嚴(yán)重少弱畸精子癥患者精液和睪丸中精子的ICSI臨床結(jié)局比較

邢鵬，袁博，王娜，李澎濤，殷晨星，李克用，孟娜娜

(1.保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，保定 071000)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)是治療男性因素不育癥最有效的方法[1]，其唯一的先決條件是每一枚成熟的卵母細(xì)胞中需要注射一條形態(tài)正常的活精子[2]。嚴(yán)重少弱畸精子癥(severe oligo-astheno-teratozoospermia，sOAT)是指2次及以上規(guī)范的精液分析顯示：0<精子濃度<1×106/ml[3]，前向運(yùn)動精子(PR)百分率<1%或前向運(yùn)動精子總數(shù)(total progressive motile sperm count，TPMSC)<100萬[4]，精子正常形態(tài)百分率≤1%[5]。隱匿精子癥(cryptozoospermia)屬特殊類型，即常規(guī)鏡檢未發(fā)現(xiàn)精子，離心后精液標(biāo)本中可發(fā)現(xiàn)精子。Palermo 等[6]最初聲稱，ICSI 成功率不受精子濃度、形態(tài)和活動性的影響。但是，此后越來越多的研究表明，注射一個完全不動的(并且可能是死的)精子會對ICSI的受精和臨床結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響[7-8]，且精子形態(tài)對ICSI的臨床妊娠率有顯著性的預(yù)測作用[9]。近年來，sOAT患者在經(jīng)歷了射精精子ICSI 失敗后，使用睪丸精子重復(fù) ICSI的研究逐漸增多[10-11]。但對于這些非無精子癥男性的ICSI助孕治療，睪丸精子的療效是否優(yōu)于射精精子仍然存在較大爭論[12-13]，這也給男科臨床醫(yī)生向患者推薦最優(yōu)的治療方法帶來了困擾。本研究選取因男性sOAT在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科行ICSI助孕的患者，分析采用射精精子和睪丸精子患者的實(shí)驗(yàn)室和臨床指標(biāo)差異，探討睪丸取精能否改善sOAT患者的ICSI助孕結(jié)局。

資料與方法

一、研究對象和分組

本研究采用回顧性研究。選擇2016年1月至2020年6月期間，在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科因男方sOAT在不同周期分別用射出精子和睪丸精子抽吸術(shù)(testicular sperm aspiration，TESA)行ICSI助孕的患者為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男方：0<精子濃度<1×106/ml或PR<1%或TPMSC<100萬，精子正常形態(tài)百分率≤1%；(2)女方年齡≤38歲且抗苗勒管激素(AMH)>1 ng/ml；(3)女方成熟卵(MⅡ)獲卵數(shù)≥7枚。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)逆行射精；(2)完全圓頭精子癥、無頭精子癥、大頭精子癥及精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常[14]；(3)夫妻任何一方存在染色體核型異常；(4)女方卵巢低反應(yīng)[15]；(5)女方子宮內(nèi)膜異位癥及其他卵巢囊性腫物者。

根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終58對夫婦符合研究標(biāo)準(zhǔn)，共接受了98個ICSI周期治療。按照獲取精子的方式不同，將患者分為2組：射出精子ICSI組(E-ICSI組，56個周期)和睪丸精子ICSI組(T-ICSI組，42個周期)。本研究獲得保定市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、ICSI治療過程

1.控制性卵巢刺激(COS)及卵母細(xì)胞收集：采用卵泡期長效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)(亮丙瑞林，上海麗珠)方案或促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant)(西曲瑞克，默克雪蘭諾，法國)方案進(jìn)行COS。當(dāng)至少1枚優(yōu)勢卵泡直徑≥20 mm或3枚卵泡直徑≥18 mm時，行人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)扳機(jī)。36 h后行陰道超聲下取卵(OPU)，取卵術(shù)后常規(guī)給予黃體支持。

2.精子收集及制備：采用2種取精方式收集精子。(1)射出精子：患者禁欲3～7 d，OPU當(dāng)日，采用手淫的方式留取精液。(2)睪丸取精，分兩種情況：①OPU日自然排精后，未找到可用的精子，選擇TESA方式抽取曲細(xì)精管；②經(jīng)歷過射出精子-ICSI失敗的患者，本周期OPU日直接選擇TESA。留取少量曲細(xì)精管于G-Mops液中，立即送胚胎實(shí)驗(yàn)室，1 ml注射器針頭撕碎后鏡檢，可見形態(tài)正常的活動精子，取精結(jié)束。

采用mini-SpermGrad單層梯度法處理，即用45%的SpermGrad 0.2～0.3 ml做1個單層梯度。射出精子簡單洗滌后，留取少量沉淀重懸后置于梯度上層；睪丸取精者將撕碎后的曲細(xì)精管混懸液置于梯度上層。200g離心10 min，剩余沉淀約0.05 ml，混勻后置于6%CO2培養(yǎng)箱準(zhǔn)備授精。

3.ICSI及胚胎評估：將在 6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，拆除顆粒細(xì)胞。觀察卵周間隙見第一極體(PB1)提示卵母細(xì)胞核成熟(MⅡ)，進(jìn)行ICSI。顯微注射后16～20 h時觀察受精情況，根據(jù)有無兩個原核(2PN)及兩個極體(2PB)出現(xiàn)來判斷是否受精。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會(CSRM)實(shí)驗(yàn)室操作專家共識進(jìn)行胚胎評估[16]。

4.胚胎移植及妊娠結(jié)局：新鮮胚胎移植選擇1～2枚3級以上D3期胚胎進(jìn)行移植，其余胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，達(dá)到冷凍標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行冷凍。凍融胚胎移植采用人工周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備，所有操作均按科室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(SOP)進(jìn)行，常規(guī)進(jìn)行黃體支持。胚胎移植后14 d血β-HCG值超過20～50 U/L為HCG陽性。妊娠7周B超下見宮內(nèi)孕囊為臨床妊娠。確認(rèn)妊娠后，孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)(生化妊娠除外)為早期流產(chǎn)。

三、觀察指標(biāo)

1.患者基本資料：包括不孕時間、不孕類型、雙方年齡、卵泡刺激素(FSH)、女方體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AMH及男方睪丸體積(采用Prader睪丸模型測量)。

2.臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：包括COH方案、促性腺激素(Gn)使用時間、Gn用量、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN受精率、卵裂胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎數(shù)和卵母細(xì)胞利用率。

3.結(jié)局指標(biāo)：無可移植胚胎周期率=無可移植胚胎周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%；全胚冷凍周期率=全胚冷凍周期數(shù)/有可移植胚胎的周期數(shù)(治療周期數(shù)-取消周期數(shù)-無可移植胚胎周期數(shù))×100%；新鮮移植周期臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/新鮮移植周期數(shù)×100%；新鮮移植周期流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/新鮮移植周期妊娠數(shù)×100%；凍胚移植周期臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/凍胚移植周期數(shù)×100%；一次 COS 累積活產(chǎn)率=獲得活產(chǎn)的患者數(shù)/一次 COS 患者數(shù)×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；出生性別比(出生男嬰或女嬰人數(shù)/出生總?cè)藬?shù)×100%)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本資料

本研究共納入58對男性sOAT的患者夫婦，他們共接受了98個ICSI周期，每對夫婦接受了1～4周期ICSI治療，其中56個周期(57.14%)使用射精精子，42個周期(42.86%)使用睪丸精子。

兩組患者的不孕年限、不孕類型，女方年齡、BMI和AMH水平，男方年齡、FSH和睪丸體積，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料比較[(-±s)，M(P25，P75)，n(%)]

二、患者的促排卵、受精及胚胎發(fā)育情況

兩組患者的促排卵方案、Gn使用天數(shù)、Gn用量、HCG日E2及P水平、獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、2PN受精數(shù)及受精率、卵裂胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎數(shù)和卵母細(xì)胞利用率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者促排卵、受精及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s)，M(P25，P75)，%]

三、臨床結(jié)局

兩組患者新鮮胚胎移植周期取消率、新鮮胚胎移植周期臨床妊娠率、凍融胚胎移植周期臨床妊娠率、流產(chǎn)率、一次 COS 累積活產(chǎn)率、多胎妊娠率及出生性別比的組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者臨床結(jié)局比較(%)

討 論

臨床上，sOAT(包含隱匿精子癥)并不罕見，一般表現(xiàn)為FSH水平增高、睪丸萎縮和不育。雖然已經(jīng)報道了多種病因，如染色體異常、生殖系統(tǒng)感染、精索靜脈曲張、吸煙和過量飲酒等，但這些男性中的大多數(shù)人都很健康，很少能明確精子發(fā)生受損的原因[17]。本研究中的研究對象排除了染色體異常人群，2例反復(fù)受精失敗的患者進(jìn)行了男性不育基因高通量測序(NGS) panel檢測(具體操作參照之前文獻(xiàn)[18])，但均未發(fā)現(xiàn)異常，最終這2對夫婦在醫(yī)生的建議下考慮供精人工授精(AID)治療。2例患者曾患腮腺炎性睪丸炎致一側(cè)睪丸萎縮。所有患者無Ⅲ°精索靜脈曲張，輕、中度的精索靜脈曲張未行手術(shù)治療。目前除了低促性腺激素性性腺功能減退癥，sOAT尚無具有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的藥物治療，尿促性素(HMG)/FSH[19]和雌激素受體調(diào)節(jié)劑[20]顯示出一些積極的治療效果。此外，縮短禁欲時間可能會提升sOAT患者的妊娠率[21]。

目前，精液嚴(yán)重異?；颊叩纳渚雍筒G丸精子，與胚胎發(fā)育以及臨床結(jié)局之間的關(guān)系仍然存在爭議。Kahraman 等[22]在 1996年首次報道了完全不動精子和初始不動精子，且同時伴有嚴(yán)重畸形精子的男性，使用睪丸精子進(jìn)行 ICSI獲得臨床妊娠，結(jié)果表明，在這些夫婦中，睪丸精子組和射精精子組的受精率及卵裂率均無顯著性差異，但睪丸精子的妊娠結(jié)局優(yōu)于射精精子。Weissman等[23]報告了4例患者，他們在使用射出精子反復(fù)植入失敗后，改用睪丸精子進(jìn)行 ICSI 獲得了妊娠和活產(chǎn)。此后，又有不同的研究得出了睪丸精子妊娠結(jié)局優(yōu)于射精精子的結(jié)論[24-25]。分析原因，可能是睪丸精子中DNA損傷程度較低[26]，而射精精子的DNA碎片指數(shù)(DFI)增加導(dǎo)致精子凋亡(但能運(yùn)動且仍然存活)[27]。

本研究對我院因男方sOAT接受ICSI助孕的患者資料進(jìn)行了回顧性分析。結(jié)果表明，睪丸精子ICSI組較射出精子ICSI組，雖然具有更低的周期取消率(11.9% vs. 21.4%)，更高的臨床妊娠率(新鮮周期27.0% vs. 22.7%，F(xiàn)ET周期66.7% vs.35.7%)和累積活產(chǎn)率(40.5% vs.25.0%)，但是組間差異尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。一項(xiàng)包括了五項(xiàng)隊(duì)列研究的Meta分析顯示，隱匿精子癥的男性，射出精子和睪丸精子ICSI的受精率和臨床結(jié)局均無顯著性差異，不支持優(yōu)先使用睪丸精子ICSI[28]。Al-Malki等[11]評估了一組嚴(yán)重或完全弱精子癥的不育夫婦接受TESA-ICSI的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與射精精子ICSI組比較，TESA組的受精率顯著降低，但每次胚胎移植的臨床妊娠率并沒有顯著差異。Gilman等[12]研究了在卵巢反應(yīng)差和既往 ART 失敗史的女性使用射精精子和睪丸精子行ICSI的臨床結(jié)局差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與射精精子組相比，睪丸精子組的囊胚形成率更高，但是臨床結(jié)局相似，表明睪丸取精并沒有為患者帶來益處。Inal等[29]同樣認(rèn)為射精和手術(shù)取精的圍產(chǎn)期結(jié)局沒有顯著差異，睪丸取精手術(shù)卻會導(dǎo)致如血腫、感染、疼痛、睪酮水平的變化等不良反應(yīng)，因此建議在可行的情況下，應(yīng)優(yōu)先使用射精精子，而不是睪丸取精。本研究的結(jié)果與這些研究基本一致。

本研究存在一些局限性。首先，因?yàn)榧{入患者的活動精子和/或總精子數(shù)量極低，絕大多數(shù)患者未達(dá)到精子DFI檢測標(biāo)準(zhǔn)而未評估。DFI的檢測是將精子染色后觀察，很難確定DFI正常的精子是否是為數(shù)不多的幾個形態(tài)正常的活精子，從而降低了DFI檢測在sOAT患者中的應(yīng)用。其次，受我院sOAT患者人數(shù)的限制，本研究的樣本量相對較小，結(jié)果可能存在一定的偏倚性，需要通過進(jìn)一步積累患者，或開展多中心的前瞻性合作來更新研究結(jié)果。

綜上所述，基于本研究的結(jié)果，sOAT患者睪丸精子較射出精子并沒有改善ICSI妊娠結(jié)局，暫不推薦sOAT患者直接選擇睪丸精子進(jìn)行ICSI。只有當(dāng)射出精液離心后未發(fā)現(xiàn)正常形態(tài)活精子的情況下，再選擇睪丸精子作為繼續(xù)ICSI的補(bǔ)救性手段。