結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中宿主抗菌肽LL-37免疫調(diào)控功能的研究進(jìn)展

張志芳，徐詠梅，萬(wàn)珈旭，高 妍，陳 祥,，徐正中,，焦新安,

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的結(jié)核病是一種重要的人獸共患病，世界衛(wèi)生組織在其發(fā)布的《2021年全球結(jié)核病報(bào)告》中指出，2020年全球新發(fā)結(jié)核病患者987萬(wàn)，約150萬(wàn)人死于結(jié)核病，結(jié)核病死亡人數(shù)十多年來(lái)首次出現(xiàn)增加[1]，結(jié)核病仍然是一個(gè)威脅全球公共衛(wèi)生的重大問(wèn)題。在過(guò)去的幾十年中，耐多藥(MDR)和廣泛耐藥(XDR)結(jié)核病(TB)的出現(xiàn)使結(jié)核病的防治越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性。

隨著病原體對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生抗藥性，合成和天然來(lái)源的抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)逐漸引起了人們的興趣，這類分子的主要優(yōu)勢(shì)之一是它們能夠殺死耐多藥細(xì)菌。AMPs是一種具有天然免疫活性的小蛋白，是人體抵御病原體的第一道防線的組成部分，在機(jī)體中廣泛存在，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。AMPs作為先天免疫效應(yīng)分子的作用正在從單純的內(nèi)源性抗生素發(fā)展到參與宿主防御的第一道防線、調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)和激活適應(yīng)性免疫的多功能介質(zhì)[2]。LL-37是目前已知的唯一在人類中表達(dá)的抗菌肽，具有免疫調(diào)節(jié)作用，既有促炎功能又有抑炎功能[3]。LL-37也參與宿主對(duì)分枝桿菌感染的防御和先天免疫反應(yīng)，結(jié)核感染期間血清中LL-37水平顯著升高[4]。另有報(bào)道顯示嚴(yán)重的結(jié)核病患者的M.tb感染部位出現(xiàn)LL-37低表達(dá)[5]，并且已有研究發(fā)現(xiàn)LL-37表達(dá)水平較低的人群對(duì)于結(jié)核病的易感性更高[6]，表明LL-37在機(jī)體針對(duì)M.tb感染的免疫防御中發(fā)揮重要作用。

1 Cathelicidin LL-37的概述

抗菌肽又名宿主防御肽，最早是在1980年由瑞典科學(xué)家 G.Boman在天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)的一類陽(yáng)離子小肽類物質(zhì)[7]。哺乳動(dòng)物存在兩類抗菌肽：防御素家族和Cathelicidin家族[8]。Cathelicidins家族的抗菌肽包含1個(gè)C-端陽(yáng)離子的抗菌結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域只有在整個(gè)肽的N-端“cathelin”部分被釋放后才有活性[9]。雖然在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多Cathelicidin家族成員，但是在人類體內(nèi)僅存在1個(gè)，即cathelieidin LL-37[10]。人cathelieidin LL-37含37個(gè)氨基酸(LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIV-QRIKDFLRNLVPRTES)，因其N端前兩個(gè)氨基酸殘基是亮氨酸而得名LL-37[11]。Pro-LL-37(hCAP-18)是由人cathelicidin基因(CAMP)基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)，具有生物活性的LL-37由其前體蛋白hCAP-18通過(guò)蛋白酶3胞外裂解而形成[12]。最初在中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LL-37，隨后發(fā)現(xiàn)其在皮膚、肺和腸道的上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[13]。此外，LL-37 是一種多功能蛋白，具有廣譜的抗微生物、抗毒素活性和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用，能夠激活趨化性，連接宿主先天性免疫和獲得性免疫，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。大多數(shù)AMPs通過(guò)破壞微生物膜的完整性來(lái)發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)LL-37的陽(yáng)離子疏水表面可以結(jié)合到細(xì)菌外膜的負(fù)電荷基團(tuán)上，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜破壞，從而抑制病原菌在宿主細(xì)胞中存活。不僅如此，LL-37還可以作為一種免疫監(jiān)測(cè)器，當(dāng)LL-37被細(xì)菌及其產(chǎn)物誘導(dǎo)產(chǎn)生時(shí)，LL-37可以誘導(dǎo)趨化因子表達(dá)并且促進(jìn)免疫細(xì)胞的遷移，從而控制細(xì)菌感染。隨著近年抗菌肽研究的不斷深入，LL-37更多的生物學(xué)功能被挖掘發(fā)現(xiàn)。

2 結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中對(duì)于LL-37表達(dá)的免疫調(diào)控

很多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)M.tb能夠誘導(dǎo)LL-37表達(dá)并發(fā)揮免疫調(diào)控功能。從目前的研究發(fā)現(xiàn)，M.tb可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、人肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中LL-37的表達(dá)[15]。研究發(fā)現(xiàn)BCG能以濃度依賴的方式顯著誘導(dǎo)A549上皮細(xì)胞表達(dá)LL-37，并且ERK1/2和MAPK p38信號(hào)通路參與了BCG誘導(dǎo)LL-37表達(dá)的調(diào)控[16]。CAMP是在小鼠中與人抗菌肽LL-37相似的抗菌肽相關(guān)蛋白，在H37Rv以高劑量感染BALB/c小鼠氣管后，誘導(dǎo)了CAMP基因的高表達(dá)[17]。LL-37的表達(dá)受到來(lái)自自身或者外界不同刺激的影響，維生素D3的活性形式1,25(OH)2D3也可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞表達(dá)LL-37[18]。LL-37表達(dá)的誘導(dǎo)是由維生素D狀態(tài)決定的，缺乏和不足的水平會(huì)導(dǎo)致結(jié)核病的不良反應(yīng)，維生素D狀態(tài)與結(jié)核病的相關(guān)性可能是LL-37表達(dá)上調(diào)和巨噬細(xì)胞活化的結(jié)果[19]。4-苯丁酸鈉(PBA)用于治療一系列的臨床疾病，現(xiàn)被證明可與1α,25(OH)2D3協(xié)同作用上調(diào)細(xì)胞中CAMP的表達(dá)，抵抗M.tb的感染[20]。另外，M.tb介導(dǎo)的LL-37上調(diào)可能受NADPH/ROS信號(hào)通路的影響，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)在BCG誘導(dǎo)的人上皮細(xì)胞LL-37表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[21]。LL-37對(duì)NF-κB、NF-interleukin-6和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，這些轉(zhuǎn)錄因子也有可能參與調(diào)控分枝桿菌誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞中的LL-37表達(dá)[22]?？傊?，這些證據(jù)表明多種信號(hào)分子在介導(dǎo)M.tb誘導(dǎo)的LL-37產(chǎn)生中起重要作用，值得我們深入探究。

另一方面，M.tb及其組分可能抑制LL-37的表達(dá)。Rode等的研究表明熱滅活的M.tb可以通過(guò)TLR2信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)顯著抑制樹(shù)突狀細(xì)胞中cathelicidin表達(dá)，維生素D可以抵消M.tb對(duì)cathelicidin的下調(diào)[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)M.tb衍生的cAMP信號(hào)傳導(dǎo)可調(diào)節(jié)M.tb感染巨噬細(xì)胞的cathelicidin水平，可抑制LL-37轉(zhuǎn)錄[24]。M.tb的一些組分也可以抑制宿主細(xì)胞LL-37的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，比如M.tb脂蛋白LprE，LprE是一種結(jié)核感染發(fā)病中發(fā)揮至關(guān)重要作用的毒力因子，LprE通過(guò)TLR2-p38-CYP27B1-VDR信號(hào)通路抑制THP-1細(xì)胞中LL-37的表達(dá)，參與逃避宿主免疫反應(yīng)從而促進(jìn)胞內(nèi)分枝桿菌存活[25]。M.tb的一些效應(yīng)蛋白抑制LL-37的表達(dá)可能是結(jié)核分枝桿菌免疫逃逸策略之一，由于相關(guān)報(bào)道比較少，抑制LL-37表達(dá)的M.tb組分及機(jī)制還有待被研究。

3 結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中LL-37的免疫殺傷及免疫調(diào)控功能

3.1 LL-37對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的殺傷功能 人體細(xì)胞在感染M.tb時(shí)會(huì)產(chǎn)生高水平的LL-37，LL-37具有殺傷M.tb的活性，還能夠有效降低分枝桿菌的胞內(nèi)存活[26]。研究表明經(jīng)LL-37處理的H37Rv細(xì)胞壁變薄、出芽或破裂、細(xì)胞質(zhì)凝結(jié)，表明了外源性LL-37可以殺傷M.tb[27]。LL-37對(duì)M.tb生長(zhǎng)的影響似乎呈劑量依賴性，使用200 μg/mL的LL-37處理后發(fā)現(xiàn)M.tb的CFU減少了75.7%，而20 μg/mL的LL-37使培養(yǎng)中的M.tb減少了52.4%，這表明LL-37影響M.tb的生長(zhǎng)[28]。Vitamin D (1,25D3)誘導(dǎo)的抗分枝桿菌活性依賴于內(nèi)源性CAMP的表達(dá)[29]，Liu等發(fā)現(xiàn)H37Ra感染單核細(xì)胞THP-1后，Vitamin D (1,25D3)處理細(xì)胞可以增強(qiáng)LL-37對(duì)M.tb的殺傷作用并且刺激LL-37 mRNA和蛋白的表達(dá)，且當(dāng)cathelicidin被siRNA抑制時(shí)，M.tb的胞內(nèi)增殖增強(qiáng)[30]。Adam等報(bào)道C57BL/6小鼠在滴鼻感染牛分枝桿菌卡介苗BCG后，肺組織中編碼CAMP蛋白的Camp基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，cathelicidin表達(dá)上調(diào)意味著對(duì)胞內(nèi)BCG的殺傷增強(qiáng)[31]。這些研究表明，除了能在體內(nèi)外環(huán)境中抑制分枝桿菌生長(zhǎng)外，LL-37還表現(xiàn)出對(duì)H37Rv、H37Ra和BCG等不同類型M.tb的殺菌活性。另外，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌卡介苗BCG感染導(dǎo)致MyD88、pIRAK-4和p38在信號(hào)通路中表達(dá)水平升高，IRAK-4-p38的激活增加了NF-κB的核轉(zhuǎn)位，隨后誘導(dǎo)了Camp的表達(dá)，導(dǎo)致胞內(nèi)BCG被殺傷，而抑制該誘導(dǎo)通路后又能增加分枝桿菌的存活率[32]。LL-37降低M.tb胞內(nèi)存活背后的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，鑒于對(duì)M.tb的殺傷作用，LL-37具有作為抗結(jié)核藥物靶標(biāo)的潛力。

3.2 LL-37的抗結(jié)核免疫調(diào)節(jié)功能 LL-37不僅能夠直接對(duì)病原菌起到殺傷作用，而且能夠調(diào)控免疫細(xì)胞防御功能，參與機(jī)體對(duì)病原菌的免疫調(diào)節(jié)。自噬正在成為一種抗菌防御機(jī)制的關(guān)鍵因素[33]，自噬是小鼠和人類巨噬細(xì)胞對(duì)抗M.tb的重要宿主防御機(jī)制，LL-37對(duì)于自噬體的積累及其與溶酶體的融合至關(guān)重要，已有研究數(shù)據(jù)證明，hCAP18/LL-37表達(dá)是增強(qiáng)誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因表達(dá)所必需的[34]，LL-37影響細(xì)胞自噬并能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號(hào)通路。LL-37介導(dǎo)的自噬激活涉及到P2RX7受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，以及AMPK和PtdIns3K信號(hào)通路是LL-37介導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞自噬的激活所必需的[35]。另有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌脂蛋白LpqH能以TLR2依賴的方式激活抗菌肽介導(dǎo)的自噬，并且誘導(dǎo)LL-37殺死細(xì)胞內(nèi)的M.tb[36]。由此可見(jiàn)，LL-37在感染過(guò)程中的免疫調(diào)控受到宿主細(xì)胞以及結(jié)核分枝桿菌相關(guān)蛋白等多方面因素的影響，在抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

LL-37有利于免疫細(xì)胞在感染部位募集，還可以作為有效的免疫調(diào)節(jié)劑發(fā)揮趨化因子和誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。已經(jīng)證明LL-37可以通過(guò)抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位選擇性地調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因，從而導(dǎo)致TLR觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的失調(diào)[37]。此外，LL-37能夠抑制細(xì)菌組分刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的能力，在A549人肺上皮細(xì)胞系中，LL-37可以降低LPS刺激IL-8和MCP-1產(chǎn)生的能力。結(jié)核病患者的LL-37濃度與疾病嚴(yán)重程度和免疫激活的臨床顯著變量之間存在相關(guān)性，血清LL-37含量可以作為全身免疫激活和宿主炎癥環(huán)境的標(biāo)志物，在結(jié)核病慢性感染過(guò)程中，LL-37濃度可作為免疫激活增強(qiáng)的標(biāo)志[38]。

LL-37可能具有雙重功能，在早期感染期間，它可能是一個(gè)由肺上皮細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的重要因子，有助于控制分枝桿菌的生長(zhǎng)，在感染晚期，它可能是一個(gè)抑制過(guò)度炎癥的重要免疫調(diào)節(jié)因子[39]。在結(jié)核病感染的晚期，LL-37的免疫調(diào)節(jié)特性通過(guò)調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)改變巨噬細(xì)胞的反應(yīng)，從而保護(hù)宿主細(xì)胞[40]。LL-37在抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在宿主中不僅有促炎的效應(yīng)，還可以選擇性地減少巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)而產(chǎn)生相反的抑炎效果。但是，LL-37在M.tb感染過(guò)程中介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)活性的機(jī)制尚未被研究清楚。

4 LL-37在結(jié)核病診斷治療中的應(yīng)用

傳統(tǒng)抗生素日益嚴(yán)重的耐藥性問(wèn)題和對(duì)新抗生素的需求刺激了AMPs作為人類治療藥物開(kāi)發(fā)的興起，其中一些藥物如抗菌肽Pexiganan、MBI-594、MBI-226等已經(jīng)進(jìn)入II/III期臨床試驗(yàn)，有研究認(rèn)為這些產(chǎn)品在不久的將來(lái)也將占據(jù)相當(dāng)大的市場(chǎng)份額。LL-37及其衍生物具有毒性低、與細(xì)胞作用時(shí)間短、不通過(guò)受體發(fā)揮作用的特點(diǎn)，不容易產(chǎn)生耐受性，可以開(kāi)發(fā)成新型的抗菌藥物在醫(yī)藥行業(yè)具有很好的應(yīng)用前景[41]。另有研究發(fā)現(xiàn)，LL-37的表達(dá)水平在結(jié)核病患者和非結(jié)核病個(gè)體中存在顯著差異，與正常健康受試者和革蘭氏陽(yáng)性或陰性細(xì)菌引起的肺炎患者相比，活動(dòng)性肺結(jié)核病患者血清中LL-37的濃度顯著升高[42]，活動(dòng)性肺結(jié)核患者血液中LL-37基因表達(dá)水平也明顯高于潛伏性肺結(jié)核和健康人群[43]。LL-37是活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，LL-37的表達(dá)水平隨著活動(dòng)性結(jié)核感染病情嚴(yán)重程度的增加而增加，由于 LL-37高水平患者更易感染結(jié)核分枝桿菌而發(fā)生活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染，提示LL-37可能可作為活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染的生物學(xué)標(biāo)志物[44]?；顒?dòng)性結(jié)核病患者和潛伏性肺結(jié)核患者的LL-37水平的這種微小差異可能是由于潛伏感染進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病的過(guò)程所致，活動(dòng)性結(jié)核病狀態(tài)下表達(dá)的LL-37水平升高，說(shuō)明LL-37能夠區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和其他結(jié)核病感染的狀態(tài)，但是，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估這一生物標(biāo)志物作為篩查工具來(lái)排除活動(dòng)性結(jié)核病的作用[45]。有研究表明，肺結(jié)核患者LL-37上升或與機(jī)體代償反應(yīng)相關(guān)，認(rèn)為L(zhǎng)L-37可作為診斷結(jié)核病的潛在生物標(biāo)志物[46]，但目前針對(duì)LL-37在結(jié)核病患者治療中的診斷價(jià)值的研究較少。鑒于LL-37的表達(dá)水平與結(jié)核病的存在和結(jié)核病患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)聯(lián)，表明LL-37對(duì)肺結(jié)核患者有一定診斷預(yù)測(cè)價(jià)值，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染患者血清LL-37水平可能有助于監(jiān)測(cè)病情變化，或許可以將LL-37作為診斷靶標(biāo)為結(jié)核病的臨床治療提供一些有價(jià)值的參考意見(jiàn)。

LL-37對(duì)于治療結(jié)核病的研究還沒(méi)有達(dá)到臨床前試驗(yàn)階段，但是大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明在小鼠模型中LL-37能有效抑制M.tb的生長(zhǎng)，小鼠使用LL-37給藥處理1個(gè)月(3次/周)后，發(fā)現(xiàn)LL-37顯著降低了小鼠肺組織中的M.tb載量，LL-37在結(jié)核病治療中表現(xiàn)出良好潛力[27]。外源藥物促進(jìn)LL-37表達(dá)也為預(yù)防和治療疾病提供了新的思路，活性維生素D是LL-37的有效誘導(dǎo)劑[47]。有報(bào)道顯示，前列腺素E2可以通過(guò)前列腺素受體EP4抑制維生素D3誘導(dǎo)的hCAP18/LL-37的表達(dá)來(lái)降低宿主對(duì)M.tb的防御，EP4的一種拮抗劑CJ-023423可能用于結(jié)核病患者的輔助治療[48]。4-苯丁酸鈉(PBA)已被證明誘導(dǎo)LL-37的表達(dá)，在活動(dòng)性結(jié)核病患者接受治療時(shí)分別給藥維生素D、PBA或兩種藥合用都有助于結(jié)核病患者臨床恢復(fù)[49]，聯(lián)合治療可進(jìn)一步抑制M.tb的生長(zhǎng)，PBA和維生素D可能被證明是一種有效的結(jié)核病聯(lián)合輔助治療方法。由此可見(jiàn)，LL-37在結(jié)核病治療方面有很大潛力，但是LL-37在體內(nèi)治療的安全性還有待進(jìn)一步評(píng)估。

5 結(jié) 語(yǔ)

面對(duì)日益嚴(yán)峻的M.tb耐藥問(wèn)題，尋找新型抗結(jié)核藥物的需求更加迫切。目前的研究發(fā)現(xiàn)，LL-37可作為結(jié)核病診斷的標(biāo)志物，可能為結(jié)核感染的免疫診斷、重型結(jié)核病患者的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供新的線索。作為治療結(jié)核病的候選藥物，LL-37不僅對(duì)于M.tb在細(xì)胞內(nèi)存活有影響，還具有免疫調(diào)節(jié)特性，可以介導(dǎo)宿主細(xì)胞的自噬和炎癥反應(yīng)，有利地調(diào)節(jié)免疫活性。有趣的是，Vitamin D (1,25D3)、PBA等藥物可以通過(guò)誘導(dǎo)LL-37表達(dá)介導(dǎo)M.tb感染中對(duì)機(jī)體的保護(hù)，PBA對(duì)M.tb有抑菌作用，與Vitamin D (1,25D3)協(xié)同作用可調(diào)控巨噬細(xì)胞對(duì)感染的反應(yīng)。M.tb感染后可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)LL-37，然而LL-37的表達(dá)又能夠被結(jié)核分枝桿菌相關(guān)組分所抑制，例如M.tb脂蛋白LprE，這可能是M.tb的一種逃避免疫反應(yīng)的新機(jī)制。擴(kuò)大范圍篩選影響LL-37表達(dá)的M.tb效應(yīng)分子，深入了解LL-37表達(dá)過(guò)程中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，將有助于對(duì)新型抗結(jié)核病藥物的研發(fā)。盡管對(duì)LL-37及其在結(jié)核病中作用的了解越來(lái)越多，但還沒(méi)有足夠的證據(jù)來(lái)明確LL-37在結(jié)核中的具體作用，未來(lái)要加強(qiáng)對(duì)LL-37的臨床研究，從而為結(jié)核病的治療提供新的思路。

利益沖突：無(wú)