基于質(zhì)譜技術(shù)的早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病血代謝產(chǎn)物的初步研究

楊秋萍 李思濤 郝虎, 古霞 石聰聰 肖昕, 蔡堯

（1.中山大學附屬第六醫(yī)院兒科，廣東廣州 510655；2.中山大學附屬第六醫(yī)院小兒遺傳代謝病實驗室，廣東廣州 510655）

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜?。╮etinopathy of prematurity，ROP）是發(fā)生于早產(chǎn)及低出生體重兒的視網(wǎng)膜血管增生性疾病，是嬰幼兒最常見的致盲和致低視力眼?。?］。隨著醫(yī)學的發(fā)展和早產(chǎn)兒救治水平的提高，早產(chǎn)兒、低出生體重兒的存活率不斷提升，ROP發(fā)病率也逐年上升。目前我國主要采用眼底數(shù)碼相機或者間接眼底鏡和透鏡結(jié)合的方式進行ROP篩查，為了早期發(fā)現(xiàn)和及時治療，降低ROP導致的視力障礙等相關(guān)后遺癥，早期預測和診斷尤其重要。代謝組學是對生物體代謝組分的定性和定量分析，直觀呈現(xiàn)生物體的代謝譜，靈敏地反映生物體在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的代謝產(chǎn)物變化［2］。Nivison-Smith等［3］發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝與視網(wǎng)膜發(fā)育、視網(wǎng)膜疾?。ㄓ绕涫前l(fā)育過程中發(fā)生的）密切相關(guān)。氨基酸代謝影響了視網(wǎng)膜血管發(fā)育和張力、氧化還原反應狀態(tài)、免疫及炎癥等功能［4］。代謝組學用于識別與疾病相關(guān)的代謝物質(zhì)變化，代謝干預有利于疾病的預防，提供尋找新治療靶點的機會。目前ROP患兒與代謝相關(guān)的研究有限，ROP疾病中受影響的代謝物或途徑尚不明確。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與代謝組學分析方法對ROP患兒和非ROP患兒血代謝產(chǎn)物進行回顧性分析，旨在探究ROP患兒特異性代謝標志物，為ROP的早期識別與診斷、治療提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取2013年1月—2016年12月中山大學附屬第六醫(yī)院住院的早產(chǎn)兒作為研究對象，記錄其出生時胎齡、體重、身長、呼吸支持方式、吸氧時間、是否患新生兒呼吸窘迫綜合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS） 等指標情況。所有早產(chǎn)兒腸內(nèi)及腸外營養(yǎng)均參考《中國新生兒營養(yǎng)支持臨床應用指南》［5］。

納入標準：（1）早產(chǎn)兒，胎齡27~34周，適于胎齡兒，病程中診斷ROP的患兒為ROP組，未診斷ROP患兒為非ROP組；（2）早產(chǎn)兒母親無高血壓、糖尿病、腎臟疾病等慢性疾病，無妊娠合并癥，無吸煙、酗酒、吸毒或藥物濫用史。排除標準：患兒有顱內(nèi)出血、缺血缺氧性腦病、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、先天性發(fā)育畸形、染色體異常、遺傳代謝性疾病等嚴重疾病或者死亡。

1.2 ROP診斷標準

運用間接眼底鏡和屈光度為25 D或28 D的透光鏡進行視網(wǎng)膜檢查，觀察到視網(wǎng)膜血管分界處增生性病變、血管走行異常及不同程度的牽拉性視網(wǎng)膜脫離，則診斷ROP［6］。本研究獲得中山大學附屬第六醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：2018ZSLYEC-114），研究對象監(jiān)護人均知情同意。

1.3 標本采集

新生兒出生24 h內(nèi)，留取足跟血3滴，浸透于專用濾紙片上，每個血滴>0.8 cm，于室溫自然干燥后1周內(nèi)在我院遺傳代謝病實驗室進行血代謝物檢測。

1.4 儀器和試劑

高效液相儀（日本島津公司）、串聯(lián)質(zhì)譜儀（API 3200 QTRAP，美國生物應用系統(tǒng)公司）、96微孔板氮吹儀（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司）、96孔板離心機（上海白洋）、臺式高速離心機（德國Hittech公司）。新生兒血片采集卡（美國Whatman903號濾紙）、96孔過濾板（0.45 μm，美國Millipore公司），96孔聚丙烯微孔板（美國Fisher公司）、?；鈮A同位素內(nèi)標（美國Cambridge Isotope Labs公司）、甲醇及乙腈（美國Sigma公司）。

1.5 樣本處理及檢測

用打孔器截取直徑5 mm血片，置于96孔微量過濾板中，每孔加入100 μL同位素內(nèi)標使用液（甲醇稀釋內(nèi)標儲備液至100倍），室溫放置20 min，3 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移至96孔聚丙烯微孔板中，50℃吹干后加入60 μL鹽酸正丁醇（3 mol/L），聚四氟乙烯膜覆蓋，置于65℃恒溫箱15 min，然后50℃吹干，加入80%乙腈100 μL溶解，鋁模覆蓋，上機檢測。檢測結(jié)果運用軟件Chemo View 1.2計算出所測樣品中代謝產(chǎn)物濃度值。

1.6 數(shù)據(jù)采集與分析

通過電化學原理將被檢測物質(zhì)分子電離成不同質(zhì)荷比（m/z）的帶電粒子，并根據(jù)m/z大小生成分離排列的圖譜對離子峰的強度進行測定，采用定量分析軟件自動計算出所測樣本氨基酸代謝產(chǎn)物濃度值，利用SIMCA-P 13.0數(shù)據(jù)處理軟件，采用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 對患兒血代謝物質(zhì)進行分析，尋找差異代謝物。評價OPLS-DA模型匹配度的3個關(guān)鍵指標：R2X表示X矩陣解釋率；R2Y表示Y矩陣解釋率；R2X與R2Y反映了模型穩(wěn)定性；Q2表示模型預測性；R2X、R2Y、Q2三者均大于0.5表示模型匹配良好。根據(jù)OPLS-DA模型輸出聚類圖和變量得分圖（Score Plot，S-Plot），聚類圖中2組物質(zhì)分布在左右2個區(qū)域提示2組代謝物存在顯著差異；S-Plot圖中越偏向兩極的物質(zhì)具有越大的協(xié)方差和相關(guān)性，以此篩選差異代謝物，隨后進行權(quán)重分析：根據(jù)變量差異貢獻（variable importance in projection，VIP）比較，篩選出VIP>1的血差異代謝物。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）M（P25，P75）描述，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料采以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用Medcalc軟件進行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，計算ROC曲線下方部分的面積（area under the curve， AUC）、 靈 敏 度 （sensitivity）、 特 異 度（specificity），評價差異代謝物對ROP的診斷預測效果，并尋找最佳的指標診斷的截斷值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒基本情況

ROP組和非ROP組各21例，臨床資料見表1。兩組出生胎齡、體重、出生身長、吸氧時長、NRDS比例的比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 ROP組與非ROP組臨床資料比較

2.2 血代謝譜模式識別分析

利用OPLS-DA模型對ROP組和非ROP組患兒血代謝譜進行分析。ROP組和非ROP組患兒的OPLSDA模型聚類圖見圖1。該模型參數(shù)：R2Xcum=0.686，R2Ycum=0.907，Q2=0.522，均>0.5，表明該模型解釋能力較好，穩(wěn)定性和預測性較高。ROP組和非ROP組的血代謝物質(zhì)分布在左右兩個區(qū)域，提示兩組之間血代謝產(chǎn)物存在顯著差異。

圖1 ROP患兒和非ROP患兒血代謝物的OPLS-DA聚類圖 橫坐標t［1］表示預測組分，呈現(xiàn)組間差異；縱坐標to［1］表示正交組分，呈現(xiàn)組內(nèi)離散程度；圓點旁邊數(shù)字表示樣本編號，綠色圓點1~21為ROP組，藍色圓點22~42為非ROP組。

2.3 血代謝物差異物質(zhì)篩選

根據(jù)血代謝物數(shù)據(jù)輸出S-Plot圖，圖中偏向兩極的為兩組差異較大的物質(zhì)，即最有可能為生物標志物。位于S-Plot圖兩極的共有8個物質(zhì)（圖2紅色標記），初步篩選差異較大的代謝物有：谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸及精氨酸（圖2）。

2.4 血代謝物權(quán)重分析

使用OPLS-DA模型分析變量重要性得分評價變量貢獻，VIP值越大，代表該物質(zhì)對于區(qū)分兩組所具有的貢獻越大。因此篩選出VIP>1的血代謝產(chǎn)物，選擇排名前10的物質(zhì)：谷氨酸、鳥氨酸、甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸（表2）。

表2 ROP組和非ROP組患兒血代謝物中VIP>1的代謝物

2.5 重要血代謝物統(tǒng)計學分析

針對血代謝物權(quán)重分析VIP值排名前10的代謝物進行t檢驗或者秩和檢驗分析：符合正態(tài)分布的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸及精氨酸采用t檢驗進行分析；不符合正態(tài)分布的鳥氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、賴氨酸，采用秩和檢驗進行分析。統(tǒng)計分析顯示，ROP組谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、甘氨酸水平均高于非ROP組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 ROP組和非ROP組患兒血代謝物水平比較 （μmol/L）

2.6 ROC曲線分析預測ROP中潛在的生物標志物

針對t檢驗及秩和檢驗統(tǒng)計分析有差異的谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、甘氨酸5個氨基酸進行ROC曲線分析，尋找潛在的代謝生物標志物。通過比較AUC值、靈敏度、特異度，選出診斷價值較高的生物標志物，并計算出診斷的截斷值。AUC值越高，曲線越接近左上角（靈敏度及特異度越大），預測準確率越高。分析結(jié)果如表4、圖3所示，可見5種氨基酸都有較高的預測診斷價值，其中谷氨酸和鳥氨酸AUC值、靈敏度和特異度均較高，可見它們在識別ROP方面是所有代謝物中最好的，其參考截斷值分別為223.92 μmol/L、53.07 μmol/L。

圖3 ROP潛在代謝標志物的ROC曲線 谷氨酸與鳥氨酸對ROP的診斷價值最高。

表4 ROP潛在代謝標志物的ROC曲線分析

3 討論

ROP是各種因素導致的微血管變性后新生血管增生性疾病，早產(chǎn)、低出生體重、過度用氧是公認的危險因素［6］。胎兒視網(wǎng)膜血管在16周左右開始發(fā)育，直至足月才成熟。為了避免早產(chǎn)兒出生后未及時診斷及治療而導致視力受損甚至致盲的風險，在視網(wǎng)膜發(fā)育的過程中，需要定期檢查眼底了解血管生長情況。由于技術(shù)和條件限制，部分地區(qū)甚至無法開展ROP篩查。近年來隨著代謝組學和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，并逐漸應用于各種疾病，如小兒哮喘、苯丙酮尿癥、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、新生兒支氣管肺發(fā)育不良等的早期識別、精準診斷及個體化治療［7-10］。本研究對ROP患兒的血代謝產(chǎn)物進行分析，以尋找可預測診斷ROP的生物標志物。

Fu等［11］總結(jié)了ROP與代謝相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)圍生期早期的代謝失調(diào)是ROP和其他早產(chǎn)兒遠期并發(fā)癥的一個強有力但未被充分研究的危險因素，說明視網(wǎng)膜血管的生長發(fā)育與機體代謝密切相關(guān)。Zhou等［12］對需要治療的ROP患兒與無需治療的ROP患兒的代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)多個物質(zhì)的變化主要富集于蛋白質(zhì)消化吸收和氨基?；?tRNA生物合成途徑。Nilsson等［13］對早產(chǎn)兒多個時間點的代謝物進行研究，發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒低水平的1-磷酸鞘氨醇與嚴重ROP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。另外，在新生小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，饑餓、高血糖狀態(tài)增加了視網(wǎng)膜細胞凋亡、減慢神經(jīng)元的生長和促進了視網(wǎng)膜新生血管的生長［14-15］。本研究對早產(chǎn)兒ROP組及非ROP組的代謝情況進行比較，結(jié)果顯示有5種差異代謝物即谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸及甘氨酸，其中谷氨酸及鳥氨酸對ROP預測診斷價值最高，可以作為早期識別診斷ROP的生物標志物，另外其可能在ROP疾病發(fā)展的過程中起到調(diào)節(jié)作用，需要更多動態(tài)的代謝數(shù)據(jù)進行研究及驗證，有望通過營養(yǎng)調(diào)節(jié)、改變機體代謝情況來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管的生長發(fā)育過程。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，儲存于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、雙極細胞及光感受細胞神經(jīng)末梢的突觸囊泡內(nèi)，在視覺系統(tǒng)中有重要生理作用［16］。視網(wǎng)膜中多數(shù)興奮性信號由谷氨酸介導，但神經(jīng)突觸間隙中過量的谷氨酸可引起視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷甚至死亡［17］。已有多個研究發(fā)現(xiàn)ROP患兒體內(nèi)谷氨酸水平升高且與ROP發(fā)生呈正相關(guān)，對ROP有良好的診斷價值［18-21］。本研究中ROP組患兒谷氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，與既往研究［18-21］一致，提示高濃度的谷氨酸可能與ROP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ROC曲線分析提示谷氨酸對預測ROP的靈敏度及特異度高，可作為ROP早期預測標志物或輔助診斷依據(jù)。

亮氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一。研究發(fā)現(xiàn)，富亮氨酸α-2糖蛋白1（leucinerich α-2-glycoprotein 1，LRG1），是一種富含亮氨酸的α-2-糖蛋白，它可以通過轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路，促進內(nèi)皮細胞遷移，參與異常血管生成的病理過程［22］。Mundo等［23］研究發(fā)現(xiàn) LRG1 在視網(wǎng)膜黃斑變性患者的血管內(nèi)皮細胞及脈絡膜新生血管膜周圍組織中的水平較高，結(jié)果支持了抗LRG1單克隆抗體成為治療新生血管相關(guān)視網(wǎng)膜病的候選治療靶點。另外，視網(wǎng)膜中富含亮氨酸的小蛋白多糖，在許多與纖維和血管生成有關(guān)的上游信號中發(fā)揮著重要作用，可調(diào)節(jié)細胞分化、黏附、生長和修復機制［24］。本研究發(fā)現(xiàn)ROP組患兒的亮氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示ROP患兒視網(wǎng)膜的異常血管增殖可能與亮氨酸有關(guān)。

鳥氨酸是尿素循環(huán)的中心部分，可以促進氨的排泄，天冬氨酸參與鳥氨酸循環(huán)。鳥氨酸-天冬氨酸被推薦為減少運動疲勞的營養(yǎng)補充劑之一［25］。但有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的鳥氨酸對視網(wǎng)膜色素上皮細胞具有特異性毒性，長期攝入過多鳥氨酸有視網(wǎng)膜病變風險［26］。本研究發(fā)現(xiàn)ROP組患兒鳥氨酸水平明顯高于非ROP組患兒，提示高濃度鳥氨酸可能增加了患兒視網(wǎng)膜病變風險。有一項多中心前瞻性隊列研究分析發(fā)現(xiàn)天冬氨酸的攝入量與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率有關(guān)［27］，但具體機制尚不清楚。本研究ROC曲線分析提示鳥氨酸對ROP的鑒別價值高，鳥氨酸可作為ROP早期預測診斷的代謝標志物。

甘氨酸是一種非必需氨基酸，參與蛋白質(zhì)的合成和許多重要的生理功能。有研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸可以模擬血管內(nèi)皮生長因子對視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的作用，促進體外和體內(nèi)血管生成，還能有效地保護血管內(nèi)皮細胞的線粒體功能［28］。此外，甘氨酸可促進血紅素的生物合成，血紅素在控制活性氧水平和維持氧化磷酸化中起關(guān)鍵作用，從而為血管增殖提供良好的環(huán)境［29-30］。最近有研究發(fā)現(xiàn)ROP患兒體內(nèi)甘氨酸水平升高［31］，本研究與之一致，提示甘氨酸可能與ROP患兒視網(wǎng)膜血管過度增殖有關(guān)。

綜上所述，本研究通過液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)和代謝組學方法比較了ROP患兒與非ROP患兒的血代謝產(chǎn)物，結(jié)果提示5種氨基酸存在明顯差異，是ROP的潛在標志物，其中谷氨酸與鳥氨酸對ROP診斷價值最高，可以作為ROP早期診斷的生物標志物，有助于ROP的早期識別與診斷。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。