葛黃顆粒的質(zhì)量標準研究

黃宇思 李能源 魏 嵋 黃 銳 蒲清榮 羅 群▲

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科，四川瀘州 646000

葛黃顆粒是在西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（我院）孫同郊教授的有效經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上研制而成。由葛花、黨參、虎杖、山楂、柴胡、鹽澤瀉、枳椇等組成，具有清熱解毒、除濕、疏肝健脾的功效。臨床上用于酒精及其他原因引起的慢性肝炎和脂肪肝。為了有效控制葛黃顆粒的質(zhì)量，采用薄層色譜法（thinlayer chromatography，TLC）對黨參、丹參、白芍、虎杖進行鑒別，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定君藥葛花中射干苷的含量，以期建立有效質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（日本島津，型號：LC-20A）；超聲波提取器（武漢嘉鵬電子有限公司，型號：JPCT0328）；電子天平（常州市幸運電子設(shè)備有限公司，型號：JA-SERIES）；電子天平（日本島津，型號：AUW120D）；薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰?，型號：GOODLOOK-1000）。

1.2 藥品與試劑

射干苷（批號：111632-200602，含量：100%，供含量測定用）、芍藥苷（批號：110736-201539，含量：96.4%）、丹參素鈉（批號：110855-201311，含量：98.1%）、大黃素（批號：110756-201512，含量：98.7%）、黨參對照藥材（批號：121057-201206），由中國食品藥品檢定研究院提供；色譜乙腈、色譜甲醇、娃哈哈純凈水等其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芍TLC鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取葛黃顆粒10 g，加50 ml乙醇，回流1 h，濾過，蒸去乙醇，加30 ml水溶解，用水飽和正丁醇提取2次，每次30 ml，合并提取液，用5 ml氨試液洗滌，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 ml，取正丁醇液，蒸干，加乙醇1 ml溶解，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷，以乙醇為溶劑，制成1 mg/ml的對照品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 取葛黃顆粒缺白芍陰性樣品，按照“2.1.1”項下的方法制備陰性樣品溶液。

2.1.4 試驗方法 吸取“2.1.1”項下的供試品溶液、“2.1.2”項下的對照品溶液、“2.1.3”項下的陰性樣品溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱顯色。

2.1.5 試驗結(jié)果 供試品色譜中，檢出芍藥苷的斑點，陰性無干擾。見圖1。

圖1 葛黃顆粒中白芍TLC圖

2.2 丹參TLC鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備 取葛黃顆粒10 g，加50 ml甲醇，回流30 min，濾過，蒸去甲醇，加25 ml水溶解，用稀HCl調(diào)pH至2，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，加甲醇1 ml溶解，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取丹參素鈉，以甲醇為溶劑，制成1 mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取葛黃顆粒缺丹參陰性樣品，按照“2.2.1”項下的方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 試驗方法 吸取“2.2.1”項下的供試品溶液10 μl、“2.2.2”項下的對照品溶液5 μl、“2.2.3”項下的陰性樣品溶液10 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏15 min，放置，在紫外燈（365 nm）下檢視。

2.2.5 試驗結(jié)果 供試品色譜中，檢出丹參素鈉的斑點，陰性無干擾。見圖2。

圖2 葛黃顆粒中丹參TLC圖

2.3 虎杖TLC鑒別

2.3.1 供試品溶液的制備 取葛黃顆粒10 g，加50 ml甲醇，浸泡1 h，濾過，蒸去甲醇，加水25 ml溶解，再加鹽酸3 ml，回流30 min，冷卻，用乙醚提取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml溶解，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 取大黃素，以甲醇為溶劑，制成1 mg/ml的對照品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液的制備 取葛黃顆粒缺虎杖陰性樣品，按照“2.3.1”項下的方法制備陰性樣品溶液。

2.3.4 試驗方法 吸取“2.3.1”項下的供試品溶液、“2.3.2”項下的對照品溶液、“2.3.3”項下的陰性樣品溶液各10 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.3.5 試驗結(jié)果 供試品色譜中，檢出大黃素的斑點，陰性無干擾。見圖3。

圖3 葛黃顆粒中虎杖TLC圖

2.4 黨參TLC鑒別

2.4.1 供試品溶液的制備 取葛黃顆粒10 g，加100 ml水和6 ml鹽酸，置電爐上加熱微沸30 min，濾過，用乙醚提取2次，每次25 ml，合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇2 ml溶解，即得。

2.4.2 對照藥材溶液的制備 取黨參對照藥材1 g，按照“2.4.1”項下的方法制備對照藥材溶液。

2.4.3 陰性樣品溶液的制備 取葛黃顆粒缺黨參陰性樣品，按照“2.4.1”項下的方法制備陰性樣品溶液。

2.4.4 試驗方法 吸取“2.4.1”項下的供試品溶液5 μl、“2.4.2”項下的對照藥材溶液10 μl、“2.4.3”項下的陰性樣品溶液5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（10∶7∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱顯色。

2.4.5 試驗結(jié)果 供試品色譜中，檢出黨參對照藥材的斑點，陰性無干擾。見圖4。

圖4 葛黃顆粒中黨參TLC圖

2.5 射干苷HPLC鑒別

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸（15∶85）；流速：1 ml/min；波長：265 nm；柱溫：40℃。

2.5.2 對照品溶液 取14.01 mg射干苷，加70%乙醇制得濃度為0.5604 mg/ml的溶液，備用。精密量取射干苷備用液0.4 ml，加70%乙醇稀釋至10 ml，搖勻，制得濃度為22.42 μg/ml的對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液 精密稱取葛黃顆粒2.0 g，置圓底燒瓶中，加50 ml水，稱定重量，回流30 min，放冷，稱重，補足重量，搖勻，濾過，通過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5.4 陰性樣品溶液 精密稱取缺葛花樣品2.0 g，按“2.5.3”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.5.5 專屬性考察 取“2.5.2”“2.5.3”“2.5.4”項下溶液10 μl，按“2.5.1”項下色譜條件測定。結(jié)果顯示，葛黃顆粒供試品溶液可以檢出射干苷色譜峰，分離度良好，且陰性無干擾。見圖5。本方法專屬性良好。

圖5 葛黃顆粒HPLC圖譜

2.5.6 線性關(guān)系考察 精密稱取射干苷14.01 mg，加70%乙醇制成濃度為0.5604 mg/ml射干苷貯備液。分別精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml射干苷貯備液定容至10 ml，分別制成濃度為5.60、11.21、22.42、44.83、89.66、179.33、358.66 μg/ml的溶液。按“2.5.1”項下色譜條件測定，以峰面積（A）為縱坐標（Y），射干苷濃度（μg/ml）為橫坐標（X），得到回歸方程：Y=41 165X+20 654，r2=0.9993（n=7）。

2.5.7 精密度 取“2.5.2”項下射干苷溶液（濃度：22.42 μg/ml）10 μl，連續(xù)進樣，共6次，得RSD為1.32%（n=6）。表明精密度符合要求。

2.5.8 重復(fù)性 取葛黃顆粒6份，每份2.0 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，測定，得RSD為0.11%（n=6）。表明分析方法重復(fù)性良好。

2.5.9 穩(wěn)定性 取葛黃顆粒2.0 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法制成供試品溶液，立即測定，再于室溫放置2、4、6、8、12、24 h進樣，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.07%。表明本品穩(wěn)定性良好。

2.5.10 加樣回收率 取葛黃顆粒9份，各1.0 g，精密稱定，每三份為一組，分別加入射干苷對照品溶液（濃度為0.589 mg/ml）1.0、2.0、3.0 ml，按“2.5.3”項方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果射干苷平均回收率為101.19%，RSD為1.50%。見表1。表明本方法準確可靠。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.5.11 樣品的含量 測定3批葛黃顆粒（批號：20200122、20200123、20200124），按“2.5”項下方法制備、測定，計算其含量。結(jié)果三批樣品中射干苷分別為1.17、1.16、1.09 mg/g，平均含量為1.14 mg/g。制劑中指標性成分的含量按80%設(shè)限，初步擬訂葛黃顆粒中射干苷的含量不得少于0.9 mg/g，各批樣品含量均符合要求。

3 討論

3.1 薄層鑒別

采用TLC對白芍、丹參、黨參、虎杖進行定性鑒別，結(jié)果斑點清晰，分離度好，專屬性強，可以作為葛黃顆粒質(zhì)量控制方法。

對于丹參的薄層鑒別，水溶性成分丹酚酸B因其光熱不穩(wěn)定、易降解、易氧化的特性，所以未選擇丹酚酸B進行鑒別[1]。而丹參的水提液中酚酸類物質(zhì)丹參素，常以鈉鹽形式存在，所以選擇丹參素鈉來鑒別葛黃顆粒中的丹參。在研究中發(fā)現(xiàn)，在薄層色譜顯色時，置氨蒸氣中熏后，放置檢視，發(fā)現(xiàn)薄層斑點受氣溫、放置時間等因素影響，因此冬天環(huán)境溫度較低時，薄層顯色時可以適當延長放置時間，升高環(huán)境溫度使斑點更清晰。

文獻報道，大黃素對脂肪肝有一定的防治作用[2-3]；白芍可以減少肝細胞水腫和壞死，減輕肝細胞病變程度，保護酒精性肝損傷[4]。因此，選擇虎杖（大黃素）、白芍（芍藥苷）進行鑒別。結(jié)果虎杖、白芍薄層色譜斑點清晰，且陰性樣品無干擾，可以作為葛黃顆粒的鑒別指標。

對于葛黃顆粒中其他藥味，鹽澤瀉其主要成分23-乙酰澤瀉醇B，遇熱轉(zhuǎn)化成澤瀉醇A[5]；柴胡其主要活性成分為柴胡皂苷，柴胡皂苷d進入煎液后有可能轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b2[6]；趕黃草（含熊果酸、沒食子酸、槲皮素）[7-8]，與處方中藥味山楂（含熊果酸）[9]、白芍（含沒食子酸）[10]、虎杖（含槲皮素）[11]，可能會相互影響，陰性出現(xiàn)干擾；白術(shù)薄層色譜陰性有干擾。綜上，沒有選擇鹽澤瀉、柴胡、趕黃草、山楂、白術(shù)作為葛黃顆粒的鑒別指標，須進一步研究。

3.2 含量測定

葛黃顆粒中君藥葛花，是我國傳統(tǒng)解酒中藥，具有較強的解酒保肝作用，臨床應(yīng)用常為解酒制劑的主要原料。葛花中黃酮類成分含量最高，也是葛花的主要活性成分，包括射干苷、葛花苷、次葛花苷、鳶尾黃素等[12]?，F(xiàn)代藥理作用表明，葛花具有解酒護肝、影響乙醇吸收代謝、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用[13]。射干苷作為葛花主要活性成分之一，性質(zhì)穩(wěn)定，適于作為含量測定指標[14]；其他黃酮類成分受產(chǎn)地等因素影響，含量差異較大。因此，葛黃顆粒選擇射干苷作為含量測定指標。

本研究比較了不同比例流動相對峰型、分離度的影響，如乙腈-0.2%磷酸（20∶80）[15]、乙腈-0.2%磷酸（17∶83）、乙腈-0.2%磷酸（15∶85），最終確定流動相為乙腈-0.2%磷酸（15∶85）時射干苷峰型及分離度較好。同時供試品溶液制備方法考察結(jié)果表明，回流提取方法優(yōu)于超聲提取，且30 min即可提取完全。

本研究建立了葛黃顆粒黨參、丹參（丹參素鈉）、白芍（芍藥苷）、虎杖（大黃素）的薄層鑒別方法及主要有效成分射干苷的含量測定方法，可用于該制劑質(zhì)量控制。