熱量限制對小鼠心肌缺血／再灌注損傷的影響及其作用機(jī)制

王文麗，賀忠梅，吉曄楠，孫思雨，楊瑞瑞，燕子，曹濟(jì)民

山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001

心血管疾病位居全球人類死因的首位，且發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢［1-2］。目前，對急性缺血性心臟病患者的主要治療方式為缺血區(qū)域再灌注，這是提高救治成功率、改善患者生活質(zhì)量的重要措施［3］。研究表明，單純再灌注療法可能加重已有的缺血性心肌損傷，甚至威脅患者生命，即心肌缺血／再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MI／RI）［4］。MI／RI 的發(fā)生機(jī)制與氧自由基生成過多，中性粒細(xì)胞浸潤，線粒體結(jié)構(gòu)與功能受損，心肌細(xì)胞壞死、凋亡及焦亡等密切相關(guān)［5-6］。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是由gasdermin 蛋白家族D（gasdermin D，GSDMD）介導(dǎo)的一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)為Nod 樣蛋白受體3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體活化、caspase-1 激活及細(xì)胞膜孔形成，胞漿內(nèi)IL-1β和IL-18釋放，從而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)［7］。細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡有相似特征，如DNA 損傷、核固縮和caspase 依賴性，但細(xì)胞焦亡有其特殊的形態(tài)學(xué)特征，如焦亡細(xì)胞會發(fā)生染色質(zhì)濃縮和DNA 斷裂，但細(xì)胞核仍保持完整［8］；焦亡過程產(chǎn)生的DNA 損傷不依賴caspase 活化的DNA 酶（caspase activated DNase，CAD）［9］；細(xì)胞焦亡時(shí)炎癥誘導(dǎo)的孔隙形成導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和胞膜滲透溶解，而凋亡的細(xì)胞膜是完整的［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡和相關(guān)炎癥小體激活在動脈粥樣硬化、心肌梗死、MI／RI等心血管疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［10-11］。熱量限制（caloric restriction，CR）是一種抗衰老、抗肥胖、推遲或減少老齡相關(guān)疾病的飲食調(diào)控方法。研究發(fā)現(xiàn)，CR 對心血管系統(tǒng)具有多重保護(hù)作用，可防止血管發(fā)生動脈粥樣硬化，提高心肌耐受性，延緩心臟衰老［12］。另有研究報(bào)道，在大鼠MI／RI 模型中，CR可通過減少活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生改善 MI／RI［13］，但 CR 對 MI／RI產(chǎn)生的影響與細(xì)胞焦亡的相關(guān)性尚未明確。因此，本研究在對小鼠進(jìn)行CR 干預(yù)基礎(chǔ)上，構(gòu)建MI／RI 模型，觀察細(xì)胞焦亡情況，以評價(jià)CR 對MI／RI的保護(hù)作用，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 伊文思藍(lán)／TTC 試劑、SDS-PAGE 凝膠試劑盒及蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）均購自北京索萊寶技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehvde，MDA）含量及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）含量檢測試劑盒購自武漢 Bio-Swamp 公司；IL-1β 及 IL-18 ELISA 檢測試劑盒均購自北京Sino Biological 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 和兔抗GAPDH 多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 AffinitY 公司；兔抗 NLRP3 及 caspase-1 多克隆抗體均購自沈陽萬類生物有限公司；兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speckle-like protein，ASC）多克隆抗體購自中國ABclonal公司；兔抗GSDMD多克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57小鼠，40只，雄性，8月齡，體質(zhì)量25～30 g，由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場提供，動物許可證號為：SCXK（京）2016-0002。本實(shí)驗(yàn)對小鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（文件號：SYDL2019012）。

1.3 動物分組及處理 將40只小鼠隨機(jī)分為正常飲食組（AL 組）和CR 組，每組20 只，AL 組小鼠每日自由攝食；CR 組小鼠控制日進(jìn)食量，每2 周遞減10%，持續(xù)8 周，監(jiān)測體質(zhì)量變化。每組再分為假手術(shù)組和 MI／RI 組，共 4 組，即 AL+Sham 組、AL+I／R 組和CR+Sham組、CR+I／R組，每組10只。將AL+I／R組和CR +I／R 組小鼠用七氟醚麻醉后，氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)，于左側(cè)第3～4 肋間開胸，暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，30 min 后松開結(jié)扎線再灌注24 h；相應(yīng)Sham組只穿線不結(jié)扎。

1.4 各組小鼠心肌缺血和梗死面積的測定 采用伊文思蘭／TTC 染色法。再灌注24 h 后，原位結(jié)扎冠狀動脈，右心腔注射0.2 mL 2%伊文思藍(lán)，鉗夾腹主動脈，30 s后剪下心臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗，-80 ℃放置5 min；取出，將心臟組織切成1～1.5 mm 厚的切片，放入預(yù)熱的2%TTC 中，37 ℃避光孵育30 min；置多聚甲醛中固定30 min，拍照，計(jì)算心肌缺血區(qū)面積和梗死面積。假手術(shù)組未經(jīng)缺血再灌注手術(shù)，因此未進(jìn)行伊文思蘭／TTC染色。

1.5 各組小鼠心肌組織病理學(xué)觀察 采用HE 染色法。將小鼠心肌組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后常規(guī)切片，將切片置65 ℃烤炙1 h；經(jīng)二甲苯脫蠟及酒精梯度脫水后進(jìn)行常規(guī)HE染色，置光鏡下觀察。

1.6 各組小鼠心肌組織損傷情況的測定 取20 mg小鼠心肌組織，置EP 管中，加入 180 μL 的0.9%氯化鈉溶液，于冰上剪碎，超聲粉碎后，3 000×g離心10 min，收集上清，采用相應(yīng)試劑盒檢測LDH、SOD活性及CK-MB、MDA含量。

1.7 各組小鼠血清中IL-1β 及IL-18 含量的檢測 采用ELISA 法。再灌注24 h 后，經(jīng)小鼠腹主動脈采血，分離血清，采用相應(yīng)試劑盒檢測血清中IL-1β及IL-18含量。

1.8 各組小鼠心肌組織細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Western blot 法。再灌注24 h 后，用RIPA 裂解液提取各組小鼠心臟組織蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1多克隆抗體（均1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜；用TBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（均1∶2 000 稀釋），室溫孵育2 h；ECL 法顯色。采用Image J 軟件分析條帶的灰度值，目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 6.02 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩組比較采用t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化 AL 組小鼠體質(zhì)量較平穩(wěn)，呈略增趨勢，而CR組小鼠體質(zhì)量有所降低。8周后，CR組小鼠體質(zhì)量［（24.54±0.41）g］明顯低于AL組［（31.46±0.25）g］，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.34，P＜ 0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠的體質(zhì)量Fig.1 Body weights of mice in various groups

2.2 各組小鼠的心肌缺血和梗死面積 AL+I／R組及CR+I／R組小鼠心肌缺血區(qū)面積分別為（72.04±4.50）%和（76.28±3.01）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.783 0，P＞ 0.05）；心梗面積分別為（73.33 ± 3.14）%和（47.53 ± 1.69）%，CR+I／R組較AL+I／R組明顯減少（t=7.250，P＜ 0.01）。見圖2。

圖2 小鼠心肌缺血和梗死面積的比較Fig.2 Comparison of myocardial ischemia and infarct size in mice

2.3 各組小鼠心肌組織病理學(xué)觀察 AL + Sham 及CR + Sham 組小鼠心肌纖維排列整齊；AL + I／R 組小鼠心肌纖維斷裂，失去正常的整齊排列結(jié)構(gòu)，并伴有心肌細(xì)胞的壞死，CR+I／R 組小鼠心肌纖維排列則相對整齊，病理改變明顯減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織的鏡下觀察（HE染色，×200）Fig. 3 Microscopy of myocardial tissue of mice in various groups（HE staining，× 200）

2.4 各組小鼠心肌組織的損傷情況 與AL + Sham組比較，AL+I／R組小鼠心肌組織中的LDH 活性及CK-MB、MDA 含量明顯增加（t分別為7.691、5.051、5.515，P均 ＜ 0.01），SOD 活性明顯降低（t= 7.458，P＜ 0.05）；與 AL + I／R 組比較，CR + I／R 組 LDH活性及CK-MB、MDA 含量明顯降低（t分別為4.331、2.875、5.343，P均 ＜ 0.05），SOD 活性明顯增加（t=4.211，P＜ 0.05）。見表1。表明 CR 能改善MI／RI所致的心肌損傷。

表1 各組小鼠心肌組織中LDH、SOD的活性及CK-MB、MDA的含量（，n=4）Tab.1 Activity of LDH and SOD and content of CK-MB and MDA in myocardium of mice in various groups（，n=4）

表1 各組小鼠心肌組織中LDH、SOD的活性及CK-MB、MDA的含量（，n=4）Tab.1 Activity of LDH and SOD and content of CK-MB and MDA in myocardium of mice in various groups（，n=4）

注：與AL+Sham組比較，a表示P ＜ 0.05，aa表示P ＜ 0.01；與AL+I／R組比較，b表示P ＜ 0.05。

組別AL+Sham AL+I／R CR+Sham CR+I／R LDH（U／L）7 821±241.1 11 626±432.0aa 6 101±533.6 9 613±171.4b CK-MB（ng／mL）10.24±0.33 14.12±0.69aa 9.52±0.59 12.06±0.18b SOD（U／mL）138.7±4.45 102.7±1.89a 141.9±4.46 119.5±3.51b MDA（nmol／mL）6.24±0.43 9.28±0.34aa 4.89±0.76 7.29±0.15b

2.5 各組小鼠血清中IL-1β及IL-18的含量 與AL+Sham組比較，AL+I／R組小鼠血清中IL-1β及IL-18含量明顯升高（t分別為6.626和13.500，P均＜0.05）；與AL+I／R 組比較，CR + I／R 組小鼠血清中 IL-1β及IL-18 含量明顯降低（t分別為3.375和4.266，P均＜0.05）。見表2。表明CR 可降低MI／RI 后炎癥因子IL-1β及IL-18的表達(dá)。

表2 ELISA 法檢測各組小鼠血清中IL-1β 及IL-18 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.2 Determination of serum levels of IL-1β and IL-18 in mice of various groups by ELISA（pg／mL，，n=5）

表2 ELISA 法檢測各組小鼠血清中IL-1β 及IL-18 的含量（pg／mL，，n=5）Tab.2 Determination of serum levels of IL-1β and IL-18 in mice of various groups by ELISA（pg／mL，，n=5）

注：與AL+Sham 組比較，a表示 P ＜ 0.05；b 表示與AL+I／R 組比較，P ＜ 0.05。

組別AL+Sham AL+I／R CR+Sham CR+I／R 23.68±0.88 55.39±4.71a 24.00±0.94 37.96±2.13b 234.9±12.38 746.3±54.21a 210.6±27.02 500.6±19.46b IL-1βIL-18

2.6 各組小鼠心肌組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 與AL + Sham 組比較，AL + I／R 組小鼠心肌組織細(xì)胞中NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1 的相對表達(dá)水平顯著上調(diào)（t分別為 5.919、4.071、7.033、6.495，P均 ＜ 0.01）；與AL+I／R組比較，CR+I／R組的 NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平分別降低了32%、36%、26%和30%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為3.412、3.420、3.480、2.585，P均 ＜0.05）。見圖4和表3。

圖4 Western blot 法檢測各組小鼠心肌組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blotting of expression of pyroptosis-associated proteins in myocardial tissue of mice in various groups

表3 各組小鼠心肌組織細(xì)胞中NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的相對表達(dá)水平（，n=4）Tab.3 Relative expression levels of NLRP3，GSDMD，ASC and caspase-1 in myocardial tissue of mice in various groups（，n=4）

表3 各組小鼠心肌組織細(xì)胞中NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1的相對表達(dá)水平（，n=4）Tab.3 Relative expression levels of NLRP3，GSDMD，ASC and caspase-1 in myocardial tissue of mice in various groups（，n=4）

注：a 表示與 AL+Sham 組比較，P ＜ 0.01；b 表示與 AL+I／R 組比較，P ＜ 0.05。

組別AL+Sham AL+I／R CR+Sham CR+I／R NLRP3 0.44±0.05 1.06±0.09a 0.47±0.04 0.72±0.03b GSDMD 0.49±0.08 1.03±0.10a 0.43±0.07 0.66±0.04b ASC 0.39±0.07 0.97±0.04a 0.39±0.02 0.72±0.06b caspase-1 0.36±0.04 0.76±0.05a 0.37±0.03 0.53±0.07b

3 討 論

CR 是科學(xué)家于1935 年提出的一種純飲食調(diào)節(jié)方案，指攝食種類正常、攝入量總量減少30%～40%，同時(shí)保證必需氨基酸的攝入。CR 能夠延緩機(jī)體衰老，延長壽命，這種保護(hù)效應(yīng)與降低機(jī)體新陳代謝，減少氧自由基產(chǎn)生有關(guān)［14-15］。非藥物的飲食調(diào)控可避免藥物的毒副作用，但這種方法也受到一些質(zhì)疑，因此探討其對機(jī)體保護(hù)作用的具體機(jī)制是進(jìn)行科學(xué)推廣的一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。DAVID 等［16］報(bào)道，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型中，CR 可激活抗氧化酶SOD 和GSH-Px 的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。另外，用間歇性禁食模擬CR 可減小大鼠的心肌梗死面積，減少心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌組織肥厚程度，改善心室重構(gòu)［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，CR對小鼠MI／RI具有保護(hù)作用，即CR 能明顯減少M(fèi)I／RI 引起的心肌組織LDH 與CK-MB 釋放（P＜ 0.05），減小心梗面積（P＜0.01），改善心肌組織的病理變化，同時(shí)能夠減輕MI／R所致的氧自由基過度生成（P＜0.05）。

細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［7］，當(dāng)機(jī)體受到傷害性刺激時(shí)，活化NLRP3 炎性小體，激活caspase-1 及切割GSDMD，可產(chǎn)生具有成孔活性的GSDMD-N 末端，GSDMD-N 末端在細(xì)胞膜上寡聚形成跨膜孔，使胞漿內(nèi)IL-1β、IL-18 等炎癥因子釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)［19］。GUO等［20］報(bào)道，在MI／RI大鼠模型中，抑制miR-383可通過激活RP105／PI3K／AKT通路，從而減少NLRP3炎性小體的激活，改善MI／RI，表現(xiàn)為LDH 與CKMB 的釋放減少及心肌梗死面積明顯減小，表明抑制細(xì)胞焦亡是減輕MI／RI 的一種有效策略。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CR 可明顯降低MI／RI 小鼠細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白 NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1 的表達(dá)水平（P均 ＜0.05），表明CR 可抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，該結(jié)果與上述研究結(jié)果相符。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立CR 小鼠模型，觀察CR 對MI／RI 的影響，發(fā)現(xiàn)CR 可減輕小鼠心肌組織的損傷狀況和氧化應(yīng)激水平，減小術(shù)后心肌梗死面積，緩解MI／RI 病理損傷程度，改善MI／RI 損傷。CR 可抑制細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，證明抑制細(xì)胞焦亡是CR 減輕MI／RI 的一種保護(hù)途徑。本研究為缺血性疾病的治療提供了新的非藥物輔助策略，但由于CR 的作用具有多靶點(diǎn)和復(fù)雜性，許多潛在的分子機(jī)制尚未明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需設(shè)計(jì)多種CR 方案或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)深入探究其減輕MI／RI 的其他可能作用機(jī)制。