基于通過式固相萃取凈化的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中5種肽類抗生素

劉 真，王玉梅，胡文彥

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 211198）

肽類抗生素，又稱抗菌肽，是在動植物、微生物體內(nèi)產(chǎn)生的一類具有生物活性的抗生素，包括達托霉素、多粘菌素、桿菌肽、維吉尼亞霉素、萬古霉素等［1］。由于其可抗革蘭氏菌、真菌和病毒等效用，被廣泛用作獸藥添加到動物飼料中，用于預(yù)防、治療動物傳染病，促進飼料轉(zhuǎn)化率和提高動物的生長速度。肽類抗生素一般被視為最后防線藥物，過量使用或者不遵循休藥期使用，將導(dǎo)致動物源性食品中肽類抗生素殘留通過食物鏈傳遞給人類，長期積累會導(dǎo)致肝腎毒性，不僅產(chǎn)生食品安全問題，也會引發(fā)人們對抗藥性的強烈擔(dān)憂［2－3］。因此，國內(nèi)外均出臺了相應(yīng)法規(guī)限制肽類抗生素的使用以及設(shè)定動物源性食品中的限量。我國獸藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 31650規(guī)定豬肉中維吉尼亞霉素M1的限量為100 μg/kg［4］；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號規(guī)定豬肉中禁用肽類抗生素萬古霉素及其鹽、酯［5］，其他肽類抗生素的限量標(biāo)準(zhǔn)也在陸續(xù)制定中，但配套的檢測方法仍不夠完善。因此，針對日常消費量巨大的豬肉這一食用農(nóng)產(chǎn)品，構(gòu)建一種多種肽類抗生素高通量快速檢測方法具有重要的實際應(yīng)用價值。

目前僅有桿菌肽、粘桿菌素、維吉尼亞霉素M1［6］、萬古霉素有相應(yīng)的國標(biāo)檢測方法，但方法的檢測目標(biāo)物單一、檢測對象不全面、檢測步驟也較繁瑣，不利于對肽類抗生素的監(jiān)管應(yīng)用。此外，新一代的環(huán)脂肽類抗生素—達托霉素因?qū)Ω锾m氏陽性菌的治療作用優(yōu)于其他肽類抗生素得到廣泛應(yīng)用［7－8］，目前國內(nèi)外報導(dǎo)了飼料、血漿等基質(zhì)中達托霉素的分析方法［3，9－10］，然而針對動物源性食品中達托霉素的分析研究仍未見報道，造成監(jiān)管盲區(qū)，有較大安全隱患。鑒于液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）具有靈敏度和準(zhǔn)確度高的特點，已成為分析檢測領(lǐng)域的可靠技術(shù)手段［11－13］，本研究基于HPLC－MS/MS技術(shù)，針對豬肉中達托霉素及潛在風(fēng)險較高的4種肽類抗生素（包括萬古霉素、去甲萬古霉素、維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1）建立了同時定性定量測定方法，以期彌補監(jiān)管空白，為打擊違法濫用肽類抗生素提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB SCIEX QUAD 5500液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司），配置電噴霧離子源（ESI）及MultiQuant數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Sorvall LYNX 4000低溫高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；LP Vortex Mixer渦旋振蕩器（美國Thermo Fisher公司）；Fluko FA25均質(zhì)器（上海弗魯克科技發(fā)展有限公司）。甲醇、乙腈（色譜純，德國Meker公司）；甲酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份公司）；實驗用水為Milli－Q超純水；Captiva EMR－Lipid固相萃取小柱（300 mg/3 mL，美國Agilent公司）；有機尼龍濾膜（0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；豬肉樣品（購于南京農(nóng)貿(mào)市場）。

達托霉素（含量99.9%，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸萬古霉素（96.4%，北京曼哈格生物科技有限公司）；鹽酸去甲萬古霉素（99.0%）、利血平（87.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；維吉尼亞霉素M1（1 000 μg/mL）、紅霉素（99.9%）購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；維吉尼亞霉素S1、羅紅霉素（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素、利血平、紅霉素單標(biāo)儲備液，?20 ℃避光保存，有效期3個月；分別準(zhǔn)確吸取維吉尼亞霉素M1、S1及羅紅霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL維吉尼亞霉素M1單標(biāo)儲備液和質(zhì)量濃度為10 μg/mL維吉尼亞霉素S1、羅紅霉素單標(biāo)儲備液，?20 ℃避光保存，有效期1個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取0.01 mL達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素單標(biāo)儲備液，0.1 mL維吉尼亞霉素M1儲備液和1 mL維吉尼亞霉素S1儲備液于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸稀釋至刻度，混勻得到5種肽類抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度為1 μg/mL，臨用現(xiàn)配。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取0.01 mL利血平、紅霉素單標(biāo)儲備液，1 mL羅紅霉素單標(biāo)儲備液于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸稀釋至刻度，混勻得到混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1 μg/mL，臨用現(xiàn)配。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制：分別準(zhǔn)確吸取1、2、5、10、20、50、100、200、500 μL前述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，均加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈?0.1%甲酸水溶液（5∶95，體積比）定容至1 mL，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 ng/mL，臨用現(xiàn)配。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制：分別準(zhǔn)確吸取1、2、5、10、20、50、100、200、500 μL前述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，均加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)提取液定容至1 mL，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為10 ng/mL，臨用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱量豬肉樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL甲醇?2%甲酸（5∶2，體積比），均質(zhì)提取2 min，渦旋振蕩提取3 min，10 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液過免活化的Captiva EMR－Lipid固相萃取小柱凈化，棄掉1 mL前流出液，收集后續(xù)凈化液，過0.22 μm有機尼龍濾膜待上機測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 μm）；柱溫為40 ℃；進樣量5 μL；流動相為0.1%甲酸（A）及0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速為0.3 mL/min；流動相梯度為：0.0 ~ 1.0 min，95% A；1.0 ~ 2.0 min，95% ~ 40% A；2.0 ~ 4.0 min，40% ~ 23% A；4.0 ~ 4.5 min，23% ~ 2% A；4.5 ~6.0 min，2% A；6.0 ~ 6.1 min，2% ~ 95% A；6.1 ~ 8.0 min，95% A。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正模式掃描（ESI +）；離子化電壓（IonSpray vltage）：5 500 V；氣簾氣（Curtain gas）：206.85 kPa（30 psi）；噴霧氣（Ion source gas 1）：379.22 kPa（55 psi）；輔助加熱氣（Ion source gas 2）：379.22 kPa（55 psi）；碰撞氣（Collision gas）：Medium；離子源溫度（Temperature）：550 ℃。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子對信息見表1。其中羅紅霉素為達托霉素、萬古霉素及去甲萬古霉素定量分析的內(nèi)標(biāo)，利血平為維吉尼亞霉素M1及維吉尼亞霉素S1定量分析的內(nèi)標(biāo)。

表1 5種肽類抗生素及2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of five peptide antibiotics and two internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素、維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1屬于肽類大分子抗生素，分子量為525.59 ~ 1 620.67［14－15］，其中達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素的分子量超過1 000，因此傳統(tǒng)的小分子質(zhì)譜離子對優(yōu)化方法難以電離其碎片離子對。

本實驗在質(zhì)譜入口處連接上三通裝置，接頭1用于泵入初始比例流動相，接頭2用于補充泵入1%甲酸水溶液，以增加目標(biāo)物質(zhì)在正模式下的電離程度，接頭3用于泵入1 μg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過優(yōu)化碰撞能及裂解電壓，得到各目標(biāo)物響應(yīng)最佳的一對離子對用于定性定量分析（見表1），其中達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素的母離子帶雙電荷，維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1的母離子帶單電荷。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化在色譜條件的優(yōu)化中，本實驗重點考慮了有機相種類、水相的pH值與成分，以及色譜柱的類型，并基于色譜峰的峰形、峰面積、分辨率和保留時間綜合考慮最優(yōu)色譜條件。分別考察了適合大分子物質(zhì)分析的Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 μm）和Waters Pep?tide CSH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者分離的目標(biāo)物峰形不佳，多刺，且靈敏度較低，因此選擇Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 μm）為最佳色譜柱。

在該色譜柱上，考察了甲醇和乙腈兩種常用流動相試劑，發(fā)現(xiàn)乙腈有助于實現(xiàn)更佳的色譜峰形和色譜分辨率，且在乙腈中添加0.1%甲酸可改善峰面積響應(yīng)，因此確定0.1%甲酸乙腈溶液為有機相。進一步比較0.1%乙酸、0.1%甲酸和0.2%甲酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)增強酸性后，各物質(zhì)的峰形更佳，但酸性增至0.2%甲酸時，目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)均顯著降低，綜合考慮選用0.1%甲酸作為水相。在選用0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸為流動相的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整流動相的梯度比例，可使目標(biāo)物質(zhì)實現(xiàn)有效的洗脫分離和最佳質(zhì)譜響應(yīng)，獲得各物質(zhì)的MRM特征離子色譜圖見圖1。

圖1 5種肽類抗生素及2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的MRM特征離子色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatograms of 5 peptide antibiotics and 2 internal standards

2.2 前處理方法的選擇

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化由于本文關(guān)注的5種肽類抗生素溶解性有差異，其中達托霉素易溶于甲醇和水，萬古霉素、去甲萬古霉素易溶于酸性水溶液，微溶于甲醇，而維吉尼亞霉素M1和維吉尼亞霉素S1易溶于甲醇［16］，因此考慮使用甲醇及甲酸水溶液的混合溶劑對豬肉中以上物質(zhì)進行提取。

首先優(yōu)化提取溶劑中的甲酸含量，考察了體積比均為1∶1的甲醇?2%甲酸、甲醇?1%甲酸和甲醇?0.1%甲酸對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇?1%甲酸提取溶液上機后各目標(biāo)物質(zhì)峰形均很差，難以定量，而甲醇?2%甲酸的提取回收效果整體比甲醇?0.1%甲酸的好，因此確定使用甲醇?2%甲酸。進一步對不同體積比（1∶6、2∶5、3∶4、5∶2、6∶1）的甲醇?2%甲酸進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)隨著水相比例的增大，肉樣中提取出的油及浮沫增多，不利于后續(xù)凈化及過濾膜上機，而甲醇比例越大，提取的上清液越澄清；當(dāng)各目標(biāo)物質(zhì)加標(biāo)水平相同時，不同體積比的甲醇?2%甲酸水溶液的提取效果如圖2所示（n= 3）。隨著混合提取溶液中甲醇比例的增加，維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1及達托霉素的峰面積響應(yīng)明顯增強，但體積比為6∶1時維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1的提取率誤差較大，重復(fù)性較差，且萬古霉素、去甲萬古霉素的峰面積響應(yīng)降低。綜合考慮，確定體積比為5∶2的甲醇?2%甲酸為最佳提取試劑，此時5種肽類抗生素的回收率最好。

圖2 不同體積比甲醇－2%甲酸對5種肽類抗生素的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of five peptide antibiotics under different volume ratios of methanol－2% formic acid

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化由于豬肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，提取溶液中含有大量脂溶性雜質(zhì)，不利于質(zhì)譜分析的穩(wěn)定性，且批量進樣對離子源存在污染，因此需要對提取溶液進行凈化。通常肽類抗生素的凈化采用傳統(tǒng)的Oasis HLB固相萃取柱［17－19］，凈化流程包括固相萃取柱的活化和平衡、上樣、淋洗及洗脫等過程，步驟耗時繁多；50 μg/kg加標(biāo)水平下各物質(zhì)的加標(biāo)回收率如圖3A所示，其中維吉尼亞霉素M1、維吉尼亞霉素S1能實現(xiàn)較好的回收效果，但達托霉素的高親水性及其與Oasis HLB固定相的弱結(jié)合力導(dǎo)致其在淋洗中損失嚴(yán)重，而萬古霉素和去甲萬古霉素由于采用純甲醇為洗脫試劑未能得到有效洗脫，造成回收率較差。

圖3 不同凈化方式對5種肽類抗生素回收率的影響Fig.3 Effect of different purification methods on recoveries of five peptide antibiotics

本實驗選擇了兩款新型的免活化通過式固相萃取柱（Captiva EMR－Lipid和Oasis PRiME HLB小柱）用于除脂以凈化提取液，同時考察了僅采用正己烷除脂的凈化效果（見圖3B）。結(jié)果顯示，Captiva EMR－Lipid小柱的凈化效果最好。目標(biāo)物僅采用正己烷凈化時的回收率低可能是由于待凈化溶液由甲醇與甲酸水溶液組成，而正己烷與水會少量互溶從而導(dǎo)致目標(biāo)物損失，采用Oasis PRiME HLB小柱的回收率較差可能是由于該凈化柱在除脂過程中對目標(biāo)物產(chǎn)生吸附作用所致。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇使用優(yōu)化的提取方法進行樣品前處理后，采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線定量時得到5種肽類抗生素的回收率約為50%，因此考慮引入內(nèi)標(biāo)物減小基質(zhì)效應(yīng)，實現(xiàn)更準(zhǔn)確的定量分析。通常使用目標(biāo)物的同位素內(nèi)標(biāo)，以獲得與目標(biāo)物幾乎一致的色譜行為，減小基質(zhì)效應(yīng)［20］。然而本實驗考察的5種目標(biāo)物，僅達托霉素及萬古霉素有商品化的同位素內(nèi)標(biāo)純品（達托霉素-D5及萬古霉素-D12），且價格昂貴。參考已有文獻［10，21］，本實驗選擇3種常用物質(zhì)（利血平、紅霉素、羅紅霉素）作為內(nèi)標(biāo)進行考察。實驗結(jié)果顯示，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，3種內(nèi)標(biāo)物的保留時間分別為3.31、3.05、3.20 min，與5種肽類抗生素的出峰時間相近，適宜作為內(nèi)標(biāo)使用；但紅霉素作為內(nèi)標(biāo)時，5種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率（以50 μg/kg為例）均遠超100%，不同目標(biāo)物的定量結(jié)果達到加標(biāo)量的2 ~ 6倍，說明當(dāng)前的樣品前處理條件下，紅霉素與5種目標(biāo)物的回收效果差異大，不適合作為內(nèi)標(biāo)物。以羅紅霉素和利血平作為內(nèi)標(biāo)分別對5種肽類抗生素進行定量分析，確定達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素使用羅紅霉素作為內(nèi)標(biāo)，維吉尼亞霉素M1和維吉尼亞霉素S1使用利血平作為內(nèi)標(biāo)，此時5種肽類抗生素的回收率為90.0% ~ 110%，不僅降低了檢測成本，也能滿足定量需要。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)參考文獻［22－23］，對本方法涉及的豬肉中5種肽類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)（ME）進行考察。針對內(nèi)標(biāo)法及外標(biāo)法兩種定量方式均配制相同系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，即溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算公式為ME（%） = （Slopematrix/Slopesolvent?1） × 100，其中Slopematrix為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率，Slopesolvent為溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率，如果|ME| > 50，表明存在強基質(zhì)效應(yīng)；20 < |ME| < 50，表明存在弱基質(zhì)效應(yīng)；|ME| < 20，表明無基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明（見表2），除維吉尼亞霉素S1的基質(zhì)效應(yīng)較弱外，其他幾種組分在外標(biāo)法定量時均表現(xiàn)出強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，而使用內(nèi)標(biāo)法定量后基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯改善，因此本實驗選用內(nèi)標(biāo)法進行定量校正。

表2 5種肽類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)、線性方程、線性范圍、檢出限及定量下限Table 2 MEs，linear equations，linear ranges，LODs and LOQs of five peptide antibiotics

2.3.2 線性范圍、檢出限與定量下限本方法采用羅紅霉素作為達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素的內(nèi)標(biāo)，利血平作為維吉尼亞霉素M1和維吉尼亞霉素S1的內(nèi)標(biāo)，以待測物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比作為橫坐標(biāo)（x），以待測物及內(nèi)標(biāo)的峰面積比作為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對待測樣液進行定量分析。結(jié)果顯示，達托霉素在2 ~ 200 ng/mL范圍內(nèi)，萬古霉素及去甲萬古霉素在5 ~ 500 ng/mL范圍內(nèi)，維吉尼亞霉素M1及維吉尼亞霉素S1在1 ~ 100 ng/mL范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。于豬肉空白基質(zhì)溶液中添加不同水平的5種肽類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子的信噪比為3和10分別確定各物質(zhì)的檢出限（LOD）為3 ~ 7.5 μg/kg，定量下限（LOQ）為5 ~ 25 μg/kg（見表2）。

2.3.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差針對市購空白豬肉樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法考察3個不同加標(biāo)水平（25、50、250 μg/kg）下5種肽類抗生素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），每個水平進行6次重復(fù)實驗（n= 6）計算日內(nèi)精密度（Intra-RSD），對各加標(biāo)水平連續(xù)測定3 d（n= 18）計算日間精密度（Inter-RSD），結(jié)果見表3。3個加標(biāo)水平的平均回收率為80.2% ~ 102%，Intra-RSDs為1.3% ~ 7.4%，Inter-RSDs為2.6% ~8.5%，表明方法的重復(fù)性好，回收率佳。

表3 5種肽類抗生素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of five peptide antibiotics

2.4 實際樣品的檢測

采用本方法對30批市售豬肉樣品進行5種肽類抗生素的測定，其中1批檢測出維吉尼亞霉素M1，檢出值為68.5 μg/kg，其余29批未檢出以上肽類抗生素，圖4為陽性樣品的提取離子色譜圖（EIC）。

圖4 陽性豬肉樣品中維吉尼亞霉素M1的提取離子色譜圖Fig.4 EIC chromatogram of virginiamycin M1 in a positive pork sample

3 結(jié) 論

本文基于Captiva EMR－Lipid免活化固相萃取小柱，構(gòu)建了豬肉中達托霉素、萬古霉素、去甲萬古霉素、維吉尼亞霉素M1及維吉尼亞霉素S1 5種肽類抗生素的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法的樣品前處理簡便，回收率好，重復(fù)性佳，適用于豬肉中5種肽類抗生素的一針同時定性定量分析，尤其是彌補了當(dāng)前食品中達托霉素檢測技術(shù)的空白。利用構(gòu)建的方法對市售實際樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)1批檢出維吉尼亞霉素M1的陽性樣品。本方法的開發(fā)為豬肉中肽類抗生素的風(fēng)險監(jiān)測提供了技術(shù)支撐，也為其他動物源性食品基質(zhì)中相關(guān)肽類抗生素的檢測技術(shù)研發(fā)提供了思路。