黏玉米谷氨酰胺酶的酵母表達(dá)及其對乳蛋白的作用

韓秀娥，秦蘭霞，任浩威

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（TGase）能催化蛋白質(zhì)與多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基與一級氨基之間的酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即催化蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)[1-7]。 TGase 作用的底物包括乳清蛋白、麥胚蛋白、大豆蛋白、牛肌球蛋白和家禽肌動球蛋白等[7-20]。在乳制品中，其能提高奶酪的產(chǎn)量、酸奶的品質(zhì)；在肉制品和魚制品中，可以改善產(chǎn)品的外觀和質(zhì)構(gòu)；并通過引入賴氨酸提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，使蛋白類食品在營養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)、外觀和風(fēng)味等方面得到改善，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的對食品的口感、風(fēng)味和營養(yǎng)的需求[21-29]。 隨著食品工業(yè)的蓬勃發(fā)展，對食品添加劑的需求量也逐年增加，而谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶是蛋白質(zhì)，作為食品添加劑可以直接被人體消化吸收，與其它人工合成添加劑相比，具有無法比擬的優(yōu)越性[29-35]。 本文研究的TGase，是理想的天然食品添加劑，可以替代目前使用的人工食品添加劑。目前，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在中國食品工業(yè)中還沒有得到廣泛應(yīng)用，主要是由于產(chǎn)量與來源受限，不能滿足市場需求。 急需獲得1 株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的菌株。

本研究目的是利用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)和手段，克隆玉米氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因，將其連接入畢赤酵母表達(dá)載體，并在酵母中表達(dá)，篩選獲得高產(chǎn)菌株，并對酶的生物功能特性進(jìn)行研究。采用酶技術(shù)來改善傳統(tǒng)蛋白食品的功能特性和營養(yǎng)特性，具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?這是因?yàn)槊阜磻?yīng)專一，條件溫和，易于控制，越來越受到食品領(lǐng)域的重視。應(yīng)用生物酶制劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的生物改性，提高食品的營養(yǎng)、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味，是未來發(fā)展趨勢。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115 和質(zhì)粒酵母表達(dá)載體pPIC9K-TGase 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；酵母基因組DNA 提取試劑盒，TIANGEN（中國）；ExTaq DNA 聚合酶、EcoR I、Not I、Sac I，中國大連TaKaRa 公司。胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID 公司（英國）；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），中國上海華舜生物工程有限公司；N'N'亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Tris-Base、四甲基已二銨（TEMED）、二硫蘇糖醇（DTT）、過硫酸銨（APS）、甘氨酸、酵母氮源培養(yǎng)基（YNB），GIBCO 公司（美國）；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)ermentas；TritonX-100、EB（溴化乙錠），Sigma 公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的PCR 鑒定 以質(zhì) 粒pPIC9K -TGase，以上游引物：5' -ATC GAATTCATGGCTCATCGTGGACATCTAGA-3' 和下游引物 ：5' -GTCAGCGGCCGCGATTTCAC CATATTTGTCTGC-3'為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為1 630 bp。 使用高保真的ExTaq DNA聚合酶，進(jìn)行PCR。條件為：94 ℃2 min，94 ℃35 s，62 ℃40 s，72 ℃100 s，29 個循環(huán)；72 ℃ 延伸11 min。 反應(yīng)結(jié)束，用1%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.2 質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的雙酶切鑒定 用EcoR I 和Not I 雙酶切質(zhì)粒pPIC9K-TGase。 酶切反應(yīng)條件：37 ℃酶切2 h。反應(yīng)結(jié)束后，取酶切產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈光下觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.2.3 質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的線性化及電轉(zhuǎn)化 將經(jīng)酶切、PCR 鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KTGase，用Sac I 進(jìn)行單酶切線性化反應(yīng)。 然后，將線性化產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞畢赤酵母GS115中。 取轉(zhuǎn)化物均勻涂布于含100 μg/mL 博萊霉素（Zeocin）的YPDS 選擇平板上。

1.2.4 粘玉米TGase 基因在酵母中的表達(dá) 接種一單菌落到25 mL 的BMGY 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到OD600nm=2～6；離心（12 000 r/min，10 min），收集細(xì)胞，移入BMMY 培養(yǎng)基中，置28 ℃遙床培養(yǎng)；每24 h 向培養(yǎng)基中添加100%甲醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)0.5%； 每隔一段時間取樣1 mL 分析表達(dá)水平，以確定最佳誘導(dǎo)時間。取樣時間點(diǎn)為（h）：0，24（1 d），48（2 d），72（3 d），96（4 d）；在樣品中加入100 μL ddH2O，混勻并加入25 μL 5×SDS 凝膠加樣緩沖液，混合20 s。 樣品經(jīng)沸水浴處理后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.5 酵母表達(dá)產(chǎn)物的純化 將酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)液（BMMY）4℃10 000 r/min 離心10 min，將上清液上樣于經(jīng)50 mmol/L，pH 5.0 磷酸鈉緩沖液預(yù)平衡的SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換層析柱，然后以含0.2 mol/L 氯化鈉的0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鈉緩沖液梯度洗脫，收集含目的蛋白的洗脫液，凝膠過濾后，收集到的活性峰溶液較稀，離子強(qiáng)度大，需經(jīng)過濃縮和透析，經(jīng)0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鈉緩沖液透析后，采用陽離子交換柱HiPrep16/10 純化，平衡緩沖液為0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鈉緩沖液，上樣結(jié)束后用平衡液洗至基線，進(jìn)行氯化鈉梯度洗脫，以含0.2 mol/L 氯化鈉的0.02 mol/L pH 6.5 的磷酸鈉緩沖液梯度洗脫。收集含目的蛋白的洗脫峰。 以考馬斯亮藍(lán)染色法對純化后的目的蛋白進(jìn)行濃度測定，SDS-PAGE電泳。

1.2.6 酵母表達(dá)的TGase 對酪蛋白的改性 取0.2%（體積分?jǐn)?shù)）pH 6.5 的酪蛋白溶液2 mL，純化的TGase 酵母表達(dá)蛋白濃縮液2 mL，于37 ℃反應(yīng)2.0 h，取60 μL 反應(yīng)液，加入等體積的2×SDS 樣品緩沖液，沸水浴6 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。

1.2.7 酵母表達(dá)的TGase 對酸奶超微結(jié)構(gòu)的改變

酵母表達(dá)的TGase 按一定比例加入酸奶中，以不加TGase 為對照，于43 ℃恒溫箱中進(jìn)行保溫發(fā)酵，大約2.5 h 后，pH 值達(dá)到4.7 左右時，停止發(fā)酵，在4 ℃冰箱中貯存待用。 然后，按要求制作電鏡樣品，在掃描電鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的雙酶切鑒定

將pPIC9K-TGase 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒用EcoR I 和Not I 雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖1 所示。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pPIC9K-TGase by double digestion

2.2 重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的PCR 鑒定

以質(zhì)粒pPIC9K-TGase 為模板，以TGase-up和TGase-down 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖2，擴(kuò)增的DNA 條帶大小約為1 630 bp，與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，目的基因已插入到表達(dá)載體pPIC9K 中。

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 的PCR 鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pPIC9K-TGase

2.3 重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

與對照組比較，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)上清液在分子質(zhì)量約60 ku 處，有明顯特征性條帶出現(xiàn)（圖3中箭頭所示），與預(yù)期的TGase 分子質(zhì)量大小相符，表明TGase 蛋白在酵母中得到表達(dá)。通過對蛋白濃度計算，培養(yǎng)基中目的蛋白表達(dá)量為85 mg/L，酶活為6.5 U/mL。

圖3 酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)上清SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of yeast transformant expressing supernatant

2.4 重組蛋白的純化

酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 表達(dá)的上清，經(jīng)SP Sepharose Fast Flow 陽離子交換層析柱，陽離子交換柱HiPrep16/10 純化后，上樣于聚丙烯凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)果見圖4。酵母工程菌GS115/pPIC9k-TGase 培養(yǎng)液上清，經(jīng)凝膠過柱后，可以得到純化蛋白。 經(jīng)薄層掃描分析，純化蛋白的純度可達(dá)85%。

圖4 純化蛋白的SDS-PAGE 電泳Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of purified proteins

2.5 畢赤酵母表達(dá)的TGase 對酪蛋白的改性

畢赤酵母表達(dá)的TGase 對酪蛋白具有很強(qiáng)的聚合作用，使酪蛋白交聯(lián)成較大的聚合物，很大部分聚集在濃縮膠和分離膠的界面，小部分形成了不同分子質(zhì)量的蛋白聚合物，分布在分子質(zhì)量在45 ku 以上，結(jié)果見圖5。

圖5 酵母表達(dá)的TGase 催化酪蛋白聚合反應(yīng)Fig.5 Casein polymerization catalyzed by TGase expressed by yeast

2.6 畢赤酵母表達(dá)的TGase 對酸奶超微結(jié)構(gòu)的改變

將酵母表達(dá)的TGase 加入酸奶中，酸奶樣品經(jīng)處理后，放于掃描電鏡下觀察。 結(jié)果見圖6a 和圖6b，放大倍數(shù)為5 000 倍。由圖6a 可知，沒有加酶的酸奶形成大孔徑的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是由變性的酪蛋白微粒以叢狀、 鏈狀連接在一起堆積而成，這些微孔的直徑一般在9 μm 以上；圖6b 可見，添加酵母表達(dá)的TGase，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得較致密，空隙直徑在3 μm 左右。

圖6 酸奶的超微結(jié)構(gòu)Fig.6 Ultrastructure of yogurt

3 結(jié)論

本研究將前期已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPIC9K-TGase 經(jīng)雙酶切及PCR 鑒定正確后，Sac I 線性化處理，電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115，利用1%（體積分?jǐn)?shù)） 甲醇誘導(dǎo)其分泌表達(dá)。 SDSPAGE 電泳可檢測到特異的蛋白帶。 通過對蛋白濃度的計算，培養(yǎng)基中目的蛋白表達(dá)量為85 mg/L，酶活為6.5 U/mL。通過酪蛋白改性試驗(yàn)證明：畢赤酵母表達(dá)的TGase，都能使酪蛋白聚合生成不同分子質(zhì)量的聚合物；通過掃描電鏡觀察：添加酵母表達(dá)TGase 的酸奶凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得較致密，孔隙也變得較小。