毛葉木姜子嫩果香氣成分不同萃取方法的比較

劉雙雙，梁淼，謝雅婷，馮亮，楊艷，余愛農(nóng)*

(1.湖北民族大學 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學 化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000)

毛葉木姜子(LitseamollisHemsl.)又稱山胡椒、木姜子、大木姜，為樟科(Lauraceae)木姜子屬，在我國主要分布于廣東、湖北、四川等地，是我國特有的香料植物資源之一[1]。在中國西南部，毛葉木姜子的嫩果可以用醬油、醋、胡椒、大蒜和姜腌制成開胃涼菜或者提取其揮發(fā)油作為食物的調(diào)味料[2]，也可以作為天然殺菌料復合于食品調(diào)味料中，達到殺菌防腐、協(xié)調(diào)風味的多重效果，具有抗菌、鎮(zhèn)咳、祛痰作用[3]。

作為一種香辛料，其香氣對于產(chǎn)品加工至關(guān)重要。毛葉木姜子嫩果所呈現(xiàn)的香氣會顯著影響消費者對其的接受程度，提取方法的不同會導致不同香氣成分的呈現(xiàn)與分布。目前，香氣成分的主要萃取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑輔助風味蒸發(fā)法和頂空固相微萃取法。陳漢平等[4]首次采用精密分餾結(jié)合硅膠柱層析和氣相層析從成熟毛葉木姜子果實精油中分離出21種揮發(fā)性成分；瞿萬云等[5]采用正交實驗法探究了超臨界CO2萃取毛葉木姜子果實揮發(fā)油的最佳提取條件；林翠梧等[6]、Huang等[7]通過水蒸氣蒸餾法從毛葉木姜子葉和枝的揮發(fā)油中分別鑒定出41種和39種揮發(fā)性成分。但是，作為我國西南地區(qū)普遍食用的開胃涼菜——毛葉木姜子嫩果的香氣成分的研究還未見報道。

本文采用SDE和HS-SPME兩種方法提取毛葉木姜子嫩果中的揮發(fā)性物質(zhì)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對香氣風味物質(zhì)進行檢測，比較兩種萃取方法所提取的毛葉木姜子嫩果香氣成分的差異和萃取特點，為進一步研究毛葉木姜子特征風味組分提供了理論依據(jù)，同時研究毛葉木姜子中風味化合物的組成，加快毛葉木姜子相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化進程。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

毛葉木姜子嫩果于2019年5月采集于湖北恩施龍洞河(海拔550 m)，經(jīng)湖北民族大學林學園藝學院易詠梅教授鑒定為樟科毛葉木姜子。

氯化鈉、二氯甲烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；1-辛醇(≥98%)：美國Supelco公司、C7～C30 正構(gòu)烷烴：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器和設(shè)備

JYZ-E16 榨汁機、高速破壁調(diào)理機 九陽股份有限公司；同時蒸餾萃取裝置 上海方畦儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Avanti J-30Ⅰ冷凍高速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；6890N/5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；Concept多功能樣品前處理系統(tǒng) 德國PAS 公司；數(shù)顯磁力攪拌恒溫電熱套 天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 同時蒸餾萃取

取50.0 g樣品加入200 mL蒸餾水于破壁機中破壁5 min后置于500 mL圓底磨口燒瓶中，并加入磁力攪拌子，置于裝置樣品端；另取一支干凈的250 mL圓底磨口燒瓶，加入60 mL二氯甲烷，接于裝置溶劑端。將裝置通入冷凝水(4 ℃)，加熱蒸餾萃取，樣品端控制樣品處于微沸狀態(tài)；溶劑端設(shè)定溫度為50 ℃，蒸餾萃取3 h，冷卻，取二氯甲烷萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去二氯甲烷，得到萃取物約1.0 mL。

1.3.2 頂空固相微萃取

取100.0 g毛葉木姜子果實樣品解凍至室溫后立即榨汁過篩(200目)后取10.0 mL于萃取瓶中，加入2.0 g NaCl和磁力攪拌子，于50 ℃下平衡30 min，萃取36 min，解吸2 min。

1.3.3 GC-MS 分析

采用DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度 250 ℃；起始柱溫 40 ℃，保持 4 min；以 5 ℃/min 升溫至 260 ℃；以 15 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 1 min；載氣(He)流速 1 mL/min；HS-SPME不分流進樣，SDE分流進樣，分流比 50∶1。MS：離子源溫度 250 ℃；電子轟擊(EI)模式；電子能量 70 eV；質(zhì)量掃描范圍 40～550 u；掃描方式為全掃描；調(diào)諧文件為標準調(diào)諧。

1.3.4 定性定量分析

1.3.4.1 定性分析

用3種方法對毛葉木姜子嫩果香氣成分進行定性分析，首先，根據(jù) NIST 08 數(shù)據(jù)庫對譜圖進行初步檢索及質(zhì)譜分析；其次，根據(jù)測定的保留指數(shù)(RI)，與文獻報道的保留指數(shù)進行比對輔助定性；最后，用標準物質(zhì)輔助定性。保留指數(shù)以 C7～C30 正構(gòu)烷烴混合物單獨進樣，其前處理及 GC-MS 分析方法與樣品處理一致。

1.3.4.2 定量分析

對毛葉木姜子揮發(fā)性成分分離鑒定時采用內(nèi)標法進行定量，內(nèi)標物為1-辛醇標準品的乙醇溶液(1.570 7 g/L)。根據(jù)1-辛醇的質(zhì)量濃度和各樣品中1-辛醇峰面積的比值進行比較。根據(jù)公式(1)計算出揮發(fā)性成分的量，每個樣品重復3次實驗，取平均值。

(1)

式中：xi為組分含量，μg/L；ms為內(nèi)標化合物質(zhì)量濃度，μg/L；Ai為化合物的峰面積；As為內(nèi)標物峰面積；fi為待測組分(i)對內(nèi)標物(s)的質(zhì)量校正因子，令其為1。

1.3.5 香氣活度值(OAV)的計算

根據(jù)毛葉木姜子香氣成分的含量，以及各化合物在水中的氣味閾值來計算OAV值。

(2)

式中：ρ為該化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；OT為該化合物在水中的氣味閾值，μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛葉木姜子中揮發(fā)性風味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果

采用GC-MS法檢測毛葉木姜子嫩果樣品中的揮發(fā)性風味成分，采用HS-SPME法和SDE法提取毛葉木姜子中揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖，見圖1；經(jīng)MS/RI定量，香氣成分及其含量見表1。

圖1 SDE及HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatograms of volatile flavor substances extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由圖1可知，SDE法與HS-SPME法提取的毛葉木姜子嫩果揮發(fā)性成分有一定的差異，兩種提取方法均可提取到含量較高的α-檸檬醛、β-檸檬醛，但保留時間在10～15 min之間含量最高的化合物分別為樅油烯和桉葉醇。HS-SPME在保留時間10～20 min之間提取到的化合物數(shù)量較多且含量高，由表1可知多為單萜類化合物；而SDE法的提取物中檢測到的分子量比較大的化合物在HS-SPME提取法中未檢測到。

表1 SDE與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中的香氣化合物Table 1 Aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

續(xù) 表

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結(jié)合表1中數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 GC-MS 分析，SDE法和HS-SPME法提取共檢出毛葉木姜子鍵合態(tài)揮發(fā)性成分88種，包括醇類3種，萜烯類40種，含氧萜類32種，酯類4種和其他類9種，其中SDE法檢測到50種揮發(fā)性化合物，HS-SPME法檢測到71種化合物，兩種提取方法共同檢測到的化合物有33種。

表2 SDE法與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中香氣化合物的種類和濃度占比Table 2 Types and concentration percentages of aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由表1和表2可知，經(jīng)SDE提取法提取，產(chǎn)物經(jīng)GC-MS檢測，共檢測到醇類1種、萜烯類22種、含氧萜類16種、酯類3種和其他類8種，其中含氧萜類(65.79%)和萜烯類(28.24%)含量較高。含量較高的化合物主要包括樅油烯、石竹烯、芳樟醇、β-檸檬醛、α-檸檬醛、4-羥基龍腦烷等；用HS-SPME法提取時，共檢測到醇類2種、萜烯類35種、含氧萜類28種、酯類3種和其他類3種，此種方法提取到的化合物數(shù)量較多，但濃度較高的只有含氧萜類化合物，由萜醇、萜醛、萜酯等組成，占總化合物濃度的93.72%，為毛葉木姜子嫩果提供了許多獨特的風味。其中，含量較高的化合物有桉葉醇、橙花醇、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛等。萜類化合物通過特定植物組織中的類異戊二烯途徑分泌，是影響水果特性的最重要的芳香化合物[8]。

SDE提取法萜烯類化合物雖然種類較少，但是含量高于HS-SPME提取法的化合物濃度，尤其是樅油烯、α-蒎烯、β-蒎烯。樅油烯多存在于野花椒等香料的精油中，α-蒎烯、β-蒎烯是天然存在的雙環(huán)單萜烯的最重要骨架。SDE法提取的溫度較高，而含氧萜類化合物在高溫下易脫水、重排形成萜烯類化合物，因此存在于大多數(shù)樟科屬植物中的桉葉醇只在提取條件較溫和的HS-SPME法提取中檢出。HS-SPME提取法對大多數(shù)含氧萜類提取效果較好，尤其是萜醇類化合物；而SDE提取法對一些高沸點和分子量較大的揮發(fā)性物質(zhì)提取更有優(yōu)勢，如亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸乙酯、9,12-十八酸乙酯等，這類化合物在HS-SPME中下提取均未檢測到。

毛葉木姜子嫩果香氣成分濃度對比見圖2。結(jié)果顯示：SDE提取法的萜烯類和酯類化合物雖數(shù)量少但其濃度均高于HS-SPME提取法的化合物濃度；HS-SPME提取法含氧萜類數(shù)量及濃度均高于SDE提取法，主要包括萜醇、萜醛和萜酯等。采用HS-SPME法提取的醇類、萜類、酯類物質(zhì)種類較多，而SDE法對中低沸點物質(zhì)的提取更有優(yōu)勢，這可能是由于SDE的高溫長時間處理造成部分熱敏性揮發(fā)性物質(zhì)被氧化、分解[9]。

圖2 SDE法與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果香氣成分濃度對比Fig.2 Comparison of concentrations of aroma components extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

2.2 不同提取方法香氣成分香氣活度分析

為了評估各種揮發(fā)性化合物對毛葉木姜子嫩果果實的香氣貢獻，用化合物濃度的平均值和水中的氣味閾值來計算OAV值。當OAV值大于1.0時，揮發(fā)性組分才被認為對香氣有貢獻。兩種萃取方法香氣描述及分類見表3。

表3 SDE與HS-SPME提取的揮發(fā)性成分香氣特征及香氣活度值Table 3 Aroma characteristics and odor activity values of volatile components extracted by SDE and HS-SPME

續(xù) 表

由表3可知，兩種提取方法共檢出88種游離態(tài)揮發(fā)性化合物，其中36種具有明確香氣特征，包括1種醇類，10種萜烯類、18種含氧萜類、2種酯類和5種其他類化合物。在SDE提取法下，有24種組分的OAV>1，其中對毛葉木姜子嫩果香氣貢獻較大的有α-蒎烯、β-水芹烯、β-蒎烯、石竹烯、芳樟醇、香茅醛、(R)-香茅醛、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛、甲基庚酮、亞麻酸等；在HS-SPME提取法下，也有24種組分的OAV>1，其中對毛葉木姜子嫩果香氣貢獻較大的有α-蒎烯、α-水芹烯、對甲苯、桉葉醇、芳樟醇、香茅醛、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛和甲基庚酮等。由此可見萜類化合物對毛葉木姜子香氣起到了主要貢獻作用。兩種提取方法下α-檸檬醛和β-檸檬醛香氣活度值最高，賦予毛葉木姜子嫩果柑橘、檸檬香氣，由于HS-SPME提取法下這兩種化合物濃度均遠高于SDE法，因此其果香香氣更顯著；其次是芳樟醇，它是一種重要的水果和花卉萜醇類化合物，通常通過水解、氧化還原反應和重排產(chǎn)生，由于其香氣閾值較低，因此對毛葉木姜子嫩果香氣貢獻較大，使毛葉木姜子嫩果呈現(xiàn)鈴蘭、柑橘和葡萄的香氣[11]；香葉醇賦予其花香和果香。甲基庚酮是番茄紅素、α-金合歡烯、檸檬醛或共軛三醇的氧化副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物，呈現(xiàn)果香和青草味[12]。SDE提取法下的α-蒎烯香氣活度值較高，使毛葉木姜子嫩果呈現(xiàn)樟腦味、松樹味[13]，石竹烯主要存在于胡椒和一些香料中，呈現(xiàn)甜香和木香[14]，由于SDE提取法下的石竹烯含量較高，因此SDE法提取下的毛葉木姜子嫩果的甜香和木香特征比HS-SPME提取法下的更顯著；HS-SPME提取法在毛葉木姜子中檢測到的桉葉醇使其具有桉樹的氣味[15]；而對甲苯則使毛葉木姜子具有辛辣、霉味等令人不愉快的氣味[16]。

化合物的氣味描述取決于氣味濃度，通常也用不同的特征方向來描述氣味，見圖 3。

圖3 兩種提取方法下香氣特征雷達圖Fig.3 Aroma characteristic radar diagram under two extraction methods

將化合物分為甜香、花香、木香、果香、草本香和化學味，得到兩種提取方法下毛葉木姜子芳香化合物的香氣特征。由圖3可知，SDE提取法下的木香、甜香、化學味更顯著，主要來自于α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯的貢獻，化學味主要來自亞麻酸產(chǎn)生的脂肪味[17]；HS-SPME提取法下果香和花香更顯著，主要來自芳樟醇、香茅醛、α-檸檬醛、香葉醇、β-檸檬醛的貢獻。相比之下，HS-SPME提取的香氣化合物更貼近毛葉木姜子的原始風味。

3 結(jié)論

采用兩種不同的樣品前處理方法對毛葉木姜子嫩果中游離態(tài)揮發(fā)性化合物進行了提取，并結(jié)合GC-MS分析技術(shù)經(jīng)RI/MS定性共得到88種香氣成分。其中SDE法和HS-SPME法分別檢測到50種和71種化合物，兩種提取方法共同檢測到的化合物有33種，含量較高的化合物主要有α-檸檬醛、β-檸檬醛、α-蒎烯、β-蒎烯、香葉醇等。SDE法和HS-SPME法提取的香氣成分均以含氧萜類為主，分別占總濃度的65.79%和93.72%。

兩種方法所提取的揮發(fā)性風味物質(zhì)有一定差異，共36種化合物具有明確香氣特征。SDE提取法下對香氣貢獻較大的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯，因此其木香、甜香以及化學味較顯著；而HS-SPME提取法下的果香和花香更顯著，對香氣貢獻較大的化合物有芳樟醇、香茅醛、α-檸檬醛、香葉醇以及β-檸檬醛等。

SDE法提取溫度較高，對分子量較大的化合物提取效果較好，但一些重要的萜類化合物容易轉(zhuǎn)化分解，造成香氣損失，而HS-SPME法提取條件溫和，萜類物質(zhì)不易發(fā)生轉(zhuǎn)化，接近毛葉木姜子的原始風味，因此較適用于毛葉木姜子嫩果香氣成分的分析研究。