基于PATRIC公共數據庫不同標本來源的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌基因組特征比較

張 娜，孟 標，金美玲，陳佳麗，楊曉靜，劉芳妮，秦世宇，劉 雄，王長軍，陳 勇

(1. 中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室, 遼寧 沈陽 110122； 2. 中國人民解放軍疾病預防控制中心應急處置大隊，北京 100071； 3. 安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與統(tǒng)計學系，安徽 合肥 230032； 4. 中國人民解放軍疾病預防控制中心有害生物防制科，北京 100071； 5. 鄭州大學公共衛(wèi)生學院，河南 鄭州 450001； 6. 中國人民解放軍疾病預防控制中心信息科，北京 100071； 7. 中國人民解放軍疾病預防控制中心衛(wèi)勤部，北京 100071)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬于條件致病菌，是常見的臨床患者感染的致病菌之一?？咕幬镌谂R床中廣泛使用，導致產生耐藥的KP數量越來越多。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)是臨床常見耐藥菌，其檢出率呈不斷升高趨勢[1-3]。臨床CRKP常見標本來源包括尿、血、呼吸道分泌物和無菌體液等[2]。年老體弱、侵襲性操作[4]和基礎疾病[5]是臨床患者感染CRKP的主要因素。近年來，CRKP所致血流感染的病例越來越多[6]，該類患者病情兇險、預后差，部分文獻報道CRKP血流感染患者病死率高達71.9%，遠高于其他部位感染的病死率(21.9%)[7]，CRKP已成為全球范圍內患者正在面臨的嚴重安全威脅。為研究不同標本來源CRKP在攜帶耐藥基因、毒力基因和質粒數量等方面有無差異，筆者對公共數據庫2011—2020年的CRKP基因組測序數據進行篩選分析，為深入了解不同標本類型CRKP感染的臨床特點和感染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數據來源和篩選標準 本研究從Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC)[8]數據庫(PATRIC數據庫提供全面的細菌基因組學數據和與基因組分析相關的大量數據，相比于NCBI數據庫，標本來源、分離國家、耐藥情況等基礎信息更完善，更便于進行比較分析)下載2011—2020年間所有的KP基因組測序數據，根據宿主、標本來源、對碳青霉烯類抗生素耐藥等信息進行篩選，納入標準包括：(1)人類宿主；(2)按照2020年中國細菌耐藥檢測結果的分類情況[2]并結合收集到的標本類型，確定標本來源為血、尿、肺泡灌洗液、無菌體液、傷口膿液、糞便、呼吸道標本和導管標本共8個類型；(3)菌株攜帶碳青霉烯酶基因；(4)分離國家等基礎信息完整。排除標準：(1)分離自人類以外的宿主；(2)除血、尿、肺泡灌洗液、無菌體液、傷口膿液、糞便、呼吸道標本和導管標本以外的標本來源；(3)不攜帶碳青霉烯酶基因；(4)分離時間、分離地區(qū)、標本來源、基因組數據等信息不完整。

1.2 毒力基因、耐藥基因、質粒和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析 應用kleborate[9]軟件對菌株進行物種鑒定，并篩選其是否攜帶CARD[10]數據庫中存在的碳青霉烯酶基因。應用abricate軟件，將基因組序列與CARD、VFDB[11]和PlasmidFinder[12]數據庫進行比對，獲得每個菌株攜帶毒力基因、耐藥基因和質粒的情況。選擇肺炎克雷伯菌HS11286 (GenBank assembly accession: GCA_000240185.2)作為參考基因組。應用snippy軟件，將各菌株基因組與參考基因組進行對比分析，獲得各菌株SNPs數量。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用IBM SPSS 23.0和R v4.2.0軟件進行統(tǒng)計學分析。毒力基因、耐藥基因和質粒等計數資料采用中位數[M(P25，P75)]進行統(tǒng)計描述，采用非參數檢驗(Kruskal-WallisH秩和檢驗)比較多個組間總體差異，曼-惠特尼U檢驗比較兩組間差異。采用卡方檢驗對不同率或百分比之間的差異進行統(tǒng)計學比較，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CRKP基因組序列的篩選和標本分布 對2011—2020年10年間PATRIC公共數據庫中12 774株KP進行篩選后納入2 356個符合篩選條件的CRKP基因組序列進行分析，其中2011—2015年1 621株(20.92%，共計7 749株)，2016—2020年735株(14.63%，共計5 025株)。尿(797株，33.83%)、血(706株，29.97%)、呼吸道(366株，15.53%)和糞便(231株，9.80%)為主要標本來源。血標本CRKP的數量每年均位居前3位，提示血是CRKP最常見標本來源之一。見圖1。

圖1 2011—2020年不同標本來源CRKP的數量分布

2.2 提交CRKP基因組序列的國家/地區(qū)分布 美國在2013—2014年提交至數據庫的KP感染基因組數據較多，使這兩年納入分析的CRKP基因組樣本明顯增多，2013年397株，2014年296株。2011—2015年美國提交CRKP基因組序列數量最多(n=1 001)，占該5年所有CRKP序列數量的61.75%。2016—2020年提交CRKP基因組序列數量最多的國家分別是泰國(n=188)、中國(n=187)、巴西(n=93)和印度(n=69)，占這5年所有CRKP序列數量的73.06%，其他國家/地區(qū)提交CRKP基因組序列總體較少。見表1。

表1 2011—2020年不同國家/地區(qū)提交CRKP基因組序列數量(株)

續(xù)表1 (Table 1， Continued)

2.3 碳青霉烯酶基因分布情況 2 356株CRKP菌株中最常見的5種碳青霉烯酶基因為：blaKPC-2(50.51%)、blaKPC-3(21.39%)、blaNDM-1(11.50%)、blaOXA-232(10.48%)和blaOXA-48(7.39%)。7.05%的CRKP菌株攜帶多個碳青霉烯酶基因。美國來源的CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶以blaKPC-2和blaKPC-3為主，巴西和中國以攜帶blaKPC-2為主，泰國主要攜帶blaOXA-232和blaNDM-1，意大利和葡萄牙以blaKPC-3為主，俄國、西班牙主要攜帶blaOXA-48。產KPC-2(50.51%)是CRKP對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制，但不同碳青霉烯酶基因在標本整體和不同標本類型中占比不同。blaKPC-2整體占比由2011—2015的54.8%降至2016—2020的41.1%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，除blaKPC-2外的其他碳青霉烯酶基因占比在2016—2020年里均明顯增加。尿中以blaKPC-2(46.05%)、blaKPC-3(31.62%)、blaNDM-1(9.91%)和blaOXA-48(7.78%)為主；血中以blaKPC-2(51.98%)、blaKPC-3(22.10%)、blaOXA-232(8.22%)和blaOXA-48(6.94%)為主；呼吸道標本以blaKPC-2(59.56%)、blaOXA-232(20.22%)和blaNDM-1(14.21%)為主；糞便以blaKPC-2(50.22%)、blaOXA-232(36.36%)和blaNDM-1(31.17%)為主；傷口膿液中以blaKPC-2(48.89%)、blaOXA-48(20.74%)和blaKPC-3(18.52%)為主；無菌體液以blaKPC-2(48.39%)、blaKPC-3(27.42%)和blaOXA-48(9.68%)為主；肺泡灌洗液以blaKPC-2(47.37%)、blaKPC-3(26.32%)和blaNDM-1(10.53%)為主；導管標本以blaKPC-2(38.10%)、blaNDM-1和blaOXA-48(均19.05%)為主。見表2。

表2 2011—2020年不同碳青霉烯酶基因在8種類型標本中的分布情況[株(%)]

2.4 分子分型特征 2 356株CRKP可劃分為133個多位點序列型別(ST型)，其中，2011—2015年有101個ST型，2016—2020年有65個ST型。常見的型別包括ST258(33.19%, 782株)、ST11(16.00%, 377株)、ST307(8.91%, 210株)、ST16(7.77%, 183株)、ST512(5.01%, 118株)、ST15(3.82%, 90株)和ST147(3.18%, 75株)。ST258型主要集中在2012—2015年(90.15%，705/782)；ST11型2015、2016和2018年最多，占所有ST11型的62.60%(236/377)；ST307型2012—2015年出現(xiàn)較多(89.05%，187/210)；ST16型CRKP主要出現(xiàn)在2016—2019年(89.07%，163/183)。

2.5 不同標本類型CRKP耐藥、質粒和毒力基因攜帶數量比較 CRKP菌株攜帶耐藥基因、質粒和毒力基因數量的M(P25，P75)分別為18(16，20)、4(3，5)和60(57，68)。不同標本來源的CRKP攜帶耐藥基因數量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.055)，攜帶毒力基因和質粒數量之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。糞便來源的CRKP菌株攜帶耐藥基因、質粒和毒力基因的數量較多，其M(P25,P75)分別為19(16，21)、5(3，6)、63(61，69)；導管來源CRKP主要攜帶iutA、iucA、iucB、iucC、iucD(均為19.0%，4/21)；rmpA和rmpA2在肺泡灌洗液來源CRKP中數量最多，分別占比7.9%(3/38)和15.8%(6/38)；無菌體液中CRKP攜帶iro(iroB、iroC、iroD、iroN)基因比率高于其他標本類型CRKP(6.5%，4/62)，不同標本類型的CRKP攜帶關鍵毒力基因(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD、rmpA、rmpA2、iroB、iroC、iroD、iroN)數量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

不同標本來源的CRKP菌株SNPs數量為2 924～41 470(P=0.414)，其中呼吸道分泌物CRKP菌株SNP變異位點數量最少[7 419(7 017, 24 156)]，糞便標本CRKP含有SNPs變異位點數量最多[20 148(3 528, 24 233)]，不同樣本類型CRKP攜帶SNPs的數量見圖2。

圖2 不同標本類型CRKP的SNPs數量比較

對706份血標本與1 650份非血標本來源的CRKP耐藥基因、毒力基因和質粒攜帶數量進行比較，發(fā)現(xiàn)血標本來源CRKP[60(58, 69)]比其他標本類型CRKP[60(56, 67)]攜帶更多毒力基因，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。見表4。

表4 血標本與其他標本來源的CRKP耐藥基因、質粒、毒力基因和SNPs攜帶情況

3 討論

國內外CRKP的感染情況日益嚴重，對患者入院治療和預后影響巨大。以往關于CRKP的研究主要為基于局部地區(qū)所有標本類型的研究或單一標本來源的研究，如某醫(yī)院、某區(qū)域所有CRKP菌株的流行病學特征和基因組研究，以探究其流行、傳播和進化機制，但比較不同標本類型CRKP差異的相關研究還不充分。

本研究對2011—2020年PATRIC數據庫中所有符合篩選標準的CRKP進行分析，發(fā)現(xiàn)尿、血和呼吸道標本是臨床CRKP感染的主要標本類型。與以往研究[13]相比，血標本CRKP在所有CRKP中的占比有所提升。美國在2013—2014年提交CRKP的數量較多，可能與該時間段美國對KP的關注突然增加有關。美國和中國分別以ST258型(63.66%)和ST11型(79.22%)為主要序列類型，與以往研究[14-15]相同。10年間，不同碳青霉烯酶類型在各標本來源CRKP中的比例發(fā)生改變，雖仍以KPC-2為主，但其他類型碳青霉烯酶占比增加，提示CRKP菌株的耐藥基因型向復雜多樣化進化。

CRKP往往攜帶多種碳青霉烯酶耐藥基因，常見blaKPC-2和blaNDM-1，主要流行于ST11型CRKP菌株；blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-232主要流行于ST23型CRKP菌株[16]。血標本來源CRKP以產碳青霉烯酶為最常見的耐藥機制，編碼該酶的基因位于細菌質?；蛉旧w上，通過轉座子或結合性質粒等移動元件在菌株與人群之間廣泛傳播。各個國家分離的菌株產碳青霉烯酶類型各不相同，與既往研究[17]一致，在美國，產KPC酶為CRKP最常見耐藥機制；OXA-48和NDM-1是埃及癌癥患者感染的CRKP中最常見的類型[18]。本組研究顯示，分離自泰國的CRKP菌株主要攜帶NDM-1，質粒介導的KPC-2的水平傳播是我國臨床CRKP的主要耐藥機制，俄國、西班牙和葡萄牙等歐洲國家的CRKP菌株主要攜帶OXA-48。許多地區(qū)都存在主要流行的碳青霉烯酶類型，提示地理位置和區(qū)域管轄對CRKP的傳播進化影響密切。

血標本來源的CRKP在攜帶質粒和毒力基因(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD、rmpA、rmpA2、iroB、iroC、iroD、iroN等)方面與其他7個標本類型存在差異，血標本中分離的CRKP攜帶更多數量的毒力基因，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，提示血標本來源CRKP感染者的高病死率可能與菌株攜帶更多毒力基因有關。既往研究也在所有血標本肺炎克雷伯菌中檢測到毒力基因，其中84.13%的菌株攜帶高毒力基因[19]，攜帶iutA等高毒力基因是血流感染CRKP患者死亡的獨立危險因素[20]，證實CRKP菌株攜帶毒力基因與患者感染后高病死率有直接關聯(lián)。

本研究存在一定局限性，首先，由于PATRIC公共數據庫菌株信息受全球地區(qū)不同經濟狀況及提交數據課題組研究方向偏好等因素影響，菌株基因組信息代表性可能不夠強，但該數據庫提供了較完善的菌株背景信息，為研究肺炎克雷伯菌的基因組特征提供了較好的資源。其次，現(xiàn)有研究顯示菌株基因型和表型之間還存在差異，但由于本研究對象均為PATRIC公共數據庫的基因組信息，缺乏相關實驗研究證實。

本研究通過分析從PATRIC公共數據庫中收集的不同標本類型的CRKP攜帶毒力基因、耐藥基因和質粒數量情況，發(fā)現(xiàn)不同標本類型的CRKP攜帶毒力基因和質粒數量差異有統(tǒng)計學意義，血標本CRKP相比其他標本來源的CRKP攜帶更多的毒力基因，在一定程度上反映了公共數據庫中不同標本來源CRKP的分布特征，以及耐藥基因、質粒和毒力基因的攜帶水平，為后續(xù)CRKP的耐藥和毒力相關研究提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。