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料，放入4 ℃冰箱中冷藏24 h，進行感官評價，結(jié)果見表6。

表6 紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的感官評價Table 6 Sensory evaluation of red raspberry and hawthorn compound fermented beverage

由表6可以看出，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料的感官評分為86.25分。紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料呈粉紅色，均勻穩(wěn)定，無明顯沉淀物、懸浮物和渾濁現(xiàn)象，具有紅樹莓、山楂及發(fā)酵的香氣，香味濃郁，口感純正細膩，爽口，微酸，有回味。

3 結(jié)論

本研究采用植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌三種乳酸菌復合發(fā)酵紅樹莓山楂純果汁，開發(fā)出紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料。采用氨基酸分析儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀、離子色譜等分析測定，比較發(fā)酵前后的氨基酸、風味物質(zhì)、有機酸、pH值、總酚和維生素C等種類與含量的變化，結(jié)果表明，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料中氨基酸種類豐富，含有16種氨基酸，包括人體8種必需氨基酸；共檢出40種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為一些酯類、酮類、酸類以及酚類化合物等，其中含量較高的丁香酚、異甲基紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮等都賦予發(fā)酵液甜香、果香、木香、奶油香味；發(fā)酵后有機酸含量增加，特別是乳酸含量顯著升高，活菌數(shù)達到2.2×107CFU/mL，總酚和維生素C略有降低。通過感官分析，紅樹莓山楂復合發(fā)酵飲料感官評分為86分，乳酸菌發(fā)酵能提升原果汁的風味，保護色澤，使得發(fā)酵后的果汁果香味濃郁，口感微酸爽口，較原果汁更容易被人所接受，是一款營養(yǎng)、健康的乳酸發(fā)酵飲料。本研究結(jié)果為純果汁乳酸發(fā)酵飲料的開發(fā)提供一定理論依據(jù)和技術(shù)支持，同時也可為紅樹莓和山楂的加工利用、系列產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。