不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰生長性能、體色及腸道健康的影響

劉 祥，易新文，胡 毅，鐘 蕾*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128；2．深圳市澳華集團(tuán)股份有限公司，廣東深圳 518067）

全球貿(mào)易形勢變化和世界范圍飼料原料資源短缺導(dǎo)致魚粉、豆粕等常規(guī)蛋白源的供用不穩(wěn)定、價格上漲等問題，因此，尋找新型非糧蛋白源迫在眉睫。近年來，我國玉米深加工產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，2019年我國玉米消費量約2.78億t，其中約8300萬t用于玉米深加工工業(yè)（劉玉春等，2017）。玉米深加工過程中的副產(chǎn)物如玉米DDGS、玉米皮、玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等蛋白含量高，均有作為蛋白源應(yīng)用到水產(chǎn)飼料中的潛力。噴漿玉米皮是將玉米浸泡、破碎后分離出的玉米表皮與其濃縮得到的玉米漿混合干燥后加工而成的一種副產(chǎn)物（Ramirez等，2008），其營養(yǎng)成分主要是膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂類、淀粉及其他微量成分，其中蛋白含量為17%～25%（王紅玉等，2016；王遂等，2000）。有研究表明，噴漿玉米皮可用于波雜羔羊與山羊養(yǎng)殖中，增重效果良好（尹福泉等，2018；錢勇等，2007）。Jeremiah等（2007）研究表明，飼料中補(bǔ)充玉米皮能顯著提高羅非魚（Oreochromis mossambicus）的增重率；Galeana-López等（2020）發(fā)現(xiàn)，飼料中補(bǔ)充玉米皮粉對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）生長性能無顯著影響。舒維成（2017）發(fā)現(xiàn)，用噴漿玉米皮飼喂櫻桃谷鴨可促進(jìn)腸道發(fā)育，增加胸肌的黃度值。由此可見玉米加工副產(chǎn)物在動物飼料中具有應(yīng)用潛力。

斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種，2019年鮰魚總產(chǎn)量約為30萬t（于秀娟等，2020）。飼料中蛋白質(zhì)含量對斑點叉尾鮰幼魚生長起決定性作用。有研究表明斑點叉尾鮰蛋白需求為32%～35%（馮端林等，2014；王廣軍等，2005），而蛋白含量過高或過低都會導(dǎo)致生長減慢和飼料效率降低，因此進(jìn)一步精準(zhǔn)斑點叉尾鮰蛋白質(zhì)需求對促進(jìn)鮰魚生長，降低養(yǎng)殖成本有重要意義。另外，斑點叉尾鮰體色和肉色與其市場價值密切相關(guān)，皮膚和肌肉偏黃均會降低斑點叉尾鮰經(jīng)濟(jì)價值。飼料中的一些色素如類胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等是影響斑點叉尾鮰體色和肉色變化的主要因素（萬祖德等，2016；葉元土，2009）。噴漿玉米皮中含有玉米黃色素，而該色素會導(dǎo)致斑點叉尾鮰體色變黃（劉軍海，2008）。因此，本試驗主要探究不同蛋白水平和噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰生長、體色、肉色及腸道健康的影響，精確斑點叉尾鮰蛋白需求量及在不影響斑點叉尾鮰體色的前提下噴漿玉米皮可添加量，為噴漿玉米皮在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 以豆粕、魚粉為蛋白源，豆油為主要脂肪源制成基礎(chǔ)配方，在其基礎(chǔ)上分別添加0、30、60、90 g/kg制成噴漿玉米皮含量分別為0（對照）、3%、6%、9%的四種試驗飼料，飼料蛋白含量依次為34%、35%、33%、32%。飼料原料經(jīng)粉碎機(jī)后過60目篩，準(zhǔn)確稱量后逐級混合均勻，然后分別加入油脂與水混勻，制粒壓成2 mm粒徑的顆粒餌料，風(fēng)干保存。

1.2 飼養(yǎng)與管理 試驗在湖南婁底車田江水庫網(wǎng)箱中進(jìn)行，斑點叉尾鮰幼魚購自漣源市水產(chǎn)養(yǎng)殖場。試驗前期，挑選規(guī)格一致的斑點叉尾鮰，通過網(wǎng)箱（5.0 m×4.0 m×3.0 m）暫養(yǎng)馴化，用對照組飼料馴化2周，饑餓24 h后，挑選體格健壯、大小均勻的斑點叉尾鮰[（50±0.02）g]隨機(jī)分配于20個網(wǎng)箱中（1.5 m×1.5 m×1.5 m聚乙烯網(wǎng)箱），每個網(wǎng)箱放養(yǎng)50尾。本試驗共設(shè)4組，每組5個重復(fù)。每天投喂3次，投喂時間分別為6：00，12：00和19：00，采用飽食投喂并根據(jù)斑點叉尾鮰攝食情況加以調(diào)整，記錄飼料投喂量。整個養(yǎng)殖期間，水溫為（26.0±1.2）℃，溶解氧5 mg/L左右，總氨氮小于0.01 mg/L，pH為7.4～7.8，養(yǎng)殖周期為8周。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)）%

1.3 營養(yǎng)成分含量 粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定（GB/T5009.5-1985）；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定（GB/T5009.6-1985）；粗灰分含量采用550℃高溫灼燒法測定（GB/T5009.4-1985）。

1.4 生長性能指標(biāo) 試驗結(jié)束，禁食24 h后進(jìn)行采樣。記錄每個網(wǎng)箱斑點叉尾鮰總重、總尾數(shù)，用于計算成活率（SR）、增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數(shù)（FCR）。計算方法如下：

成活率/%=Nt/N0×100；

增重率/%=（Wt-W0）/W0×100；

飼料系數(shù)=W/（Wt-W0）；

特定生長率/（d/%）=（lnWt-lnW0）/T×100%；

式中：N0為初始尾數(shù)；Nt為終末尾數(shù)；W0為終末體重，g；Wt為初始體重，g；F為飼料投喂總量，g；T為養(yǎng)殖天數(shù)，d。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾斑點叉尾鮰記錄體長和體重，然后解剖，分離內(nèi)臟、肝臟和腹部脂肪，計算肝體比（HSI）、臟體比（VSI）、肥滿度（CF）和腹脂率（AFP）。

肝體比/%=W1/Wh×100；

臟體比/%=Wv/Wh×100；

肥滿度=Wh/L3×100；

腹脂率/%=Wf（g）/Wh（g）×100。

式中：W1為肝臟重；Wh為體重；Wv為內(nèi)臟重，g；L為體長，cm；Wf為內(nèi)臟重，g。

1.5 體色和肉色測定 養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每個網(wǎng)箱中隨機(jī)取6尾魚，參考梁高楊等（2019）的試驗方法，用色差儀（NR110）測定腹部與側(cè)線附近皮膚及背部肌肉的L*、a*、b*值。具體測樣點如圖1所示。

圖1 皮膚和肌肉色度值測量點

1.6 腸道切片的制備與觀察 養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，饑餓24 h，每箱隨機(jī)取3尾斑點叉尾鮰，解剖，并取體積約為 （0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）的后腸組織，置于4%甲醛溶液中固定24 h，制樣時取出，微流水沖洗，分別經(jīng)濃度為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脫水并置于二甲苯中透明，最后包埋于低熔點石蠟中，然后使用RM-2235型切片機(jī)橫向切片，切片厚度5μm，然后HE方法染色，中性樹膠封片。

1.7 腸道菌群分析 養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，從每組網(wǎng)箱中隨機(jī)取9尾魚，采集腸道內(nèi)容物，保存于-80℃冰箱。依據(jù)生長指標(biāo)，選取對照組、CG3組、CG9組進(jìn)行后續(xù)腸道菌群分析。使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒提取腸道內(nèi)容物中的DNA，擴(kuò)增16SrRNA基因V3～V4區(qū)域后利用Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序（USA）。將原始序列根據(jù)條碼分選到不同樣品中，然后使用UCHIME過濾嵌合體序列。用“pick_open_reference_otus.py”命令將相似性大于99%的序列歸為同一個分類操作單元（OTU）。利用香農(nóng)指數(shù)（Shannon）、辛普森指數(shù)（Simpson）和物種豐富度指數(shù)（chao1）公式計算細(xì)菌生態(tài)多樣性指數(shù)；使用Mothur軟件制作柱狀圖、Venn圖以作OTU分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 本實驗所有的數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics23 （IBM，Armonk，NY，USA）軟件采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）并進(jìn)行Duncan氏多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰生長性能的影響 由表2可知，各組間斑點叉尾鮰末均重、增重率、存活率、飼料系數(shù)、肝體比、臟體比及肥滿度無顯著差異（P＞0.05），與對照組相比，試驗組斑點叉尾鮰腹脂率顯著降低（P＜0.05）。

表2 飼料中不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰生長性能的影響

2.2 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰皮膚及肌肉色度值的影響 由表3可知，與對照組相比，CG3、CG6、CG9組斑點叉尾鮰肌肉黃度值（b*）顯著提高；CG9組斑點叉尾鮰紅度值（a*）顯著高于CG3組；各試驗組間斑點叉尾鮰側(cè)面皮膚、腹部皮膚、肌肉顏色色度值（L*）均無顯著差異。

表3 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰皮膚及肌肉色度值的影響

2.3 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰腸組織結(jié)構(gòu)的影響 由表4可知，與對照組相比，CG3、CG6、CG9組斑點叉尾鮰腸道絨毛高度與杯狀細(xì)胞數(shù)無顯著差異（P＞0.05），對照組、C3組腸道肌層厚度顯著高于CG6、CG9組（P＜0.05）。

表4 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.4 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰腸道菌群的影響

2.4.1 腸道菌群多樣性分析 由圖2可知，對照組操作分類單元（OTU）數(shù)目為406個，CG3組OTU數(shù)目為301個，CG9組OTU數(shù)目為360個，3組共有的OTU數(shù)目為166個，對照組、CG3組、CG9組特有OTU數(shù)目分別為101、69、75個。

圖2 OTU韋恩圖

主坐標(biāo)分析中，如果樣品坐標(biāo)距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落結(jié)構(gòu)差異大的樣品則會遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開。由圖3可知，攝食相同飼料配方的斑點叉尾鮰腸道菌群樣品傾向于聚集在一起，C3組樣本與對照組距離較大，說明群落結(jié)構(gòu)組成與對照組差異較大。

圖3 基于OTU水平unweighted UniFrac距離的細(xì)菌屬豐度的主成分分析

由圖4可知，各組間斑點叉尾鮰腸道菌群的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。與對照組相比，CG3、CG9組斑點叉尾鮰Shannon指數(shù)有上升趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），CG9組Simpson指數(shù)顯著高于對照組和與CG3組（P＜0.05）。

圖4 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰腸道菌群α-多樣性的影響

2.4.2 腸道菌群優(yōu)勢物種組成 通過對斑點叉尾鮰腸道菌群中門水平物種相對豐度進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（圖5），其腸道優(yōu)勢菌門為梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、螺旋體門（Spirochaetes）等。由表5可知，與對照組、CG3組相比，CG9組梭桿菌門、厚壁菌門的相對豐度顯著下降（P＜0.05），變形菌門相對豐度顯著上升（P＜0.05）。

表5 門水平排名前三的物種相對豐度

圖5 門水平物種相對豐度

由圖6可知，斑點叉尾鮰腸道菌群中相對豐度最高的10個屬為鯨桿菌屬（cetobacterium）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、乳球菌屬（Lactococcus）、擬桿菌屬 （Macellibacteroides）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、梭菌目未鑒定屬（unidentified_Clostridiales）、假纖細(xì)芽孢桿菌屬（Pseudogracilibacillus）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和咸海鮮球（jeotgalicoccus）。由表6可知，與對照組、CG3組相比，CG9組鯨桿菌屬與乳酸菌屬相對豐度顯著下降（P＜0.05）；CG9組鄰單胞菌屬的相對豐度顯著上升（P＜0.05）。

表6 門水平排名前三的物種相對豐度

圖6 屬水平物種相對豐度

3 討論

3.1 飼料中不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰生長和形體指標(biāo)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)不同水平噴漿玉米皮的添加對斑點叉尾鮰的增重率無顯著性影響，這與Galeana-López（2020）、Jeremiah（2007）等研究結(jié)果一致。但李珊珊研究（2018）表明，噴漿玉米皮添加水平增加至15%，肉鴨生長性能顯著降低。舒維成（2017）發(fā)現(xiàn)，飼料中用0、5%、10%、15%、20%的噴漿玉米皮會降低肉鴨的生產(chǎn)性能，這與本試驗結(jié)果不一致。其原因可能是在噴漿玉米皮的加工過程中，會使用一定濃度的亞硫酸進(jìn)行浸泡，因此會降低飼料適口性，影響其攝食。此外，隨著噴漿玉米皮比例的增加，斑點叉尾鮰腹脂率顯著降低，其原因可能是飼料中噴漿玉米皮中阿拉伯聚糖與膽固醇、脂肪吸附結(jié)合，降低了斑點叉尾鮰脂類物質(zhì)的吸收（Vahouny等，1981）。

3.2 飼料中不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰體色和肉色的影響 斑點叉尾鮰自身不能合成色素，其體色的形成易受到環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)的影響。有研究表明葉黃素與玉米黃素兩種黃色素會沉積在斑點叉尾鮰肌肉中，使斑點叉尾鮰體色偏黃（Li等，1981）。色素對斑點叉尾鮰皮膚著色效果的強(qiáng)度順序依次為：葉黃素、玉米黃素、蝦青素、角黃素、β-胡蘿卜素（Robinson，1981）；冷向軍等（2003）研究表明，飼料中添加葉黃素類產(chǎn)品對人工養(yǎng)殖的胡子鯰的體色有很好的改善作用；耿彬等（2021）發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中玉米DDGS添加水平的升高，斑點叉尾鮰肌肉黃度值（b*）值顯著提高。本試驗結(jié)果顯示，添加不同水平噴漿玉米皮均可顯著提高肌肉黃度值（b*）值，這與上述結(jié)果類似，其可能的原因是噴漿玉米皮作為一種內(nèi)源性色素源，其含有豐富的玉米黃素，玉米黃素是一種油溶性天然色素，主要由葉黃素和隱黃素等類胡蘿卜素所組成，其能較好的在斑點叉尾鮰體內(nèi)沉積，導(dǎo)致體色變黃。因此飼料中添加一定程度噴漿玉米皮會顯著影響斑點叉尾鮰體色，降低經(jīng)濟(jì)價值。

3.3 不同蛋白及噴漿玉米皮水平對斑點叉尾鮰腸道健康的影響 腸道結(jié)構(gòu)的完整性是營養(yǎng)成分消化吸收和個體正常發(fā)育的生理學(xué)基礎(chǔ)，是腸道屏障功能及黏膜免疫反應(yīng)的必要條件（Dimitroglou等，2010）。本試驗中，各組腸道絨毛高度、杯狀細(xì)胞數(shù)均無顯著性差異，但CG6、CG9組中腸絨毛部分出現(xiàn)脫落或破損、肌層皺縮變薄的現(xiàn)象。這與何嬌嬌等（2018）用玉米蛋白粉替代魚粉蛋白60%時，大黃魚（Larimichthys crocea）的腸道上皮細(xì)胞排列紊亂研究結(jié)果類似；吳莉芳等（2010）用去皮豆粕替代魚粉蛋白60%時，埃及胡子鲇（Clarias lazera）的后腸腸道組織結(jié)構(gòu)完整性被破壞。朱波等（2020）研究表明，當(dāng)金針菇菌渣添加水平高于5%時，中腸絨毛高度下降，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。這些研究與本試驗結(jié)果一致，原因可能是噴漿玉米皮中含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子如阿拉伯聚糖，可誘導(dǎo)炎癥從而影響到腸道結(jié)構(gòu)完整性并最終影響腸道功能。

腸道菌群是評價動物腸道健康的重要指標(biāo)。穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)能夠幫助營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、促進(jìn)腸上皮細(xì)胞生長發(fā)育抵抗外來病原菌的入侵（溫若竹，2010）。香濃指數(shù)（Shannon index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）反映了腸道菌群多樣性，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，物種分布越均勻。研究結(jié)果表明CG9組辛普森指數(shù)顯著高于對照組與CG3組，這說明添加90 g/kg噴漿玉米皮顯著提高了腸道菌群的多樣性（P＜0.05）。這與吳韜研究結(jié)果（2015）一致，可能是植物蛋白中非淀粉多糖為腸道中微生物繁殖提供底物（徐秀容，2000），從而提高斑點叉尾鮰腸道菌群多樣性。

本試驗結(jié)果中斑點叉尾鮰腸道菌群中優(yōu)勢菌群門水平為梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門。這與耿彬等（2021）、何嬌嬌等（2018）研究結(jié)果（2018）相似。然而，當(dāng)飼料中噴漿玉米皮添加比例達(dá)到9%時，斑點叉尾鮰腸道的梭桿菌門和厚壁菌門相對豐度低于對照組，變形菌門相對豐度高于對照組，結(jié)合腸道菌群多樣性分析的數(shù)據(jù)，說明高劑量噴漿玉米皮替代改變了斑點叉尾鮰腸道菌群結(jié)構(gòu)。這一變化趨勢與王亞如等（2017）的研究結(jié)果類似，飼料中添加高水平豆粕顯著改變了花鱸（Lateolabrax japonicas）腸道菌群門水平細(xì)菌的組成。此外，在噴漿玉米皮替代比例達(dá)到9%時，斑點叉尾鮰腸道中乳球菌屬相對豐度顯著低于對照組。乳球菌屬為常見的益生菌屬，此屬中多個菌種在飼料中添加可促進(jìn)腸道絨毛發(fā)育，提高腸道消化酶活性，增加腸道菌群多樣性（Zhang等，2017；Shin等，2016；Merrifield，2010）。而本實驗中鄰單胞菌屬相對豐度高于對照組，鄰單胞菌屬中一些菌種與腸道疾病有關(guān)，如類志賀鄰單胞菌感染會使草魚腸道出現(xiàn)烏黑色內(nèi)容物，肝脾腫大（胡錢東等，2014）；感染大鯢出現(xiàn)采食量減少、腹部腫大等癥狀（楊星等，2014）。但噴漿玉米皮改變腸道菌群結(jié)構(gòu)機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

飼料中添加噴漿玉米皮低于9%（粗蛋白質(zhì)水平32%）時不影響班點叉尾鮰生長性能，但使肉色變黃。此外，添加噴漿玉米皮達(dá)到9%時斑點叉尾鮰腸道屏障功能被損壞，腸道有益菌相對豐度下降、有害菌相對豐度增加，因此在長期使用時需要進(jìn)一步評估其價值。