森林腦炎病毒滴度檢測蝕斑法的建立及驗(yàn)證

陳娜娜，陳詩陽，王穎，杜翔宇，苗會，拱小棠，劉雙軍，李景良

1.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室，吉林 長春 130062；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130062

森林腦炎又稱蜱傳腦炎，是由攜帶森林腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）的蜱蟲叮咬所致的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)橹鞯囊环N自然疫源性急性傳染?。?-2］。TBEV 是一種人獸共患病毒，人感染后會出現(xiàn)高燒、意識模糊、頸肩或四肢肌肉遲緩性麻痹以及腦膜刺激、吞咽困難、呼吸衰竭等癥狀［3-5］。嚴(yán)重可導(dǎo)致永久性神經(jīng)損傷及死亡［6］。在過去幾十年里，森林腦炎已成為西歐、西伯利亞、中國東北部日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［7-9］。目前尚無特異性治療森林腦炎的藥物，接種疫苗是預(yù)防森林腦炎最有效的措施［10-12］。

森林腦炎滅活疫苗的毒種以及生產(chǎn)過程中的病毒滴度檢測方法均采用小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法，該方法存在諸多不可控因素，如檢測周期長、檢測過程繁瑣等，且消耗大量實(shí)驗(yàn)動物。不符合世界衛(wèi)生組織（WHO）有關(guān)動物倫理3R 原則，即減量原則（Reduction）、優(yōu)化原則（Replacement）、替代原則（Refinement）的要求［13-16］。有文獻(xiàn)提倡將 3R 原則納入 WHO生物制品批放行檢測指南［17］。因此，促進(jìn)動物實(shí)驗(yàn)的替代方法能夠保證更快、更有效地實(shí)施3R 原則理念［18-19］。

本研究將鼠腦毒種在原代地鼠腎（primary hamster kidney，PHK）細(xì)胞中進(jìn)行適應(yīng)性傳代，獲得PHK細(xì)胞適應(yīng)的TBEV 株（以下簡稱PHKT 株）。BHK-21細(xì)胞是目前疫苗病毒滴度檢測（蝕斑法）中采用的接種細(xì)胞之一［20］，將 PHKT 株感染 BHK-21 細(xì)胞，建立了檢測PHKT 株感染性滴度的蝕斑法，與小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法進(jìn)行相關(guān)性分析，并進(jìn)行方法驗(yàn)證，為后續(xù)森林腦炎疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒 BHK-21細(xì)胞和“森張”株TBEV 由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級金黃地鼠（12 ～ 14 日齡，雄性，體質(zhì)量13 ～16 g，120只）和SPF級昆明小鼠（雌性，體質(zhì)量7 ～9 g，72只）均由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司動物室提供，動物合格證號：SYXK（吉）2017-0005。本研究對實(shí)驗(yàn)動物的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照《實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》（SA-24-001）相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 主要試劑及儀器 MEM培養(yǎng)基購自日本日水制藥株式會社；新生牛血清購自山西潤生大業(yè)生物材料有限公司；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning Incorporated公司。

1.4 PHKT 的制備 將金黃地鼠無菌取腎，剪碎，經(jīng)0.125%胰酶消化，培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，（37±1）℃培養(yǎng)至細(xì)胞長成致密單層。病毒感染及傳代：將TBEV 10 倍系列稀釋至10-4，接種至培養(yǎng)3 d 長成單層的PHK 細(xì)胞中，1 mL／瓶，加入含2%新生牛血清的MEM 培養(yǎng)基，9 mL／瓶，使病毒終濃度為 10-5，置 33 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，96 h后收獲，即為第1 代病毒，再次感染PHK 細(xì)胞，96 h后收獲，即為第2代病毒，連續(xù)收獲至12代病毒。

1.5 小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法檢測TBEV滴度 將PHKT 10倍系列稀釋，每個稀釋度接種小鼠腦腔，0.03 mL／只，共6只，3 d內(nèi)死亡小鼠不計(jì)（動物死亡數(shù)量應(yīng)不超過試驗(yàn)動物總數(shù)的20%），逐日觀察14 d。采用Reed-Muench法計(jì)算小鼠半數(shù)致死量（LD50）［21］。

1.6 檢測TBEV 滴度的蝕斑法的建立 將長成單層的 BHK-21 細(xì)胞按 1 × 105個／mL 接種 6 孔細(xì)胞板，3 mL／孔，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞長成單層備用。將PHKT 10 倍系列稀釋（10-4～ 10-8），每個稀釋度感染 2 孔，1 mL／孔，并設(shè)2 個細(xì)胞對照孔，37 ℃吸附1.5 h；加入第一層覆蓋液，冷凝后凝固成覆蓋層，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，第3 天加入含3%中性紅的第二層覆蓋物，冷凝后凝固成覆蓋層，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 ～48 h；觀察蝕斑，并對結(jié)果計(jì)數(shù)。

1.7 方法驗(yàn)證

1.7.1 專屬性 在每代病毒感染時，設(shè)細(xì)胞對照組，在每代病毒收獲時，同時收獲細(xì)胞對照組上清液。接受標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞對照組陰性，無空斑形成。

1.7.2 重復(fù)性 取6 份第5 代PHKT 毒種，由相同試驗(yàn)人員檢測TBEV 滴度。可接受范圍：同代次樣品TBEV滴度檢測結(jié)果變異系數(shù)（CV）＜5%。

1.7.3 中間精密度 取第5 代PHKT 毒種，由不同試驗(yàn)人員，在不同時間（第5 代毒種制備后0、7、14、21、28、35 d）進(jìn)行檢測。可接受范圍：同代次樣品TBEV滴度檢測結(jié)果CV＜5%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Excel 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對兩種病毒滴定檢測方法的檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，|r| ＜ 0.3 時為弱相關(guān)，0.3 ≤ |r| ＜ 0.5時為低度相關(guān)，0.5 ≤ |r| ＜ 0.8 時為顯著相關(guān)，0.8 ≤|r| ＜1 時為高度相關(guān)。采用F檢驗(yàn)分析兩種檢測方法間的差異是否顯著，F(xiàn)＞Fɑ表明兩種檢測方法具有顯著的線性關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHKT 的蝕斑特性 觀察結(jié)果顯示，在病毒接種孔中形成蝕斑，蝕斑形態(tài)清晰，大小均一，邊緣整齊，細(xì)胞對照孔無病毒蝕斑出現(xiàn)。不同代次（第4 和12代）蝕斑大小形態(tài)均一且相似。隨病毒稀釋倍數(shù)增加，蝕斑數(shù)減少，呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 第 4 和 12 代 PHKT 毒種在 BHK-21 細(xì)胞上蝕斑形成觀察（中性紅染色）Fig.1 Observation on plaque formation of PHKT virus of 4th and 12th passages on BHK-21 cells（neutral red staining）

2.2 PHKT 滴度穩(wěn)定性 蝕斑法檢測結(jié)果顯示，第1 和2 代PHKT 病毒蝕斑滴度較低，處于適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)階段，第3～12 代PHKT 病毒蝕斑滴度為8.0 ～8.9 lgPFU／mL，不同代次間感染性滴度趨于穩(wěn)定。

2.3 蝕斑法與小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法檢測TBEV 滴度的對比分析 TBEV 適應(yīng)PHK 細(xì)胞后，分別用蝕斑法與小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法檢測TBEV滴度，兩種方法檢測趨勢相同，鼠腦毒種在PHK 細(xì)胞上適應(yīng)前3 代時病毒滴度呈上升趨勢，適應(yīng)3 代后病毒滴度趨于平穩(wěn)。小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法檢測的靈敏度相對較低，蝕斑法較高。見表1 和圖2。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析二者相關(guān)性，經(jīng)回歸分析，r=0.92，高度相關(guān)。以蝕斑法檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)，得出回歸方程y=0.532x+3.425，R2 =0.848 2，二者呈正相關(guān)，見圖3。通過F檢驗(yàn)（P＜ 0.05）結(jié)果來判定回歸效果，兩者間具有顯著的線性關(guān)系，且檢測結(jié)果高度相關(guān)。見表2。

表1 兩種方法TBEV滴度檢測結(jié)果的對比Tab.1 Comparison of detection results of TBEV titer by two methods

表2 方差分析表Tab.2 Table of variance analysis

圖2 兩種檢測方法病毒滴度對比趨勢圖Fig.2 Trend chart of comparison of virus titers detected by two detection methods

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 專屬性 在其他成分（如新生小牛血清、細(xì)胞代謝物等）存在下，蝕斑法可檢出第1 ～6 代PHKT毒種的毒力（分別為 5.00、6.84、8.70、7.85、8.9、8.85 lgPFU／mL），其他成分對檢測結(jié)果無影響，而細(xì)胞對照組未檢出毒力。

2.4.2 重復(fù)性 第5 代PHKT 毒種同一試驗(yàn)人員6次檢測結(jié)果（分別為8.90、8.85、8.78、8.85、8.85、8.90 lgPFU／mL）的CV為0.5%，＜5%，重復(fù)性良好。

2.4.3 中間精密度 不同試驗(yàn)人員不同時間檢測第5代PHKT 毒種滴度接近，CV均＜5%，中間精密度良好，見表3。

表3 蝕斑法檢測TBEV滴度中間精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification results of intermediate precision of TBEV titer detected by plaque method

3 討論

目前蝕斑法已廣泛應(yīng)用于多種病毒滴度檢測中，檢測結(jié)果可靠、敏感、重復(fù)性好、客觀性更強(qiáng)，具有檢測效率高、操作簡單、周期短等特點(diǎn)［22-24］。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用蝕斑法（BHK-21 細(xì)胞）檢測TBEV 疫苗免疫血清中和抗體效價，證明了TBEV 對BHK-21 細(xì)胞的易感性［25］，蝕斑法較經(jīng)典小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法敏感性好，可作為小鼠法的替代方法。

兩種方法檢測病毒滴度的對比分析結(jié)果表明，蝕斑法檢測靈敏度高于小鼠腦內(nèi)攻毒滴定法。每個具有感染性的病毒在BHK-21 細(xì)胞上均能呈現(xiàn)出蝕斑，但在動物體內(nèi)極少的TBEV就可能導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠發(fā)病，但劑量較小，不至于導(dǎo)致小鼠死亡，相對降低了病毒滴度檢測結(jié)果。

適應(yīng) PHK 細(xì)胞傳代后的 PHKT 毒種第 3 ～ 12 代滴度穩(wěn)定，可達(dá)108PFU／mL，不同代次間差異不顯著。但第1、2代PHKT 毒種蝕斑滴度較低，可能是鼠腦傳代的TBEV未經(jīng)細(xì)胞傳代，不能較好地適應(yīng)PHK細(xì)胞，因此毒力較弱。第3 代PHKT 毒種在BHK-21細(xì)胞上呈現(xiàn)出較高的感染性滴度（8.7 lgPFU／mL），持續(xù)傳至第12代仍保持較高毒力（8.0 lgPFU／mL），表明不同代次PHKT 毒種在BHK-21 細(xì)胞上滴度穩(wěn)定，無顯著性差異，證明了TBEV 在PHK 細(xì)胞中的傳代穩(wěn)定性。另一方面，因鼠腦毒種（TBEV）在BHK-21細(xì)胞上不能產(chǎn)生蝕斑，而PHK細(xì)胞毒種（PHKT）從第3 代開始能夠在BHK-21 細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定、大小均一的蝕斑，因此，適應(yīng)PHK 細(xì)胞后的TBEV 的基因突變情況需進(jìn)一步深入研究。

蝕斑法檢測TBEV 滴度的方法驗(yàn)證結(jié)果表明，PHKT 毒種在其他成分（如新生小牛血清、細(xì)胞代謝物等）存在下，能靈敏地測定出毒力，專屬性良好。在相同條件下，由相同試驗(yàn)人員測定相同代次樣品TBEV感染性滴度檢測結(jié)果相近，CV為0.5%，重復(fù)性良好。相同代次樣品不同試驗(yàn)人員不同時間TBEV 感染性滴度檢測結(jié)果相近，CV 為0.40% ～0.96%，中間精密度良好。進(jìn)一步證明，蝕斑法檢測TBEV毒力可靠且可行。為將來TBEV 疫苗毒種變更奠定了良好的基礎(chǔ)，也為疫苗生產(chǎn)中間品的質(zhì)量控制提供了精確的檢測手段。