生物合成α-半乳糖苷酶的研究進展

陳 可，劉 星，張景韻，蔡志強

（常州大學 藥學院，江蘇 常州 213164）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase，EC.3.2.1.22）屬于外切糖苷酶類，具有較強的水解能力，可以催化水解糖蛋白、糖脂、半乳甘露聚糖和半乳糖脂的末端α-半乳糖基[1]，也可以切割棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖等棉子糖家族寡糖（raffinose family oligosaccharides，RFOs）在半乳糖和葡萄糖之間的α-1,6糖苷鍵。此外α-半乳糖苷酶廣泛存在于自然界中，其作為生物催化工具[2]，在食品、飼料、益生元、生物煉制、紙漿加工、制糖工業(yè)以及生物醫(yī)藥學等不同行業(yè)中都能發(fā)揮作用。該酶的水解特性可以降解豆類植物中的α-低聚半乳糖（α-galactooligosaccharides，GOS），消除飼料中的抗營養(yǎng)因子（α-半乳糖苷類物質(zhì)），避免人或動物在攝食后胃腸脹氣的發(fā)生[3]；也可以作為外源酶添加到飼料中，消除棉子糖家族寡糖，提高飼料的利用率[4]；此外該酶在治療法布里病時也起著重要作用[5-6]，使用酶替代療法（enzyme replacement therapy，ERT）彌補患者本身缺乏的溶酶體α-半乳糖苷酶，現(xiàn)已研究出一款治療法布里病的藥物Fabrazymeagalsidase-β，并于2003年上市，該藥也是美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準的唯一一種治療法布里病的藥物。

目前微生物源的α-半乳糖苷酶因其在生產(chǎn)過程中較好的耐受能力和在廉價底物上能快速生長使其在經(jīng)濟上更適合于工業(yè)開發(fā)[7]，但由于天然的α-半乳糖苷酶經(jīng)發(fā)酵后活性依舊較低，需要依靠某些誘變等方法來提高酶活活性，這不僅增加了該酶的生產(chǎn)成本且使對α-半乳糖苷酶的研究局限于實驗室小試。而隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外研究者正著力于探索新的α-半乳糖苷酶基因并克隆和表達到合適的宿主中，以提高酶的催化效率、產(chǎn)量和耐受性，從而達到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)這一終極目標，同時對于該酶的高效分離純化方法也有待進一步的研究。因此，本文綜述了近年來α-半乳糖苷酶的發(fā)酵生產(chǎn)工藝、異源表達和分離純化等研究內(nèi)容，并展望了其今后的發(fā)展，對α-半乳糖苷酶商業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化的研究也具有一定意義。

1 α-半乳糖苷酶催化機制

糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）是由一個能夠催化糖苷鍵分解的大家族酶組成，根據(jù)氨基酸序列相似性，在CAZy數(shù)據(jù)庫中將報道的α-半乳糖苷酶分為糖苷水解酶家族GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57、GH-97和GH-110，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，大部分的α-半乳糖苷酶屬于GH-27和GH-36家族，而在GH-4和GH-36家族中主要由原核起源的酶組成，GH-27家族包含原核和真核起源的酶[8]。若根據(jù)酶活性的最佳pH來說，又有酸性酶、堿性酶之分，大多數(shù)酸性α-半乳糖苷酶屬于糖苷水解酶GH-27家族，而在GH-36家族中既有酸性酶，又有堿性酶和中性酶。

在催化糖苷鍵分解時，根據(jù)糖苷水解酶催化底物分子異頭碳構(gòu)型是否發(fā)生轉(zhuǎn)變，可分為兩種不同的催化水解反應(yīng)機制：保持機制和反轉(zhuǎn)機制。GH-4、GH-27、GH-36和GH-57家族的α-半乳糖苷酶遵循保留機制；GH-110家族的α-半乳糖苷酶遵循反轉(zhuǎn)機制；而GH-97家族的α-半乳糖苷酶是一個值得注意的例外，同時擁有保留和反轉(zhuǎn)機制。這兩種催化機制中，遵循反轉(zhuǎn)機制的水解反應(yīng)通常是由一步法實現(xiàn)，涉及類似碳鎓離子的過渡態(tài)，該催化反應(yīng)由兩個氨基酸側(cè)鏈的廣義酸/堿催化劑協(xié)助發(fā)生，通常是谷氨酸和天冬氨酸，由糖苷鍵上的氧攻擊酸催化劑上的氫；同時在堿催化劑的作用下水分子攻擊底物的異頭碳，使糖基解離出來，這種催化方式使水解產(chǎn)物的構(gòu)型發(fā)生了轉(zhuǎn)變。保留機制的水解反應(yīng)是一個兩步反應(yīng)，其中每步反應(yīng)也都涉及類似碳鎓離子的過渡態(tài)，由兩個氨基酸側(cè)鏈的廣義酸和廣義堿協(xié)助發(fā)生通常是谷氨酸和天冬氨酸，該反應(yīng)采用雙置換機制，經(jīng)過糖基化和去糖基化這兩步使水解產(chǎn)物的構(gòu)型保持不變，即在第一步糖基化反應(yīng)中，一個殘基作為親核試劑，對底物的異頭碳進行親核攻擊，促進糖-酶中間體的合成，與此同時，另一個殘基起酸催化的作用，在糖苷鍵斷裂時使其質(zhì)子化，第二步是去糖基化反應(yīng)，在水分子水解糖-酶中間體時，另一個殘基起堿催化的作用，在水分子攻擊時使其去質(zhì)子。而GH-4家族的α-半乳糖苷酶的水解反應(yīng)在遵循保留機制時，區(qū)別于其他家族的是需依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）輔助因子催化，通過陰離子過渡態(tài)進行消除和氧化還原。保持機制和反轉(zhuǎn)機制見圖1、圖2。

圖1 糖苷水解酶家族反轉(zhuǎn)機制（GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57和GH-97）Fig.1 Inversion mechanism of glycoside hydrolase family (GH-4、GH-27、GH-31、GH-36、GH-57 and GH-97)

圖2 糖苷水解酶家族保持機制（GH-97和GH-110）Fig.2 Retention mechanism of glycoside hydrolase family (GH-97 and GH-110)

2 微生物源的α-半乳糖苷酶

α-半乳糖苷酶廣泛存在于大自然中，早期COURTOIS J E等[9]在咖啡豆中發(fā)現(xiàn)了該酶，之后在多種植物以及哺乳動物中均發(fā)現(xiàn)了該酶，而在微生物中更是表現(xiàn)出了α-半乳糖苷酶的巨大生產(chǎn)潛力，尤其是微生物易于培養(yǎng)，胞外分泌，不僅能在廉價的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物上生長，而且對于不同的溫度和酸堿度范圍內(nèi)有較強的穩(wěn)定性，這些特性使得α-半乳糖苷酶在食品及飼料加工上有顯著作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱微生物是嗜熱和耐熱酶的主要微生物來源，JANG J M等[10]從Irpexlacteus克隆出一種具有高催化效率、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的α-半乳糖苷酶，屬GH-27家族，該酶在70 ℃和pH4.8時活性最大，在pH3～11內(nèi)保持活性穩(wěn)定，且在50 ℃和60 ℃培養(yǎng)10 h后依舊保留了90%以上的活性，表現(xiàn)出獨特的耐熱性和pH穩(wěn)定性，同時也發(fā)現(xiàn)其對RFOs具有非常高的催化效率。XIE J等[11]從總狀橫梗霉（Lichtheimia ramosa）中發(fā)現(xiàn)并成功表達了一個屬GH-36家族的新的α-半乳糖苷酶基因，該重組酶在65 ℃和pH6時活性最大，在pH4.5～6.5內(nèi)仍能保留大部分活性，在60 ℃或更低溫度條件下均能保持穩(wěn)定，該酶與GH-36家族的其他α-半乳糖苷酶不同的是，除了能消除RFOs外還對半乳甘露聚糖有水解作用。這些具有熱穩(wěn)定性質(zhì)的酶將有助于食品和飼料的加工。

目前也有更多不同地方微生物來源的α-半乳糖苷酶被發(fā)現(xiàn)和鑒別出來，據(jù)報道產(chǎn)α-半乳糖苷酶的微生物主要包括細菌、真菌、放線菌等，ZHOU J等[12-13]從云南的磷酸鹽堆放地的礦渣和鹽漬土中發(fā)現(xiàn)了一株新的菌株中生根瘤菌（Mesorhizobiumsp.）JB07，并從中分離出了兩種屬于GH-36的α-半乳糖苷酶AgaAJB07和AgaAHJG4，之后又在該地的鹽礦中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)自菌株海洋桿菌屬（Pontibactersp.）HJ8中一種新型的屬于GH-27家族的α-半乳糖苷酶。此外真菌來源的該酶多被曲霉屬、青霉屬等廣泛研究，WANG H等[14]從來自某錫礦酸性廢水中分離出一種新型的嗜熱真菌費希新薩托菌（Neosartorya fischeri）P1，能分泌出高活性的胞外α-半乳糖苷酶；劉德海等[15]首次從紫花苜蓿草種植土壤中分離出一株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的黑曲霉菌株A1-19。而在益生菌[16]的研究中也能發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶，如雙歧桿菌、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）以及乳酸桿菌，其抗菌活性、在刺激的腸胃環(huán)境中的存活率、儲存期間的存活率較高而言，因此是理想的候選來源。對于從不同環(huán)境中分離鑒別出的α-半乳糖苷酶在經(jīng)研究后發(fā)現(xiàn)了該酶具有更多不同的優(yōu)良特性，這也使得它們在功能上存在差異性，近年來國內(nèi)外關(guān)于微生物源的α-半乳糖苷酶的研究概況見表1。

表1 微生物源的α-半乳糖苷酶的研究概況Table 1 Overview of α-galactosidase from microorganisms

3 產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株的發(fā)酵工藝研究

3.1 固態(tài)發(fā)酵

固態(tài)發(fā)酵（solid state fermentation，SSF）可以定義為在沒有或幾乎不存在游離液體的情況下，微生物在潮濕、水不溶性的固體基質(zhì)上生長的技術(shù)[24]。固體基質(zhì)是一種復雜的大分子混合物，通常是在農(nóng)業(yè)和工業(yè)活動時產(chǎn)生的殘留物，視為農(nóng)工副產(chǎn)品[7]，如麥麩、米糠、甘蔗渣、水果和蔬菜加工廢料等。因此有必要找到并采用一種適當?shù)臒o害環(huán)境、低成本和經(jīng)濟上可行的方法來處理這些農(nóng)工副產(chǎn)品，所以利用農(nóng)工業(yè)殘留物作為生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的固體基質(zhì)不僅增加了它們自身的價值，而且為處理日益構(gòu)成威脅的農(nóng)工廢物提供了一種獨特的解決辦法。

KOTWAL S M等[25]研究發(fā)現(xiàn)了一種嗜熱真菌腐質(zhì)霉，能在固態(tài)發(fā)酵中利用各種農(nóng)業(yè)殘留物生產(chǎn)胞外α-半乳糖苷酶，當用大豆粉作為碳源時，其酶活性最大。此外通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）研究發(fā)現(xiàn)，該真菌菌絲體纏繞在固體基質(zhì)上，具有很高的生長密度，致使真菌分泌出大量的α-半乳糖苷酶。SAAD R R等[26]研究發(fā)現(xiàn)了一株耐高溫真菌能利用不同豆科植物的種子和外殼作為固體基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酶，研究表明，鷹嘴豆種子是該酶最佳的固體發(fā)酵基質(zhì)。SHANKAR S K等[27]利用紅豆植物廢料和麥麩為復合固體基質(zhì)對真菌米曲霉進行固態(tài)發(fā)酵，將麥麩與紅豆植物廢料以1∶2（g∶mL）混合，在最適條件下發(fā)酵所產(chǎn)α-半乳糖苷酶的酶活性最高。綜上，可以利用農(nóng)副產(chǎn)品作為固體基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵，且在發(fā)酵時呈現(xiàn)的蓬松狀態(tài)有利于真菌菌絲附著在其表面生長從而更便于產(chǎn)生大量的酶。

此外，由于農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物容易獲得且價格低廉，在大規(guī)模產(chǎn)酶時發(fā)揮了極大的成本優(yōu)勢。如ANISHA G S等[28]利用大豆粉為固體基質(zhì)對灰鏈霉菌產(chǎn)胞外α-半乳糖苷酶的研究，使用填充床生物反應(yīng)器在SSF中生產(chǎn)絲狀菌的α-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)此時該酶的產(chǎn)量比在錐形瓶中發(fā)酵提高了約100%。而VIDAY C H等[29]首先篩選出了15株真菌，檢測發(fā)現(xiàn)泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548中的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的活性最高，之后在該菌株發(fā)酵時用脫脂大豆粉代替了麥麩，并將小試工藝放大，在不銹鋼托盤對該產(chǎn)酶菌株進行大規(guī)模的固態(tài)發(fā)酵。由此可見，在固態(tài)發(fā)酵時可利用農(nóng)工副產(chǎn)品作固體基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶，不僅具有成本效益，也為指導α-半乳糖苷酶的大規(guī)模生產(chǎn)展示了巨大潛力。

3.2 液態(tài)發(fā)酵

液態(tài)發(fā)酵（submerged fermentation，SMF）是一種將微生物作為懸浮培養(yǎng)物進行培養(yǎng)，并將其產(chǎn)物釋放到發(fā)酵液中的發(fā)酵生產(chǎn)方式。SANADA C T N等[30]利用大豆蜜糖酒精發(fā)酵的殘渣大豆酒槽為底物進行液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶，通過篩選發(fā)現(xiàn)敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilis）LPB 56的酶活性較高，該菌株在發(fā)酵144 h后，酶活性達到最高，為11.07 U/mL。ALVAREZ-CAO M E等[31]利用廉價的農(nóng)副產(chǎn)品蜜糖作為生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的底物，降低了酶的生產(chǎn)成本有助于循環(huán)經(jīng)濟。與固態(tài)發(fā)酵相類似，液態(tài)發(fā)酵也能以廉價的農(nóng)作物為底物，且獲得的發(fā)酵液能直接作為酶混合物應(yīng)用到某些工業(yè)中去，這些都為利用農(nóng)業(yè)殘渣創(chuàng)造更高價值的工業(yè)發(fā)展顯示了廣闊前景。此外，在發(fā)酵工藝中不同固體基質(zhì)對α-半乳糖苷酶的活性也有不同的影響，對近年來微生物發(fā)酵所產(chǎn)α-半乳糖苷酶活性的研究概況見表2。

表2 α-半乳糖苷酶的發(fā)酵工藝Table 2 Fermentation technology of α-galactosidase

3.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

在固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶時，篩選合適的固體基質(zhì)、碳源、氮源等因素，以及確定合適的發(fā)酵條件都對酶的活性和產(chǎn)量有一定的影響，因此需要采用單因素、正交試驗以及響應(yīng)面法等方法進行工藝優(yōu)化，以發(fā)掘產(chǎn)α-半乳糖苷酶菌株的最大潛力。

在微生物發(fā)酵時，碳源和氮源是為生物合成、產(chǎn)物形成和代謝提供能量的基本營養(yǎng)物質(zhì)。GURKOK S等[39]通過響應(yīng)面優(yōu)化法研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉發(fā)酵時，采用甘蔗糖蜜和NH4NO3分別為碳源、氮源，使α-半乳糖苷酶的產(chǎn)量增加了4倍。GAJDHANE S B等[34]通過Plackett Burman試驗設(shè)計關(guān)鍵的培養(yǎng)基成分，在以麩皮為底物的前提下，確定了補充碳源和氮源分別為甘蔗糖蜜和豆粕，然后采用響應(yīng)面優(yōu)化法確定其最佳濃度，使α-半乳糖苷酶的活性提高至218.54 U/g。DONG M等[40]在研究α-半乳糖苷酶的最適條件時，發(fā)現(xiàn)當以蔗糖為碳源，（NH4）2SO4/尿素按2∶1比例為復合氮源時，可以提高酶的活性，通過對發(fā)酵罐繼續(xù)補料研究對其活性影響時發(fā)現(xiàn)，在不斷添加半乳糖時，其既能作為誘導物也能作為底物補充損失掉的營養(yǎng)，從而可以使α-半乳糖苷酶的活性達到最高。

此外，除基本的碳源氮源等營養(yǎng)因素，某些金屬離子如Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+等也是微生物在發(fā)酵過程中不可或缺的微量元素，其中部分金屬離子對酶的活性起促進作用，相反也會抑制酶的活性。DELGADO-FERNANDEZ P等[16]在研究金屬離子對植物乳桿菌產(chǎn)α-半乳糖苷酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加Mn2+和Fe2+時能使α-半乳糖苷酶的活性提高145%和139%，相比之下添加Hg2+和Cu2+時都分別抑制了α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。YE F等[41]研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子濃度的不同對α-半乳糖苷酶的活性也有不同的影響，在濃度相同的情況下，K+、Ba2+、Pb2+、Hg+、Al3+和Cr3+相比于Ca2+、Mg2+、Cd2+對α-半乳糖苷酶有明顯的抑制作用，而當這些金屬離子的濃度降低時，Ba2+、Pb2+、Al3+和Cr3+又能使α-半乳糖苷酶的活性增加，此外Cu2+和Fe2+對該酶活性具有雙向的影響，當這兩種金屬離子的濃度增加時，其對α-半乳糖苷酶的活性也增加，反之則會抑制其活性的增加。研究表明，金屬離子可以通過影響酶的結(jié)構(gòu)從而改變對酶活性的影響，不同的金屬離子對酶活性的影響也不同。

當微生物進行發(fā)酵時，控制微生物的發(fā)酵條件（尤其是溫度和pH）也對α-半乳糖苷酶的活性有著至關(guān)重要的影響，其活性將在最適的生長環(huán)境下達到最大，而稍微偏離最佳條件便會改變微生物的生長和酶的產(chǎn)生。LI Q等[42]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉生產(chǎn)α-半乳糖苷酶會受pH和溫度的影響，當溫度為25 ℃，pH6～7時酶產(chǎn)量較高，是原始的2.2～2.3倍。VIDAY C H等[29]研究了高產(chǎn)α-半乳糖苷酶的曲霉泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548的小試工藝試驗，并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件為溫度28 ℃，pH5.0和發(fā)酵120 h，之后將其擴大到容量約3 kg的不銹鋼托盤中進行大規(guī)模發(fā)酵，最終檢測發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶活性可達109.27 U/g，這為工業(yè)生產(chǎn)α-半乳糖苷酶提供了方向。

4 α-半乳糖苷酶的異源表達

目前，從自然界中篩選得到產(chǎn)α-半乳糖苷酶的菌株很多，但原始菌株在發(fā)酵后的酶產(chǎn)量相對較低，有的需要依靠物理或化學誘變等方法來提高酶產(chǎn)量，這也會使大規(guī)模生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的成本增高，所以獲得高表達、活性高的α-半乳糖苷酶基因并成功表達的方法受到了研究者們的青睞。國內(nèi)外研究者對分泌表達α-半乳糖苷酶的工程微生物菌株作了一定的研究，從而提高酶的產(chǎn)量，以期望滿足α-半乳糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)。對于不同來源的α-半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)也具有不同的酶學性質(zhì)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有數(shù)個α-半乳糖苷酶基因被克隆并在不同的表達系統(tǒng)中成功表達?；蚬こ瘫磉_系統(tǒng)主要有大腸桿菌，酵母，枯草芽孢桿菌和昆蟲等，其中α-半乳糖苷酶基因主要的表達系統(tǒng)是大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)。

4.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是大腸桿菌表達系統(tǒng)，是原核蛋白表達系統(tǒng)的最佳代表。HUANG Y等[43]從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）中克隆了α-半乳糖苷酶基因（AgaB），并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中成功表達，該重組酶在最適條件下比活性高達362.6 U/mg。其天然結(jié)構(gòu)被研究確定為一種同源三聚體，同時它也被發(fā)現(xiàn)具有良好的蛋白酶抗性和半乳糖耐受性，且對棉子糖和水蘇糖具有良好的降解活性，利用這些優(yōu)良性質(zhì)該重組酶將在食品和飼料行業(yè)中去除棉子糖家族寡糖（RFOs）的方面上發(fā)揮很大的潛力。FEI Y等[18]在解淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylolyticus）L6基因組中發(fā)現(xiàn)了α-半乳糖苷酶的編碼基因（AglB），對其與乳酸桿菌的其他α-半乳糖苷酶進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)其屬于GH36家族，具有保留水解機制。根據(jù)L6的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列設(shè)計引物，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增得到AglB基因，在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達并探究了AglB的最適反應(yīng)條件。經(jīng)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該重組酶具有轉(zhuǎn)糖基化活性可用于低聚半乳糖（GOS）的生產(chǎn)，在最佳反應(yīng)條件下，以300 mmol/L的蜜二糖為底物可使GOS的最大產(chǎn)量達31.56%。LEE C M等[44]通過構(gòu)建宏基因組fosmid文庫，在羧甲基纖維素板上對文庫進行功能性篩選，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)了一個新的α-半乳糖苷酶基因（Agas2），并在大腸桿菌中成功表達。該重組酶具有良好的pH穩(wěn)定性，在40 ℃和pH 7.0時表現(xiàn)出最大酶活性高達128.37U/mg。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在真核生物中克隆出編碼基因表達到大腸桿菌中后，對重組酶菌株進行發(fā)酵后所制備得到的粗酶液的活性和比活性都相對較低，如CAO Y等[45]從赤霉素（Gibberellasp.）F75中克隆了α-半乳糖苷酶的基因（aga-F75）并在大腸桿菌中成功表達，研究發(fā)現(xiàn)其屬于GH36家族，具有良好的水解能力和熱穩(wěn)定性，但該酶的活性相對較低，粗酶活性僅為1.42 U/mL。這是由于大腸桿菌缺乏對真核蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)，細胞周質(zhì)含有多種內(nèi)毒素等缺點不利于進行真核生物源蛋白的表達。

4.2 酵母表達系統(tǒng)

酵母表達系統(tǒng)作為一種后起的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于兼具原核以及真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，其生產(chǎn)的酶活性、產(chǎn)量均比較高以及易誘導使其在基因工程領(lǐng)域中倍受青睞。真菌來源的α-半乳糖苷酶具有良好的穩(wěn)定性且含有信號肽能進行胞外分泌，使酵母表達系統(tǒng)成為該酶研究的熱點，因此產(chǎn)生α-半乳糖苷酶的真菌也受到越來越廣泛的關(guān)注，目前利用畢赤酵母來生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的研究較多。MI S等[46]在青霉菌（Penicilliumsp.）F63 CGMCC 1669中發(fā)現(xiàn)了一種胞外α-半乳糖苷酶，命名為Agl1，根據(jù)純化蛋白的部分氨基酸序列，克隆并測序了編碼α-半乳糖苷酶Agl1的基因，成功在畢赤酵母（Pichia pastoris）細胞外表達，并在發(fā)酵罐中達到111 U/mL的高產(chǎn)量。該重組的α-半乳糖苷酶的最適pH和溫度分別為5.0和40 ℃，這與單胃動物腸道的物理化學條件基本一致，從飼料添加劑的實際應(yīng)用來看，該重組α-半乳糖苷酶在飼料中的應(yīng)用是非常有利的。CHEN Z等[47]克隆了來自太瑞斯梭孢殼霉（Thielavia terrestris）中一種新的α-半乳糖苷酶基因（TtGal27A）并在畢赤酵母中成功表達，研究發(fā)現(xiàn)TtGal27A屬于GH27家族，在5 L發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵后其酶活性高達4 402 U/mL。此外該酶可以水解棉子糖家族寡糖以及不同的半乳甘露聚糖且表現(xiàn)出良好的蛋白酶抗性，這使得它有潛力應(yīng)用到食品和飼料工業(yè)中去。WANG C等[21]從萊色籃狀菌（Talaromyces leycettanus）JCM12802中發(fā)現(xiàn)了一種新型的α-半乳糖苷酶基因，屬于GH27家族，并成功在畢赤酵母GS115中表達。研究發(fā)現(xiàn)該重組酶具有良好的嗜熱性，能在70 ℃時表現(xiàn)出最大活性，具有穩(wěn)定的水解能力以及對半乳糖有良好的耐受性。

類似地，除大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng)以外，也能在其他生物源系統(tǒng)中表達。GüRK?K S等[48]編碼煙曲霉IMI 385708中的α-半乳糖苷酶基因（AglB），克隆到pAN52-4真菌表達載體上，并在3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的控制下在大豆曲霉ATCC11906中成功表達，且不需要添加誘導物，可在重組大豆曲霉菌株中得到2.45U/mL的α-半乳糖苷酶產(chǎn)量，約為初始煙曲霉（0.85 U/mL）的3倍。近年來，研究發(fā)現(xiàn)利用基因工程技術(shù)可提高α-半乳糖苷酶的水解能力、耐受性和產(chǎn)量，該方法已經(jīng)成為設(shè)計全新分子或修飾天然分子的重要工具，許多α-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株已經(jīng)成功地通過修飾其氨基酸序列而被改造以增強表達和水解功能，以期望能在工業(yè)中發(fā)揮它們的最大潛力。

5 α-半乳糖苷酶的分離純化

酶的分離純化是指以熟練、經(jīng)濟的方式獲得一定純度的酶。胞內(nèi)酶可通過細胞破碎方法得到粗酶液，胞外酶可經(jīng)過發(fā)酵，通過離心或浸提等方法獲得。在微生物發(fā)酵后尤其是固態(tài)發(fā)酵后粗酶液中的成分復雜，摻雜著其他代謝物或酶類，對此需采取高效的分離純化方法以得到高純度的α-半乳糖苷酶。一般可采用硫酸銨分級沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜等不同層析技術(shù)對該酶進行分離純化，而聚丙烯酰胺凝膠電泳法可用于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定和純度水平的估量。目前α-半乳糖苷酶已從許多來源進行分離純化。MUTRA R等[49]從發(fā)芽的綠豆種子中發(fā)現(xiàn)了α-半乳糖苷酶，并通過離子交換、凝膠過濾和親和層析柱純化出了低分子量的α-半乳糖苷酶，該酶的純化倍數(shù)達522倍，其比活性為146.3 U/mg。SAKHARAYAPATNA RANGANATHA K等[50]從番荔枝種子中發(fā)現(xiàn)了一種低分子質(zhì)量的酸性α-半乳糖苷酶，通過硫酸銨分級沉淀，收集活性高（20%～40%和40%～60%）的部分再采用疏水層析和凝膠過濾層析從種子粗提物中純化α-半乳糖苷酶。純化后的α-半乳糖苷酶在非變性聚丙烯凝膠電泳中顯示分子質(zhì)量約67 kDa的單一條帶。YE F等[41]在食用菌猴頭菇中發(fā)現(xiàn)了一種分子質(zhì)量為57 kDa的α-半乳糖苷酶，命名為HEG，該酶屬于GH27家族。研究人員分別使用三種離子交換色譜弱陰離子交換層析（DEAE-Sepharose）、弱陽離子交換層析（CM-Sepharose）、強陰離子交換層析（Q-Sepharose）和凝膠過濾層析對猴頭菇粗酶液進行純化直至均一，純化倍數(shù)高于大多數(shù)α-半乳糖苷酶，高達1 251.64倍，純化后的HEG比活性為46.74 U/mg。VIDYA C H等[29]在泡盛曲霉（Aspergillus awamori）MTCC 548中發(fā)現(xiàn)了α-半乳糖苷酶，通過硫酸銨（飽和度50%～80%）沉淀、離子交換和疏水層析使粗提取物中的酶純化至均一，并在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）中觀察到一條單一條帶，該純酶的表觀分子質(zhì)量約為（118±2）kDa。WANG J等[51]對從米曲霉中克隆的α-半乳糖苷酶（galC）純化，采用鎳離子金屬鰲合親和層析，用咪唑緩沖液洗脫目標蛋白，收集活性高的洗脫液，在SDS-PAGE中觀察到單一條帶分子質(zhì)量為100 kDa，該重組酶的純化倍數(shù)為1.96，比活性為150.9 U/mg，其活性高于一般α-半乳糖苷酶，具有良好的大規(guī)模純化潛力。目前已有研究者們發(fā)現(xiàn)了更多不同來源的α-半乳糖苷酶，并通過各種層析柱分離純化出來，現(xiàn)對近年來研究的α-半乳糖苷酶的分離純化進行了總結(jié)概括見表3。

表3 α-半乳糖苷酶的分離純化Table 3 Isolation and purification of α-galactosidase

6 展望

α-半乳糖苷酶在大自然中無處不在，它的一些優(yōu)良特性如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、對蛋白酶的抗性等也被研究出來并在各個領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，因此它的市場需求也在不斷的增長，在目前的研究中發(fā)現(xiàn)該酶的活性和產(chǎn)量較低不能滿足工業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用，因此獲得高活性、高產(chǎn)量、低成本的α-半乳糖苷酶是目前研究亟待解決的問題。為了經(jīng)濟高效地生產(chǎn)α-半乳糖苷酶，可以從以下幾個方面考慮。

①目前對各個家族成員的研究仍有未知存在，對這些酶的催化機制和底物特異性的全面研究將為進一步促進工業(yè)應(yīng)用的研究提供理論基礎(chǔ)。

②雖然生產(chǎn)的成本問題可以通過利用廉價的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物來降低，但對使用固態(tài)發(fā)酵以提高其產(chǎn)量仍需進一步研究，可以通過對固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)的產(chǎn)α-半乳糖苷酶微生物的代謝差異進行研究，以指導該酶的大規(guī)模生產(chǎn)。

③隨著基因組測序和宏基因組學的出現(xiàn)，有可能在不局限于可培養(yǎng)物種的情況下探索出不同環(huán)境中潛在微生物的基因組庫，以開發(fā)更多有特異性的新型工程菌，從而將該酶的某些優(yōu)良性能應(yīng)用到各個領(lǐng)域。

④深入研究α-半乳糖苷酶的分離純化工藝，以提高該酶的純度和產(chǎn)量，促進其工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用。