通絡(luò)明目膏對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮生長因子表達的影響

凌梓韻 陳麗華▲ 李靄燕 吳小桃

1.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院眼科，廣東廣州 511400；2.廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 511400

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）為患病率較高的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，其發(fā)生率為24%～70%[1]，若不及時治療可能造成不可逆性視功能受損。DR的發(fā)病機制較為復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為其發(fā)生、發(fā)展與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量異常密切相關(guān)，其可促使血管內(nèi)皮細胞不斷被增殖分化，進而誘使血管新生[2]。因此，探討安全有效的方法抑制視網(wǎng)膜新生血管形成是DR治療的內(nèi)容之一。中醫(yī)學(xué)認為，DR早期多是由于氣陰兩虛所致，而隨著病程延長會逐步發(fā)展為陰陽兩虛、氣滯血瘀[3]。通絡(luò)明目膏為廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院（我院）的院內(nèi)方，具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、通絡(luò)明目的功效，符合DR的中醫(yī)辨證論治原則?，F(xiàn)為進一步明確通絡(luò)明目膏治療DR的可能機制，本研究從VEGF角度，觀察通絡(luò)明目膏對DR大鼠的治療作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選擇60只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級多雷（sprague dawley，SD）大鼠[許可證號：SYXK（粵）2020-0102]，均為雄性，體重200～250 g，平均（225.93±15.52）g，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心統(tǒng)一飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18℃～20℃，濕度50%～60%，應(yīng)用實驗用鼠維持飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司）、三級清潔用水喂養(yǎng)，自由攝食飲水。所有實驗大鼠均經(jīng)眼部檢查證實無異常，無全身器質(zhì)性病變。本研究獲得廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，可開展研究。

1.2 藥物和試劑

通絡(luò)明目膏經(jīng)我院中藥房制作，其組方為：葛根、生地、熟地、雞血藤、茯苓、淮山各20 g，黨參、黃芪、決明子、青箱子、菊花、茺蔚子、谷精草、麥冬各15 g，玄參、丹參、柴胡、瓜蔞皮、牡丹皮、澤瀉各12 g，山茱萸、田七各10 g，法半夏、陳皮各6 g，山楂、五味子、當歸各5 g，龜甲膠、黃明膠各2 g。羥苯磺酸鈣膠囊（北京京豐制藥，批準文號：H20010795）；Streptozocin 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）。

大鼠胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1，IGF-1R）ELISA試劑盒（通蔚生物，批號：193001-14-8）；大鼠ET-1 ELISA試劑盒（科順生物，貨號：KS10931）；大鼠VEGF ELISA試劑盒（上海今品化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號：KS15297）；大鼠VEGFR-2/KDR ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：KS15373）；兔抗大鼠VEGFA/VEGF多克隆抗體（美國LifeSpan Biosciences，貨號LS-C210581）；VEGFR2多克隆抗體（上海澤葉生物科技有限公司，貨號：KS12000）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 以隨機數(shù)表法將納入研究的60只實驗大鼠分成空白組（n=10）、模型組（n=10）、陽性對照組（n=10）、通絡(luò)明目膏低劑量組（n=10）、通絡(luò)明目膏中劑量組（n=10）、通絡(luò)明目膏高劑量組（n=10）。

1.3.2 建模 除了空白組，其余小組均通過應(yīng)用2%鏈脲佐菌素，并給予高脂高糖飲食以建立DR大鼠模型。具體方法：各組在實驗前先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，建模前禁食12 h，除空白組外的其余5組大鼠經(jīng)腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素。3 d后檢測各組大鼠的空腹血糖，如果結(jié)果顯示＞16.7 mmol/L，提示大鼠糖尿病模型建立成功。各組每天均給予眼底檢測，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜有血管擴張或有血管瘤形成等眼底血管異常，且持續(xù)1周，提示DR建模成功。

1.3.3 藥物干預(yù)方法 確定DR大鼠建模成功后，通絡(luò)明目膏低劑量組、通絡(luò)明目膏中劑量組、通絡(luò)明目膏高劑量組分別灌胃10、40、60 mg/（kg·d）通絡(luò)明目膏，陽性對照組灌胃等效劑量100 mg/（kg·d）的羥苯磺酸鈣膠囊，模型組、空白組灌胃等量蒸餾水，干預(yù)12周。

1.4 觀察指標

①干預(yù)12周后，比較各組大鼠外周血血清胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）、VEGF表達量。先對大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉將其麻醉，取大鼠腹主動脈血，進行離心處理（離心速率3000 r/min，15 min）取血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。②干預(yù)12周后，比較各組大鼠視網(wǎng)膜組織中血管內(nèi)皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）、VEGF表達情況。以斷頭法將大鼠處死，取大鼠右眼或左眼置于4%多聚甲醛溶液固定，進行脫水→石蠟→包埋→切片，應(yīng)用免疫組化法檢測，即先對石蠟切片進行脫蠟→梯度乙醇脫水→用3%過氧化氫酶氧化將切片上的內(nèi)源性過氧化物酶清除→滴加一抗，孵育24 h→滴加二抗，孵育2 h→顯色，復(fù)染→梯度乙醇脫水和封片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，并應(yīng)用Image-proplus 6.0圖像分析處理軟件計算VEGFR-2、VEGF陽性表達水平。③病理學(xué)觀察：取“②”中各組的石蠟切片進行HE染色，在光鏡下觀察各組視網(wǎng)膜病理改變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析。計數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IGF-1、ET-1、VEGF和視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF陽性表達情況比較

干預(yù)12周后，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF陽性表達以及血清IGF-1、ET-1、VEGF表達量顯著高于其他5組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。通絡(luò)明目膏低劑量組的血清IGF-1、ET-1、VEGF表達量及視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR-2陽性表達較陽性對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；通絡(luò)明目膏中劑量組的血清IGF-1、ET-1、VEGF表達量及視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR-2陽性表達與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）；通絡(luò)明目膏高劑量組的血清IGF-1、ET-1、VEGF表達量及視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR-2陽性表達低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見表1。

表1 各組血清IGF-1、ET-1、VEGF和視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR-2陽性表達情況比較

2.2 病理學(xué)觀察結(jié)果

鏡檢下顯示，空白組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰分明，見細胞齊整，無顯著異常，見圖1；模型組大鼠的視網(wǎng)膜內(nèi)各層組織結(jié)構(gòu)紋理稀松，顆粒排列無規(guī)律，微血管舒張，血管壁扭曲，組織中重度水腫，內(nèi)皮細胞增生，見圖2；陽性對照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，視桿視錐細胞排列齊整。管壁變厚，且見內(nèi)皮細胞增生，大鼠視網(wǎng)膜組織略有水腫，見圖3；通絡(luò)明目膏低劑量組大鼠視網(wǎng)膜細胞排列基本有一定的規(guī)律，組織水腫程度相對減輕，見視網(wǎng)膜色素上皮細胞有破裂，視網(wǎng)膜下出血，見圖4；通絡(luò)明目膏中劑量組大鼠視網(wǎng)膜細胞排列較齊整，各個層次的結(jié)果清楚可見，微血管舒張減輕，管壁增厚，組織水腫減輕，見圖5；通絡(luò)明目膏高劑量組大鼠視網(wǎng)膜各層次次齊整清楚，組織水腫不明顯，微血管舒張不明顯，管壁增厚，見圖6。

圖1 空白組（HE染色，×200）

圖2 模型組（HE染色，×200）

圖3 陽性對照組（HE染色，×200）

圖4 通絡(luò)明目膏低劑量組（HE染色，×200）

圖5 通絡(luò)明目膏中劑量組（HE染色，×200）

圖6 通絡(luò)明目膏高劑量組（HE染色，×200）

3 討論

DR屬于糖尿病性微血管改變，大量研究報道其病理特征主要是視網(wǎng)膜血管異常生長[4-5]。VEGF作為促血管生成因子，可與VEGFR-2相結(jié)合，以增加促血管生成活性。無論是臨床研究還是動物實驗均有報道，DR個體尤其是視網(wǎng)膜組織呈VEGF高表達[6-7]。VEGF可經(jīng)自分泌或者是旁分泌途徑特異性與血管內(nèi)皮生長因子受體連接，介導(dǎo)內(nèi)皮細胞活化，進而促使微血管滲透性升高，引起血管新生[8]。在健康狀況下，哺乳類動物的視網(wǎng)膜組織VEGF呈低表達，以保證視網(wǎng)膜局部血管完整性，但當VEGF過度表達時，可促使新生血管形成[9]。除此之外，機體中還有很多細胞因子、生長因子參與到新生血管形成過程中，如IGF-1[10]、ET-1等[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF陽性表達以及血清IGF-1、ET-1、VEGF較空白組升高，與馬莉等[12]研究結(jié)果相吻合，提示DR的視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF、VEGFR-2及其他促血管生成因子呈高表達。

在中醫(yī)學(xué)中，DR可歸于“暴盲”“消渴目病”的范疇。在中醫(yī)的長久理論和實踐研究下，對于DR的病因病機層面，相關(guān)專業(yè)人士基本已形成共識，為“先天不足，后天失養(yǎng)，致陰虧內(nèi)熱，傷津耗氣，肝腎虧虛；因虛致瘀，脈絡(luò)瘀阻，目竅失養(yǎng)”，氣陰兩虛、血瘀分別為病癥本、標，兩者相互作用[13]。我院自制的通絡(luò)明目膏主治絡(luò)脈瘀阻、氣陰兩虛型DR，藥膏中含有的山茱萸、熟地、麥冬、龜甲膠、黃明膠等均為滋陰類中藥，能夠滋陰補肝腎；牡丹皮、生地、玄參等不僅能夠滋陰，還可降虛火；田七、雞血藤、當歸、丹參、山楂等均為活血化瘀類中藥，可活血通絡(luò)散瘀；菊花、決明子、谷精草、青箱子均有清熱明目功效，再配伍柴胡、葛根，利用其升陽的作用使諸藥循經(jīng)上行，藥效直達病處；諸藥合用起到活血化瘀、通絡(luò)明目、益氣養(yǎng)陰的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)也報道[14]，三七、丹參、山楂均能夠改善血管內(nèi)皮功能，使血液黏稠度降低，并可抑制各種原因所致的血管通透性升高。熟地黃、山萸肉、黃芪、黨參等也有一定的抗氧化能力；菊花可以降低局部組織微血管密度，改善微循環(huán)[15]。本研究對DR大鼠分別予以羥苯磺酸鈣膠囊和通絡(luò)明目膏干預(yù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以通絡(luò)明目膏中劑量干預(yù)的大鼠血清IGF-1、ET-1、VEGF水平及視網(wǎng)膜組織VEGFR-2、VEGF陽性表達與羥苯磺酸鈣膠囊干預(yù)大鼠比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），而通絡(luò)明目膏高劑量干預(yù)的大鼠血清IGF-1、ET-1、VEGF水平及視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR-2陽性表達較羥苯磺酸鈣膠囊干預(yù)大鼠降低（P＜ 0.05），提示應(yīng)用高劑量通絡(luò)明目膏治療DR能夠通過降低促血管生成因子過度表達，抑制視網(wǎng)膜血管生成，改善視網(wǎng)膜病變，且療效與劑量呈正相關(guān)。

綜上，糖尿病大鼠的外周血和視網(wǎng)膜組織內(nèi)存在VEGF過量表達，而經(jīng)高劑量通絡(luò)明目膏干預(yù)后能夠顯著改善視網(wǎng)膜微血管變化，發(fā)揮視網(wǎng)膜保護作用，但其具體作用機制需進一步驗證。