2型固有淋巴細胞及其相關(guān)因子在支氣管肺發(fā)育不良中的變化及意義

王倩文 朱玥 王秋霞 盧紅艷

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是胎齡<32周早產(chǎn)兒常見的慢性肺疾病，治療難度大，死亡風(fēng)險高，部分甚至影響兒童肺功能［1-3］。隨著新生兒重癥監(jiān)護技術(shù)不斷提高，極低、超低出生體重兒存活率上升，BPD發(fā)生率呈上升趨勢。因此，對BPD的早期預(yù)警及防治刻不容緩。

肺泡-毛細血管屏障的完整性對維持正常血氧至關(guān)重要，出生后肺的免疫環(huán)境及先天免疫信號如何影響早期肺泡發(fā)育尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，出生后肺的膨脹與肺泡Ⅱ型上皮細胞（type Ⅱalveolar epithelial cell，AECⅡ）上調(diào)白細胞介素（interleukin，IL） -33有關(guān)［4］。AECⅡ在出生后分泌IL-33，肺內(nèi)IL-33迅速增加，導(dǎo)致2型固有淋巴細胞（group 2 innate lymphoid cell，ILC2）活化和增殖，在生后早期塑造肺內(nèi)2型免疫環(huán)境［5］。ILC2作為固有淋巴細胞的一種，主要聚居于肺黏膜等組織。出生后早期產(chǎn)生的ILC2構(gòu)成了成年小鼠肺組織中總ILC2的大部分［6］，這提示新生兒期是ILC2發(fā)育的關(guān)鍵時期。病理情況下，氣道受到外界因素刺激，過度活化的ILC2分泌大量IL-5和IL-13，增強Th2免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肺損傷［7］。目前發(fā)現(xiàn)，IL-33、IL-25及胸腺基質(zhì)淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）均可作為ILC2上游激活因子［8］。IL-33作為一種膜相關(guān)的促炎細胞因子，在內(nèi)皮和上皮損傷、細胞凋亡和壞死方面起警報作用［9］。IL-25通過增強氣道平滑肌細胞的增殖活性引起氣道重塑［10］。TSLP可引起呼吸道Th2免疫反應(yīng)，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道重塑［11］。動物實驗發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的BPD小鼠肺組織ILC2及IL-33明顯增加［12］；臨床研究發(fā)現(xiàn)，生后1 d、14 d及28 d血清IL-33升高與BPD發(fā)生及嚴重程度密切相關(guān)［13］，臍血 IL-33 不能預(yù)測BPD 發(fā)生［9］，然而 7 d IL-33水平與BPD的關(guān)系、ILC2和其他相關(guān)細胞因子在BPD患兒中的變化及意義尚未有研究。本研究通過檢測BPD與非BPD早產(chǎn)兒生后1 d、7 d及14 d外周血ILC2及其相關(guān)細胞因子IL-33、IL-25、TSLP、IL-5及IL-13水平，初步探討ILC2及其相關(guān)細胞因子在BPD中的變化及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

選擇2020年9月—2021年12月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科住院，胎齡<32周且住院時間≥14 d的76例早產(chǎn)兒為研究對象。排除標準：（1）合并嚴重的先天發(fā)育畸形；（2）合并遺傳代謝性疾病和/或染色體?。唬?）住院期間放棄治療或死亡；（4）病例資料缺失；（5）未獲得知情同意。按照BPD診斷標準分為BPD組（n=30）及非BPD組（n=46）。BPD診斷參考2018年BPD診斷標準［14］：胎齡<32周的早產(chǎn)兒在校正胎齡36周時仍依賴不同程度的吸入氣氧濃度和呼吸支持≥3 d，并且有影像學(xué)資料證實存在肺間質(zhì)病變，即可診斷為BPD。本研究已獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)委員會批準（SWYXLL20200121-17）。

1.2 臨床資料收集

收集研究對象的臨床資料，包括：胎齡、出生體重、性別、肺泡表面活性物質(zhì)的使用、出生方式、產(chǎn)前類固醇激素使用等情況。

1.3 樣本量估算

以ILC2占淋巴細胞百分率為主要指標，基于文獻［15］和本課題組預(yù)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個隨機化組之間的ILC2占比差值為0.1%，并將檢驗效能定為80%，Ⅰ型錯誤率定為0.05，得出的樣本量為每組25例。預(yù)估約20%早產(chǎn)兒由于各種原因，其數(shù)據(jù)不能進行統(tǒng)計分析，為保證樣本量充足，故每組納入至少30例早產(chǎn)兒。樣本量計算公式按照文獻［16］，即N=公式中N為每組所需的最小樣本量；Uα規(guī)定為單側(cè)α=0.05所對應(yīng)的U界值（1.6449）；Uβ取β=0.1所對應(yīng)的U界值（1.6449）；δ為容許誤差，即隨機化組之間的ILC2占淋巴細胞百分率的差值（0.1%）；σ為總體標準差。由于查找文獻沒有得到總體標準差，由預(yù)試驗樣本標準差（0.12%）代替。k=1時兩組樣本量相等。

1.4 流式細胞術(shù)檢測外周血ILC2比例

于患兒生后1 d、7 d及14 d，收集外周靜脈血1.5 mL，肝素鈉抗凝，其中0.5 mL用于患兒住院過程中血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）監(jiān)測。另外1 mL室溫放置30 min后3 000 r/min離心30 min，離心后的血細胞沉淀采用Ficoll（天津灝洋TBD）密度梯度離心法提取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），細胞總量1×106~5×106個。分離出的PBMC中分別加入PerCP/Cy5-CD45抗體、FITC-Lin抗體、PE-CRTH2抗體、PE/Cy7-CD161抗體和APC-CD127抗體，充分混勻，4℃條件下避光孵育30 min，PBS重懸，4℃下2 000 r/min離心5 min洗掉多余抗體，再次加入300 μL PBS重懸，轉(zhuǎn)移入流式管內(nèi)于FACSCanto（美國BD公司）流式機內(nèi)檢測，以出現(xiàn)CD45+Lin-CRTH2+CD161+CD127+的細胞［17-18］定義為ILC2，結(jié)果采用FlowJo V10軟件進行分析。

1.5 外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5和IL-13水平的檢測

上述早產(chǎn)兒生后1 d、7 d及14 d外周靜脈血離心后的血清置入-80℃冰箱保存統(tǒng)一檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5和IL-13水平，按說明書（武漢艾萊特生物技術(shù)有限公司，中國）在450 nm處測量光密度值。橫坐標為光密度值，縱坐標為標準品濃度。構(gòu)建標準曲線，計算每孔細胞因子濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。以是否為BPD作為因變量，控制對BPD發(fā)生影響較大的一般臨床資料，以兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義的細胞因子作為自變量行多因素logistic回歸分析。采用受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲線計算外周血ILC2、IL-33、TSLP及IL-5預(yù)測BPD的曲線下面積（area under the curve，AUC）、靈敏度和特異度等。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

共收集符合標準的早產(chǎn)兒76例，其中BPD組30例（39%），非BPD組患兒46例（61%）。BPD組胎齡及出生體重低于非BPD組（P<0.001），兩組性別、出生方式、肺表面活性物質(zhì)使用、產(chǎn)前類固醇激素使用方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 BPD組和非BPD組患兒一般情況比較

2.2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較

BPD組生后7 d、14 d ILC2百分率均高于非BPD組（均P<0.001），兩組生后1 d ILC2百分率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖1。

圖1 兩組患兒外周血ILC2（CD45+Lin-CRTH2+CD161+CD127+）流式細胞儀分析圖 A為流式細胞術(shù)檢測出生后不同時間ILC2的設(shè)門圖；B為出生后不同時間外周血中ILC2百分率。右下象限區(qū)域即為ILC2所在區(qū)域，BPD組生后7 d、14 d ILC2百分率均高于非BPD組。

表2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較 （± s，%）

表2 兩組外周血PBMC中ILC2百分率比較 （± s，%）

注：［BPD］支氣管肺發(fā)育不良。

images/BZ_78_1320_2765_1494_2883.pngimages/BZ_78_1494_2765_1579_2883.pngimages/BZ_78_1579_2765_1812_2883.pngimages/BZ_78_1812_2765_2046_2883.png組別非BPD組BPD組例數(shù)30 46生后1 d 0.401±0.398 0.401±0.384生后7 d 0.641±0.414 0.741±0.455生后14 d 0.819±0.478 0.935±0.421-10.770<0.001

2.3 兩組外周血IL-33、TSLP、IL-25、IL-5和IL-13水平比較

BPD組外周血IL-33、TSLP和IL-5水平在生后7 d和14 d時均高于非BPD組（均P<0.05），在生后1 d時與非BPD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。出生后各時間點兩組IL-25和IL-13水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。見表3。

表3 （續(xù)）

表3 兩組患兒生后不同時間外周血IL-33、IL-25、TSLP、IL-5及IL-13水平比較 （xˉ± s，pg/mL）

2.4 外周血IL-33、TSLP和IL-5與BPD發(fā)生的多因素logistic回歸分析

以BPD是否發(fā)生（發(fā)生BPD為1，不發(fā)生為0）為因變量，以胎齡、出生體重、IL-33、TSLP和IL-5為自變量，進行多因素logistic回歸分析。結(jié)果顯示，校正胎齡和出生體重后，生后7 d和14 d升高的IL-33、TSLP和IL-5與BPD發(fā)生密切相關(guān)（均P<0.05）。見表4。

表4 生后7 d及14 d早產(chǎn)兒發(fā)生BPD的多因素logistic回歸分析結(jié)果

2.5 外周血ILC2、IL-33、TSLP和IL-5的ROC曲線分析

分別以生后7 d和14 d外周血IL-33、TSLP、ILC2和IL-5水平為檢驗變量，以患兒是否患有BPD為分類變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示IL-33、TSLP、IL-5和ILC2的AUC均大于0.7（均P<0.05），見表5。

表5 外周血ILC2、IL-33、TSLP和IL-5對BPD的診斷價值

3 討論

BPD的高危因素包括早產(chǎn)兒、低出生體重、長時間氧療等，住院期間并發(fā)的肺部感染、肺水腫等也是導(dǎo)致BPD發(fā)生、發(fā)展的重要原因［2］。本研究觀察了76例胎齡<32周且住院時間≥14 d的早產(chǎn)兒，其中30例發(fā)生BPD，BPD發(fā)生率為39%，發(fā)生率與既往研究［3］相符。與非BPD組相比，BPD組患兒出生體重和胎齡較非BPD組明顯降低，而性別、出生方式、生后使用肺表面活性物質(zhì)、母親產(chǎn)前使用類固醇激素差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與既往研究［19］結(jié)果一致，進一步說明胎齡和出生體重是BPD發(fā)生的重要因素。

新生兒特別是早產(chǎn)兒，適應(yīng)性免疫尚未發(fā)育成熟，先天性免疫在這一時期發(fā)揮重要作用。ILC2是近年發(fā)現(xiàn)的重要先天免疫細胞，廣泛分布于機體各組織器官中，其中肺黏膜組織中數(shù)量最多。研究發(fā)現(xiàn)，ILC2在早期肺發(fā)育過程中可能是必需的［20］。本研究顯示，外周血ILC2百分率在兩組均呈現(xiàn)為生后1 d時很低，以后逐漸增加的趨勢，適量增加的ILC2可能有助于肺泡化建立；與非BPD組相比，BPD組ILC2在生后7 d和14 d明顯升高。研究發(fā)現(xiàn)，BPD小鼠ILC2較正常對照組明顯增加，減少BPD小鼠ILC2數(shù)量，其肺損傷和肺部炎癥改善［13］，提示ILC2促進了BPD病理過程。

ILC2上游細胞因子IL-25、TSLP、IL-33可促進ILC2擴增并產(chǎn)生Th2細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控作用［21］。與非BPD組相比，BPD組IL-25水平在各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而TSLP和IL-33在生后7 d和14 d明顯高于非BPD組，與ILC2的升高趨勢一致，推測在BPD形成過程中，ILC2的活化可能主要與TSLP和IL-33升高有關(guān)，IL-25對ILC2的活化作用可能不大。

IL-33是AECⅡ分泌的一種警報素，屬于IL-1細胞因子家族，可驅(qū)動2型免疫反應(yīng)［22］。新生小鼠高氧暴露后，肺IL-33和ILC2增加，誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)［23］，升高的IL-33還可導(dǎo)致異常肺泡化和持續(xù)的肺重塑，使新生兒肺部發(fā)育受阻，導(dǎo)致BPD發(fā)生。這一點在小鼠BPD模型中也得到了相應(yīng)證實［24-25］，發(fā)現(xiàn)BPD組肺組織中IL-33水平明顯升高；而抑制IL-33可以通過減少炎癥介質(zhì)的釋放從而減輕肺損傷。本研究BPD組IL-33較非BPD組明顯升高，結(jié)合以上研究，推測IL-33與BPD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

TSLP在呼吸道疾病如支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中異常表達［26-27］，促進ILC2分化，驅(qū)動呼吸道Th2免疫反應(yīng)，導(dǎo)致氣道炎癥和氣道重塑。TSLP受體缺陷小鼠氣道炎癥顯著減少［28］。本研究顯示，與非BPD組相比，BPD組患兒外周血TSLP升高，推測TSLP也可能參與了BPD氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，ILC2 也可以分泌 IL-5 和IL-13［4］。與非BPD組相比，BPD組IL-13水平在各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-5在生后7 d和14 d明顯高于非BPD組，與ILC2的升高趨勢一致，推測在BPD形成過程中，ILC2主要產(chǎn)生IL-5，而對IL-13的激活作用可能不大。研究表明，IL-5可影響肺局部微環(huán)境，導(dǎo)致炎癥性免疫反應(yīng)發(fā)生［29］。阻斷IL-5可顯著改善新生小鼠肺部炎癥，同時保護了肺泡的完整性［30］。推測IL-5可能參與了BPD氣道炎癥反應(yīng)。

本研究多因素logistic回歸分析顯示，在校正胎齡和出生體重后，IL-33、TSLP和IL-5與BPD發(fā)生密切相關(guān)，且ROC曲線結(jié)果提示，ILC2、IL-33、TSLP和IL-5對BPD有較高預(yù)測價值，提示ILC2、IL-33、TSLP及IL-5水平升高可預(yù)警BPD的發(fā)生。已有研究探討早產(chǎn)兒BPD早期風(fēng)險預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)生后7 d、14 d預(yù)測模型可有效預(yù)測BPD的發(fā)生［1］，與本研究時間點選擇一致。

綜上所述，ILC2、IL-33、TSLP及IL-5可能參與了BPD的發(fā)生發(fā)展，且其水平升高可預(yù)警BPD的發(fā)生。本研究局限性包括：由于樣本量少，未分析不同嚴重程度BPD早產(chǎn)兒基線資料和外周血ILC2及相關(guān)因子水平的差異，研究結(jié)果可能存在偏倚；檢測肺泡灌洗液中相關(guān)指標可更直接反映肺部炎癥改變，但由于倫理問題，肺泡灌洗液獲取困難。未來可進一步擴大樣本量，同時結(jié)合動物實驗對ILC2及相關(guān)因子的作用進行深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明無利益沖突。