TrypLE雙抗體夾心定量ELISA檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

畢華，盧寧，牛林茹，王玉哲，朱香，李文慧，楊凌，趙君，周勇，梁雅麗

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院生檢所重組藥物室，北京 100050；2.山西生物研究院有限公司，山西 太原 030000；3.山西集創(chuàng)生物科技有限公司，山西 太原 030000；4.君研生物科技（山西）有限公司，山西 太原 030000

胰蛋白酶Trypsin（Parenzyme）是一種從牛、羊、豬的胰臟提取的絲氨酸蛋白水解酶，為特異性最強(qiáng)的蛋白酶，主要應(yīng)用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的消化，可使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散［1-2］。

TrypLE 是一種通過生物工程制備的非動(dòng)物源性胰蛋白酶類似物，目前主要應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)中。其可替代傳統(tǒng)的豬和牛的胰蛋白酶將細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解，從而使細(xì)胞離散或使貼壁細(xì)胞解離下來。Trypsin 作為通過動(dòng)物體提取的酶類，存在批間差異大、純度較低、有潛在動(dòng)物源病毒感染等問題，且使用時(shí)必須添加特異性酶抑制劑才可中止消化［3］。而TrypLE 是利用基因工程技術(shù)制備的重組蛋白，純度高，一致性好，特異性強(qiáng)，無(wú)動(dòng)物源感染風(fēng)險(xiǎn)［4-5］。此外，TrypLE已被證明可解離無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞，作用細(xì)胞時(shí)更加溫和，無(wú)需酶抑制劑，稀釋即可終止反應(yīng)，極大程度上減少了外來物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的干擾［6］?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，TrypLE 已逐漸替代傳統(tǒng)的胰蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)揮作用，并廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)工藝中。

胰蛋白酶現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》二部（2020版），收錄的檢測(cè)項(xiàng)目未包含殘留量檢測(cè)，滯后于目前藥品生產(chǎn)與質(zhì)量控制中的要求［7］。這不僅在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)，給相關(guān)生物制品的臨床使用造成安全隱患，也是生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制中仍需完善的一環(huán)。TrypLE作為廣泛應(yīng)用于制藥工藝的胰蛋白酶類似物，其殘留檢測(cè)的重要性也愈發(fā)顯著。本研究旨在建立一種雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法，并進(jìn)行驗(yàn)證及初步應(yīng)用，以期可有效、快速、便捷地檢測(cè)樣品中TrypLE的含量。

1 材料與方法

1.1 生物制品類樣品 痘苗病毒（1、2）、慢病毒、單純皰疹病毒和干細(xì)胞治療藥物均由山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑及儀器 TrypLE標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：2215065）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶（批號(hào)：20210318）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；重組胰蛋白酶（批號(hào)：20210221）購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（批號(hào)：7151）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedical 公司；核酸酶（批號(hào)：B7919790）購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BCA 法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：G914DA0005）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔抗TrypLE 多克隆抗體委托金斯瑞生物科技有限公司制備；HRP 標(biāo)記的TrypLE 兔多克隆抗體為中國(guó)食品藥品檢定研究院生檢所重組藥物室制備；酶標(biāo)儀（M190）購(gòu)自美國(guó)MD公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)定 使用BCA 蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)試劑盒對(duì)TrypLE 原液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測(cè)，由3 名實(shí)驗(yàn)員在1 個(gè)月內(nèi)分別重復(fù)檢測(cè)30 次，計(jì)算結(jié)果的均值。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 雙抗體夾心ELISA方法的建立 將兔抗TrypLE多克隆抗體作為捕獲抗體，用包被緩沖液（0.05 mol／L碳酸鹽溶液，pH 9.6）稀釋成1、2、3、4 μg／mL 后，加入酶標(biāo)板，100 μL／孔，4 ℃包被過夜；PBST 洗滌，加入封閉液（含3%BSA的PBST溶液），200 μL／孔，37 ℃封閉 2 h；PBST 洗滌，加入稀釋至 40 ng／mL 的TrypLE標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照（PBST溶液），100 μL／孔，37 ℃溫育2 h；PBST 洗滌，加入HRP標(biāo)記的兔多克隆抗體作為檢測(cè)抗體（1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000稀釋），100 μL／孔，37 ℃溫育1.5 h；加入TMB顯色液，37 ℃避光溫育15 min；加入終止液（2 mol／L濃H2SO4），使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm 處的吸光度值。以P／N ≥ 2.1為陽(yáng)性，P／N ＜ 2.1為陰性［8-9］。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 線性范圍 將TrypLE 抗原標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋至0.41 ～40.00 ng／mL，用建立的雙抗體夾心ELISA方法重復(fù)檢測(cè)3次，以抗原濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，使用四參數(shù)擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 特異性 使用建立的方法檢測(cè)梯度稀釋的TrypLE、胰蛋白酶、重組胰蛋白酶［10］、牛血清白蛋白以及核酸酶濃度，驗(yàn)證方法的特異性。

1.5.3 檢測(cè)限 用樣本稀釋液（PBST溶液）作為樣本重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)定結(jié)果的A450值，計(jì)算平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+ 2SD對(duì)應(yīng)的A450值，帶入標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為檢測(cè)限。

1.5.4 定量限 將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 ng／mL 后，重復(fù)測(cè)定各 10 次，結(jié)果的平均值記為M1 ～M10。根據(jù)公式：測(cè)量偏差=（M-理論值）／理論值×100%，計(jì)算10 次測(cè)定結(jié)果的M和SD，得出變異系數(shù)（CV=SD／M× 100%）。選取CV≤15%的最低濃度作為定量限。

1.5.5 準(zhǔn)確性

1.5.5.1 測(cè)量偏差 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至高（32 ng／mL）、中（20 ng／mL）、低（2 ng／mL）3個(gè)濃度后，分別測(cè)定3次，計(jì)算M值及測(cè)量偏差。

1.5.5.2 加標(biāo)回收率 將待測(cè)樣品分為等體積4份。其中 3 份中加入等體積濃度為 40、16、6.4 ng／mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，加入體積小于原體積的10%，計(jì)算加入的待測(cè)物濃度；在另一份樣品中加入等體積的PBST 溶液，制成基礎(chǔ)樣本。對(duì)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算均值，并按下式計(jì)算加入濃度和回收率。

加入濃度= 標(biāo)準(zhǔn)液濃度× 標(biāo)準(zhǔn)液體積／（樣本體積+標(biāo)準(zhǔn)液體積）；

回收率（%）=（待回收樣本濃度均值- 基礎(chǔ)樣本濃度均值）／加入濃度×100%；

平均回收率（%）=（回收率1 + 回收率2 +…+ 回收率n）／n×100%

1.5.6 重復(fù)性 分別將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品A（40 ng／mL）和 B（16 ng／mL）、C（6.40 ng／mL）和D（2.56 ng／mL）等體積混勻制成不同濃度的檢測(cè)樣本，其中A+B理論濃度為28 ng／mL，C+D理論濃度為4.48 ng／mL，各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算M、SD和CV。

1.6 樣品檢測(cè) 用建立的方法檢測(cè)痘苗病毒（1、2）、慢病毒、單純皰疹病毒、干細(xì)胞治療藥物樣品。將不同樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，并按照加標(biāo)回收率檢測(cè)方法，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算回收率，以驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同種類樣品的適用性。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)定 3名實(shí)驗(yàn)員采用BCA法在1個(gè)月內(nèi)分別重復(fù)檢測(cè)30 次TrypLE 原液的均值分別為20.11、20.17、20.09 μg／mL，總均值為20.12 μg／mL，最終確定標(biāo)準(zhǔn)品原液的濃度為20.12 μg／mL。

2.2 雙抗體夾心ELISA方法的建立 不同濃度檢測(cè)抗體和捕獲抗體A450值見表1。綜合考慮強(qiáng)抗原的A450值在2.0左右、空白值較低、P／N值為陽(yáng)性且數(shù)值最大的組合，最終選定捕獲抗體用3 μg／mL濃度包板，酶標(biāo)檢測(cè)抗體稀釋15 000倍的組合建立檢測(cè)方法。

表1 不同工作濃度的兩種抗體組合的A450值Tab.1 A450 values of combinations of two antibodies at various working concentrations

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。曲線擬合方程為：y=（5.66-0.042）／［1+（x／57.88）-1.20］+0.042，r2=1.000，表明在0.41 ～40.00 ng／mL范圍內(nèi)線性較好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.3.2 特異性 使用建立的方法檢測(cè)多種酶和蛋白質(zhì)，除TrypLE 外，不同濃度的胰蛋白酶、重組胰蛋白酶、牛血清白蛋白和核酸酶的A450值均小于0.1，見圖2。表明與濃度無(wú)相關(guān)性，該方法具有較好的特異性。

圖2 建立的ELISA法檢測(cè)不同樣品的結(jié)果Fig.2 Results of various samples detected by the developed ELISA

2.3.3 檢測(cè)限 用建立的方法檢測(cè)20次樣本稀釋液的平均A450值為0.046，SD為0.001 6，根據(jù)公式A450=M+2SD，得到A450=0.050，帶回原標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得檢測(cè)限為0.258 ng／mL。

2.3.4 定量限 低濃度標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)定10 次，CV≤15%的最低濃度為0.5 ng／mL，見表2，因此選擇此濃度作為定量限。

表2 低濃度定量限檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection results of low concentration LOQ

2.3.5 準(zhǔn)確性

2.3.5.1 測(cè)量偏差 高、中、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的測(cè)量偏差均小于5%，見表3。表明建立的方法準(zhǔn)確性較好。

表3 高、中、低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量偏差Tab.3 Measurement deviation of standards at high，medium and low concentrations

2.3.5.2 加標(biāo)回收率 不同加標(biāo)濃度樣品的回收率均在80% ～120%以內(nèi)，見表4。表明其他干擾物質(zhì)對(duì)本方法準(zhǔn)確性影響較小。

表4 加標(biāo)回收率檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Detection result of spike recovery

2.3.6 重復(fù)性 樣品A+B 的M和SD分別為25.904和 0.463 ng／mL，C + D 的M和SD分別為 4.212 和0.165 ng／mL；A+B 和 C+D 的CV分別為 1.79% 和3.91%，均＜5%。表明該方法重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，對(duì)外界干擾因素的抵抗能力強(qiáng)。

2.4 樣品檢測(cè) 所有樣品的加標(biāo)回收率均在80% ～120%之間，見表5，表明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可信。其中痘苗病毒樣品1 和慢病毒樣品的回算濃度低于檢測(cè)限，痘苗病毒樣品2、單純皰疹病毒樣品和干細(xì)胞治療藥物樣品的回算濃度較大，表明此3 種樣品中有明顯的TrypLE殘留。

表5 不同類型生物制品樣品檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Detection results of various types of biological products

3 討 論

目前，生物制品得到越來越廣泛的使用，其質(zhì)量控制的要求也愈加嚴(yán)格，如生物技術(shù)藥物中的重組單抗類制品、疫苗類制品、基因治療制品與治療性重組蛋白等［11］。在《中國(guó)藥典》二部（2020版）中均有明確的質(zhì)量控制檢測(cè)項(xiàng)目，包括鑒別試驗(yàn)、理化測(cè)定、分子大小、結(jié)構(gòu)特征、異常毒性檢查、無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、佐劑、抑菌劑及工藝雜質(zhì)殘留量檢測(cè)等，其中工藝雜質(zhì)殘留檢測(cè)是多種類別生物制品的共同檢測(cè)項(xiàng)目，其中包括對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)殘留物、生物原材料殘留物等的檢測(cè)。

一項(xiàng)研究將人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESCs）用TrypLE 和胰蛋白酶（酶促組）和乙二胺四乙-EDTA（非酶促組）處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)酶促組轉(zhuǎn)染后無(wú)法穩(wěn)定細(xì)胞活力和hESCs 的回收率，也無(wú)法保持與正常組相似的細(xì)胞功能水平［12］。另一項(xiàng)研究采用酶促法（TrypLE）與非酶促法（乙二胺四乙酸和刮擦法）分離人類骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），并對(duì)MSC 活力、趨化因子受體表達(dá)、多潛能、免疫調(diào)節(jié)和趨化因子依賴性遷移進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，TrypLE導(dǎo)致了細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)的喪失，細(xì)胞活力降低，多能性和免疫調(diào)節(jié)受到影響［13-14］。此外，長(zhǎng)期以來，暴露于酶粉塵已引起呼吸道職業(yè)性超敏反應(yīng)，一些研究已報(bào)道了由含胰蛋白酶產(chǎn)品引起的特定氣道致敏的明確病例［15］，而 TrypLE 作為胰蛋白酶類似物，也極有可能存在一定的致敏性。

本研究建立了針對(duì)胰蛋白酶類似物TrypLE 的檢測(cè)方法，并進(jìn)行了全性能驗(yàn)證。該方法在0.41 ～40 ng／mL范圍內(nèi)的R2＞0.99，呈良好的線性；方法的靈敏度可達(dá)0.258 ng／mL，定量下限設(shè)在0.41 ng／mL，表明靈敏度較高，檢測(cè)范圍較廣。用該方法檢測(cè)了胰蛋白酶、重組胰蛋白酶等，發(fā)現(xiàn)無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法特異性好。通過重復(fù)測(cè)定不同濃度的樣本，表明該方法標(biāo)準(zhǔn)偏差較低、加標(biāo)回收率穩(wěn)定在80% ～120%，符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的性能指標(biāo)，表明整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確穩(wěn)定，抗外界物質(zhì)干擾能力較強(qiáng)。

此外，采用建立的方法檢測(cè)了不同類型的生物藥物，如基因治療類藥物、細(xì)胞治療類藥物等，結(jié)果表明，不同樣品的加標(biāo)回收率均達(dá)到較好的范圍，表明該方法對(duì)不同類型樣品均具有良好的適用性。

綜上所述，本研究建立的方法可穩(wěn)定、有效、快捷地檢測(cè)樣品中TrypLE 的含量，可用于細(xì)胞培養(yǎng)或生物醫(yī)藥生產(chǎn)中TrypLE 的定量檢測(cè)，幫助企業(yè)更好地進(jìn)行產(chǎn)品的質(zhì)量控制。生物技術(shù)藥物的快速發(fā)展對(duì)于質(zhì)控檢測(cè)產(chǎn)品提出更高的要求，本研究將在后續(xù)進(jìn)一步開展本方法對(duì)于更多種類藥物，如抗體、疫苗等的適用性評(píng)估［16］，并繼續(xù)優(yōu)化方法的性能。