青錢柳生長素響應(yīng)因子CpARF2L的克隆與分析

徐謙， 王櫻穎， 陳穎博

(溫州科技職業(yè)學(xué)院溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙南作物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室溫州特色作物生物技術(shù)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325006)

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]，又名青錢李、搖錢樹，為胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)的單屬單種喬木[1]。青錢柳在我國江西、湖南、浙江等省海拔420～2 500 m的山地上有較廣泛分布[2]，其樹葉因富含黃酮、三萜、多糖等多種有生理活性的次生代謝產(chǎn)物而具有抗腫瘤、抗過敏、降三高等功效[3-5]，被廣泛用于制作保健茶。青錢柳葉片作為生產(chǎn)原料需求極大，但由于其無性生殖技術(shù)缺乏突破，而有性生殖存在結(jié)實(shí)率低、空粒率高現(xiàn)象，葉片生產(chǎn)難以滿足市場需求[6-7]。目前，圍繞青錢柳栽培、繁殖、采摘、化學(xué)成分、藥理作用、產(chǎn)業(yè)發(fā)展等已有大量研究，但分子水平上的研究較少。

生長素在植物中最主要的成分為吲哚乙酸(IAA)，是發(fā)現(xiàn)的第1種促進(jìn)植物生長的植物激素。生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)控制著植物各器官和組織對生長素的反應(yīng)，對植物生長的調(diào)控起重要作用。生長素響應(yīng)因子(ARF)是生長素信號途徑的重要組成部分之一，能夠與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)原件(AuxRE)TGTCTC序列進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。

近年來，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄信息的不斷完善，越來越多的植物物種ARF被研究，包括擬南芥[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、玉米(Zeamays)[10]、大麥(Hordeumvulgare)[11]和番茄(Solanumlycopersicum)[12]等作物以及蘋果(Malusdomestica)[13]、甜橙(Citrussinensis)[14]、葡萄(Vitisvinifera)[15]、毛果楊(Populustrichocarpa)[16]和巨桉(Eucalyptusgrandis)[17]等木本植物。ARF2是ARF家族中的一員，大量研究表明，ARF2在植物的細(xì)胞分裂、莖和葉的生長、開花與花期、葉片與花的衰老、脫落以及果實(shí)與種子發(fā)育進(jìn)程中起重要作用[8,18-21]。青錢柳ARF家族基因的研究，對解析生長素在青錢柳葉片發(fā)育和衰老中的作用具有重要意義。

本研究根據(jù)已報(bào)道ARF2基因保守序列設(shè)計(jì)簡并引物克隆青錢柳ARF2核心序列，進(jìn)而采用cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)獲得cDNA全長，并進(jìn)行序列測定。利用生物信息學(xué)軟件分析基因保守結(jié)構(gòu)域及序列特征，并用MEGA軟件將其氨基酸序列與其他物種的ARF2氨基酸序列進(jìn)行了聚類分析。同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了該基因在青錢柳幼苗不同組織中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究青錢柳生長發(fā)育提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖南張家界種源青錢柳為實(shí)驗(yàn)材料，已完成破除休眠處理的青錢柳種子購自張家界宏泰生態(tài)種苗有限公司，于光照培養(yǎng)箱中(光照25 ℃ 12 h/黑暗16 ℃ 12 h)萌發(fā)生長至3～5片真葉，按根、莖、子葉、展開的葉片和未展開的葉片5個(gè)部分取樣。取樣后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。

植物基因組DNA提取試劑盒、植物RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司；Clontech SMARTer RACE 5′/3′ Kit、LA Taq DNA聚合酶購自TaKaRa；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit克隆試劑盒、Fast-T1感受態(tài)細(xì)胞、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。引物由華大基因合成。

1.2 DNA、RNA提取與基因克隆

按照試劑盒方法要求，提取DNA和RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

參照擬南芥、楊樹和其他木本植物中已知的ARF2基因cDNA序列及其編碼氨基酸序列的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增青錢柳ARF2核心序列(表1)。目標(biāo)基因的擴(kuò)增體系為20 μL，包括5×Buffer 4 μL，2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，上下游引物各0.5 μL(10 mmol·L-1)，1 μL cDNA。程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃高溫變性15 s，52～62 ℃低溫退火30 s，72 ℃中溫延伸2 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目標(biāo)片段回收純化，連接克隆載體，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選陽性克隆送華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫比對。

表1 引物序列及用途

根據(jù)前述獲得的青錢柳ARF2核心序列，設(shè)計(jì)RACE引物(表1)。根據(jù)Smart?RACE方法所述，各取0.5 μg RNA分別用于5′-RACE和3′-RACE的第一鏈DNA。隨后分別進(jìn)行末端擴(kuò)增，其中5′-RACE進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，第1輪的程序?yàn)?4 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；第2輪巢式擴(kuò)增以第1輪產(chǎn)物稀釋50倍為模板，程序?yàn)?4 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)。而3′-RACE的程序同5′-RACE第1輪擴(kuò)增。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。切膠，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，隨機(jī)挑選多個(gè)陽性菌株送華大基因測序。

1.3 基因序列分析

測序結(jié)果的核苷酸序列用DNAMAN(5.2.2)等軟件進(jìn)行分析，利用在線軟件ProtParam進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分析；利用Pfam 26.0(http://pfam.sanger.ac.uk/)和Conserved Domains Database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進(jìn)行蛋白保守域分析；利用Cello(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行CpARF2L蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測；將獲得的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，用DNAMAN將其與其他ARF2蛋白序列進(jìn)行同源比對。利用MEGA 6.06軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，并生成報(bào)告圖形。

1.4 CpARF2L基因的表達(dá)分析

以18S rRNA為內(nèi)參基因[22]，對克隆的基因在青錢柳不同部位的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。qRT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，2.0 μL模板，10 μmol·L-1的上下游引物(表1)各0.4 μL，用水補(bǔ)充體積至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃，1 min(40個(gè)循環(huán))。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpARF2基因的克隆

以青錢柳葉片提取的基因組DNA為模板，利用簡并引物對ARF2基因保守區(qū)序列進(jìn)行克隆，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。所得目標(biāo)帶回收純化后連接載體測序檢測，結(jié)果與NCBI上公布的胡桃ARF2b-like基因序列(LOC109000359)相似度最高。進(jìn)而采用RACE技術(shù)對基因全長進(jìn)行克隆(圖1)，獲得的5′-RACE擴(kuò)增片段長度約2 100 bp，3′-RACE擴(kuò)增片段長度約1 200 bp，測序后再用兩端引物擴(kuò)增全長(圖2)。測序結(jié)果表明，該基因全長3 381 bp，編碼區(qū)(CDS)序列為430～2 988 bp，編碼853個(gè)氨基酸。將該基因命名為CpARF2L(GenBank登錄號：OM417077)。

圖2 CpARF2L全長擴(kuò)增結(jié)果

2.2 理化性質(zhì)分析

ProtParam分析得知，CpARF2L由853個(gè)氨基酸組成，分子式為C4 150H6 470N1 172O1 283S37，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量94 496.33 ku，理論等電點(diǎn)為5.76，不穩(wěn)定系數(shù)為50.73，為不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽中蘇氨酸(Ser)含量最高，占總氨基酸的9.0%，其次為賴氨酸(Leu)，約為8.1%?？偸杷骄禂?shù)(GRAVY)為-0.538，親水性氨基酸比例較高，與ProtScale分析結(jié)果具有一致性，可知CpARF2L蛋白為親水性蛋白(圖3)。

圖3 基因編碼蛋白的親疏水性預(yù)測

2.3 結(jié)構(gòu)域分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測

對推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，150～252位氨基酸為一個(gè)B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，276～358位氨基酸為生長素應(yīng)答因子功能結(jié)構(gòu)域(auxin_resp domian)，693～815位氨基酸為C端二聚化結(jié)構(gòu)域，726～810位氨基酸為一個(gè)PB1(phox and bem1 domain)結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白屬于ARF家族。Cello分析結(jié)果表明，CpARF2L蛋白定位于細(xì)胞核(表2)，這與其能夠作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用一致。

表2 CpARF2蛋白的亞細(xì)胞定位分析

2.4 CpARF2L氨基酸序列及聚類分析

在GenBank中，青錢柳CpARF2L的氨基酸序列與眾多木本植物ARF2蛋白序列相似度較高，如胡桃(Juglansregia)XP_018832743.1、XP_04 0989248.1、德克薩斯州黑核桃和核桃的雜交種(Juglansmicrocarpa×Juglansregia)XP_040989248.1、黃麻(Corchoruscapsularis)OMO94698.1、長蒴黃麻(Corchorusolitorius)OMO52358.1、山豆麻(Parasponiaandersonii)PON67232.1、哥倫比亞錦葵(Herraniaumbratica)XP_021285529.1、楊梅(Morellarubra)KAB1217527.1、桃(Prunuspersica)XP_007210 901.1、大葉櫟(Quercuslobata)XP_030937 676.1、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)XP_02387 7758.1、葡萄(Vitisvinifera)RVX17993.1、木薯(Manihotesculenta)XP_021617041.1、甜櫻桃(Prunusavium)XP_021814726.1、河岸葡萄(Vitisriparia)XP_034672940.1、麻瘋樹(Jatrophacurcas)XP_037495613.1、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)XP_021643647.1、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)XP_038709229.1和可可樹(Theobromacacao)EOY22619.1。將青錢柳CpARF2L與這些已知ARF2蛋白進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明，不同物種間的ARF2結(jié)構(gòu)域具有高度相似性。家族進(jìn)化關(guān)系分析表明，青錢柳CpARF2L與胡桃ARF2B-like蛋白的進(jìn)化關(guān)系最近(圖4)。

圖4 青錢柳CpARF2L系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

2.5 CpARF2L基因在青錢柳不同組織中的表達(dá)分析

通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，CpARF2L在青錢柳幼苗的各組織中均有表達(dá)，但相對表達(dá)量存在顯著性差異(圖5)，其中在展開的葉片中表達(dá)量最高，其次是未展開的葉片和根中。推測CpARF2L基因在青錢柳幼苗期不同組織中有不同的調(diào)控功能。

圖5 青錢柳CpARF2L基因在青錢柳不同組織中的表達(dá)情況

3 小結(jié)與討論

本研究克隆了青錢柳生長素響應(yīng)因子CpARF2L基因，并對其結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進(jìn)化、葉細(xì)胞定位預(yù)測及表達(dá)模式進(jìn)行了分析。為后繼研究青錢柳CpARF2L的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

典型的ARF蛋白具有保守的N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)、C端二聚體結(jié)構(gòu)域(CTD)和中間非保守結(jié)構(gòu)域(MR)[23]。結(jié)構(gòu)域分析表明，青錢柳CpARF2L符合ARF蛋白典型結(jié)構(gòu)，在DBD區(qū)含有B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Auxin_response factor結(jié)構(gòu)域2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，在CTD區(qū)有AUX_IAA family結(jié)構(gòu)域，屬于ARF家族基因的同源基因，具有ARF基因家族的生物學(xué)功能。ARF與AuxRE正是通過B3 DNA識別而結(jié)合，C-端的AUX_IAA family結(jié)構(gòu)域?qū)RF的功能也發(fā)揮重要的作用，其可以形成ARF-ARF、ARF-Aux/IAA二聚體互作，在低的生長素(Auxin)水平時(shí)，Aux/IAA、協(xié)同抑制子TOPLESS(TPL)和ARF蛋白結(jié)合，抑制生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；而在高生長素水平時(shí)，Aux/IAA和SCFTIR1/AFB形成復(fù)合子，被26S蛋白酶降解，ARF蛋白被釋放從而調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)[24]。

研究表明，MR中間結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成在一定程度上決定ARF的生物學(xué)功能，中間區(qū)域富含谷氨酰胺、絲氨酸和亮氨酸，起轉(zhuǎn)錄激活作用；若富含谷氨酰胺則起轉(zhuǎn)錄抑制作用[25]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，CpARF2L的MR中間結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，由此推測CpARF2L可能是轉(zhuǎn)錄抑制子，這與擬南芥ARF2的研究結(jié)果一致[19]。前人的研究[26]結(jié)果表明，ARF2是植物地上部分組織器官細(xì)胞分裂的抑制子，可能通過負(fù)調(diào)節(jié)與細(xì)胞生長和衰老相關(guān)的信號通路下游的基因來實(shí)現(xiàn)，我們的推測與他人在其他作物中的研究結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，CpARF2定位于細(xì)胞核，這也與擬南芥AtARF2亞細(xì)胞定位的結(jié)果一致[19]。

前人研究[27-29]表明，ARF2參與植物的多個(gè)生長發(fā)育過程，ARF2突變能引起生長素相關(guān)的多效性表型變化。如擬南芥arf2突變體表現(xiàn)多種表型，包括開花期延遲、蓮座葉變大、育性改變、花器官脫落、角果開裂延遲、種子大小與質(zhì)量增加等[8,18-20]；ARF2通過增加IAA敏感性來降低IAA信號的抑制，從而延遲擬南芥葉片的衰老，具有正調(diào)節(jié)葉片衰老的作用[21]。此外，ARF2屬于組成型表達(dá)基因，在大部分組織器官中均有表達(dá)，如番茄SlARF2在所有組織中均表達(dá)，但花中表達(dá)量最高，其轉(zhuǎn)錄水平受IAA、乙烯和赤霉素的調(diào)控[30]；姜倩倩等[31]的研究結(jié)果也同樣表明,平邑甜茶MhARF2為組成型表達(dá)，且在葉片中的表達(dá)量最高，根次之；MaARF2在巴西蕉中也為組成型表達(dá)，表達(dá)水平順序依次為葉>根>莖>花>果實(shí)[32]。本研究qRT-PCR分析結(jié)果表明，CpARF2L在青錢柳幼苗的葉、根、莖中也均有表達(dá)，且在葉片中表達(dá)量最高，根次之，這表明CpARF2L同樣具有組成型表達(dá)的特點(diǎn)，暗示其廣泛參與青錢柳幼苗期各器官生長發(fā)育、形態(tài)建成等的重要生物學(xué)功能。