復合納米抗菌肽防治羊皮下膿腫病的效果

王 平，韓曉芳，郭子記，李錦旗，張 利，趙 鵬，張宇豪，華 松

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.榆林市榆陽區(qū)畜牧技術(shù)推廣站，陜西榆林 719000；3.榆林市榆陽區(qū)畜牧獸醫(yī)局，陜西榆林 719000；4.榆林市府谷縣動物疫病預防控制中心，陜西榆林 719400)

羊皮下膿腫病傳染性強，發(fā)病率高，病程長，傳播范圍廣，各個品系的綿羊、山羊都易感染，患羊的皮下膿腫形成后會持續(xù)增大，臨床表現(xiàn)為面部、頸部、胸腹部和尻部等淋巴結(jié)部位腫大，因此，常規(guī)抗菌藥物對該病治療效果不佳，且容易產(chǎn)生耐藥性。不僅造成飼料浪費，增加養(yǎng)殖成本，而且威脅到公共衛(wèi)生健康，帶來的經(jīng)濟損失不可小覷。羊皮下膿腫病例在全國各地均有報道，大多數(shù)養(yǎng)殖場的綿羊和山羊膿腫病發(fā)病率為2%～7%，部分養(yǎng)殖場可達20%以上。近年來，由于各地大力發(fā)展畜牧業(yè)，全國各地羊流動頻繁，該病的發(fā)病率有逐漸提高的趨勢。發(fā)病以1歲左右的羊居多，發(fā)病率隨年齡的增大而升高，該病無明顯的季節(jié)性規(guī)律，但以夏秋季為主[1]。環(huán)境致病菌的持續(xù)存在和羊群皮膚的機械性損傷是導致羊皮下膿腫病的主要誘因。經(jīng)過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室對甘肅、陜西兩省幾十家養(yǎng)殖場進行羊皮下膿腫病的分離、純化，發(fā)現(xiàn)致病菌主要為偽結(jié)核棒狀桿菌和金黃色葡萄球菌兩種。此外，金黃色葡萄球菌還是肉兔養(yǎng)殖中常見的病原菌，感染兔后引起局部膿腫及其他炎癥，癥狀同羊相似。目前，金黃色葡萄球菌是極易產(chǎn)生耐藥性的皮下膿腫病病原菌，幾乎可以對所有的抗生素產(chǎn)生耐藥性[2]。

隨著抗生素殘留以及病原菌耐藥現(xiàn)象的加劇，抗菌藥物無論在新藥物研發(fā)還是避免耐藥性的研究中均遇到了瓶頸[3]?？咕谋环Q為天然的抗生素，具有抗菌譜廣、無殘留，不易產(chǎn)生耐藥性，并且能夠調(diào)節(jié)胃腸道菌群，改善機體的免疫力，保護機體免遭病原菌侵害。目前抗菌肽用作飼料添加劑，預防疾病，改善腸道菌群以及增強免疫力等方面已經(jīng)取得較好效果。本試驗所用的復合納米抗菌肽，其抗菌活性強于單一的成份[4]，并且利用醫(yī)藥級的納米材料進行包被，使其具有耐高溫、耐強酸、易溶于水等優(yōu)勢[5]，已被證明對金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、梭菌和李氏桿菌等常見致病菌有強烈的抑制和殺滅作用。鑒于目前尚未有抗菌肽對羊皮下膿腫病的動物試驗和應用研究方面的報道，本研究通過對羊皮下膿腫病組織樣本分離到的金黃色葡萄球菌進行抗菌肽體外抑菌活性測試，同時開展試驗兔及羊皮下膿腫病的防治試驗，以期為抗菌肽替代抗生素用于防治動物皮下膿腫病提供實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株是從湖羊皮下膿腫病組織樣本中分離、純化所得，經(jīng)過基因測序確定為金黃色葡萄球菌；營養(yǎng)瓊脂(NB)、MH培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；復合納米抗菌肽(由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室贈送)；試驗動物成年健康雌性家兔及全價兔糧購自西安交大實驗動物中心。

1.2 常用抗生素對金黃色葡萄球菌的藥物敏感性試驗

將高壓滅菌好的MH瓊脂培養(yǎng)基無菌操作分裝到直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿平均分裝15～20 mL，使用棉簽蘸取0.5麥氏比濁的菌，在培養(yǎng)皿中分3 次密集劃線，使菌落均勻分布于培養(yǎng)基表面；用鑷子取藥敏片，置于培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。每種藥品做3 個平行，試驗重復3 次。培養(yǎng)24 h后，每個抑菌圈測量3 次，取平均值，結(jié)果判定依據(jù)藥敏試驗執(zhí)行標準CLSI(2015版)。

1.3 抗菌肽對金黃色葡萄球菌的體外抑菌試驗

1.3.1 微量稀釋法最小抑菌濃度測定 稱取 1.0 g抗菌肽溶于2 mL蒸餾水中并混勻，以轉(zhuǎn)速 12 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。配制0.5麥氏比濁度菌液，取出一塊新的無菌的96孔板，從第1 至第10孔分別加入50 μL的MH液體培養(yǎng)基；之后在第一孔中加入50 μL抗菌肽，輕輕混勻后，從第一孔吸取50 μL加入第二孔中，依次類推，到第十孔混勻后吸取50 μL棄掉；最后在第1至第10孔分別加入50 μL菌液，稀釋后的質(zhì)量濃度依次呈現(xiàn)10個梯度(125 000 μg/mL、 62 500 μg/mL、31 250 μg/mL、15 625 μg/mL、 7 812 μg/mL、3 906 μg/mL、1 953 μg/mL、976 μg/mL、488 μg/mL、244 μg/mL)，最后置于 37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察生長情況。

1.3.2 瓊脂擴散抑菌圈法細菌活化 挑取單菌落于液體BHI培養(yǎng)基中，220 r/min震蕩培養(yǎng) 4 h；稀釋菌液：取培養(yǎng)的菌液用生理鹽水稀釋至 0.5麥氏比濁濃度；1/2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制：按18.0 g/L的比例稱取營養(yǎng)肉湯粉培養(yǎng)基，高壓滅菌后取出，備用，待培養(yǎng)基冷卻至40 ℃時加入 1 mL菌液(1.5×108CFU/mL)，隨后立即倒入培養(yǎng)皿中冷卻凝固，備用。使用牛津杯(內(nèi)徑 6 mm，外經(jīng)8 mm，高10 mm)在剛剛冷卻的培養(yǎng)基中間打孔；加藥：吸取抗菌肽原液50 μL滴于打好的孔中，設(shè)置3 個平行，置于恒溫箱中培養(yǎng)，每隔4 h測量抑菌圈直徑，并利用藥物敏感性較好的紅霉素藥敏片進行對照。測量后對同一抑菌圈直徑取平均值，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示，用SPSS 18.0軟件進行兩獨立樣本的t檢驗。

1.4 家兔致病模型的構(gòu)建及防治試驗

1.4.1 動物飼養(yǎng) 所有試驗兔飼喂在同一條件下(溫度18 ℃，濕度30%，環(huán)境干凈、舒適、通風良好)，抗菌肽飼喂量參照本品在牛羊豬上的推薦量(50 g抗菌肽兌1 000 kg飼料)，每只試驗兔每日飼喂飼料180 g，自由飲水。

1.4.2 試驗設(shè)計 按照表1將所有試驗兔分組，分別設(shè)置預防組、治療組、陽性對照組及健康對照組。

(1)預防組：①抗菌肽飼喂，將抗菌肽溶于無菌水中，按照每日飼料比重0.005%的量，使用1 mL無針頭注射管灌服。提前1 周開始每日灌服1 次；②攻毒：參照江煒等[6]對每只試驗兔后頸部皮下注射2×109CFU/mL×1 mL的菌，且使用對數(shù)期菌株來保證細菌活性；③測量皮下膿腫：從攻毒第2 天起，每隔2 d對每只試驗兔進行膿腫測量(縱向直徑的長度)，同時觀察試驗兔的精神狀態(tài)。

(2)治療組：①攻毒(同上)；②抗菌肽飼喂：攻毒后第2天時開始灌服飼喂抗菌肽，比例為每日飼料比重的0.01%；③測量皮下膿腫；④病理切片制作與觀察：采集化膿灶周圍皮膚組織以及發(fā)生明顯病變的實質(zhì)性臟器組織制作組織切片，使用正置顯微鏡進行切片觀察，照片拍攝使用Motic Images plus 2.0軟件。

(3)陽性對照組：①攻毒(同上)；②測量皮下膿腫。

(4)健康對照組：后頸部注射生理鹽水，且正常飼喂兔糧。

表1 金黃色葡萄球菌試驗兔分組Table 1 Rabbit grouping for S.aureus test

1.5 抗菌肽防治羊皮下膿腫病試驗

試驗地點位于甘肅省與陜西省部分湖羊養(yǎng)殖場，防治試驗包括6 個羊場和6 個合作社，共計12 個養(yǎng)殖單元，1 614 只湖羊，預防試驗和治療試驗各6 個養(yǎng)殖單元，每個試驗平均分成試驗組與對照組。(1)預防試驗：經(jīng)過兩名獸醫(yī)的全身肉眼觀察，結(jié)合觸摸檢查，確定無皮下膿腫的羊，羊只月齡大小不限，50 g納米抗菌肽兌1 000 kg精料補充料飼喂試驗組羊，將單純的精料補充料飼喂對照組羊，試驗周期為5 個月，期間觀察、統(tǒng)計羊皮下膿腫病的發(fā)病情況。(2)治療試驗：經(jīng)獸醫(yī)確定有明顯皮下膿腫的羊，先采用外科手術(shù)除膿，分成試驗組和對照組；試驗組羊，用100 g納米抗菌肽兌1 000 kg的精料補充料進行飼喂；對照組羊，僅飼喂精料補充料，試驗周期為1個月，期間測量膿腫的大小，統(tǒng)計其恢復程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的抗生素藥敏結(jié)果

為了更好地了解這些地區(qū)金黃色葡萄球菌對常用抗菌藥物的耐藥性，使用臨床上最常用的8 種抗生素進行金黃色葡萄球菌藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)所有菌株均對青霉素G高度耐藥，其次耐藥率較高的為苯唑西林、頭孢氨芐和氨芐西林，耐藥率分別達到61.1%、61.1%和44.4%(表2)。

表2 金黃色葡萄球菌的抗生素耐藥率Table 2 Antibiotic resistance rate of S.aureus %

2.2 復合納米抗菌肽的體外抑菌試驗

微量稀釋法培養(yǎng)細菌18 h后，發(fā)現(xiàn)從第七個孔開始有細菌繁殖，說明第6 個孔為抑制細菌生長的最低藥物濃度，因此，該復合抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為3 900 μg/mL；瓊脂擴散法抑菌圈直徑如表3所示，抑菌圈直徑隨時間延長逐漸增大，24 h后抑菌圈最為明顯。按照抗菌肽的效價計算公式U= 2X×1 000×N,[其中：X=(D-6)/2.1；D表示抑菌圈直徑，N為稀釋倍數(shù)，單位為mm]，得出抗菌肽的效價 U=1.3×107。此外，還發(fā)現(xiàn)抗菌肽產(chǎn)生的抑菌圈明顯大于紅霉素藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈。

表3 抑菌圈直徑Table 3 Inhibition zone diametermm mm

2.3 試驗兔皮下膿腫病的預防與治療

2.3.1 預防結(jié)果 皮下膿腫直徑變化：預防組兔注射致病菌后，除初期表現(xiàn)短暫的精神沉郁外無任何不良臨床癥狀，試驗兔連續(xù)16 d均未出現(xiàn)皮下膿腫(圖1)，說明抗菌肽對金黃色葡萄球菌感染具有較好的預防效果。

圖1 金黃色葡萄球菌皮下膿腫直徑變化Fig.1 Changes in diameter of pustule diameter caused by S.aureus

2.3.2 治療結(jié)果 ①皮下膿腫直徑變化：治療組與陽性對照組試驗兔致病24 h后，后頸部出現(xiàn)不同程度的皮下膿腫，隨著時間延長膿腫逐漸增大，6～8 d時膿腫的直徑最大為13 cm(圖2)，具有波動性；②治療效果：治療組試驗兔飼喂抗菌肽后皮下膿腫愈合較快，并于14 d時膿腫被完全治愈。而在陽性對照組，膿腫逐漸變軟，并且大部分膿腫破裂，對這些兔的皮下膿腫進行外科手術(shù)處理，兩周后傷口愈合，但是隨后陸續(xù)有明顯的復發(fā)。③病理切片觀察：對治療組兔進行皮膚及肺臟病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)皮膚出現(xiàn)炎性細胞浸潤(圖2-a)；肺部病變明顯，肺組織出現(xiàn)大量炎性細胞，并發(fā)生大范圍的出血性浸潤(圖2-c)。而經(jīng)過抗菌肽治療后的皮膚組織(圖2-b)與肺臟(圖2-d)恢復 良好。

a.致病試驗兔皮膚組織內(nèi)見中性粒細胞浸潤(白色箭頭所示)；b.抗菌肽治療組試驗兔治療后的皮膚上皮組織恢復正常；c.致病試驗兔肺出血，肺泡腔大小不一，毛細血管小動脈擴張充血，肺泡內(nèi)和肺泡間分布有密集的紅細胞(白色箭頭所示)；d.抗菌肽治療組試驗兔恢復后的肺組織

2.4 羊皮下膿腫病防治效果

2.4.1 預防試驗 預防試驗過程中發(fā)現(xiàn)，試驗組發(fā)病羊數(shù)為5，發(fā)病率為0.6%(5/834)，而對照組發(fā)病羊數(shù)為97，發(fā)病率為12.4%(97/780)，采用抗菌肽預防后羊皮下膿腫發(fā)病率明顯低于對照組(表4)，預防效果顯著。

表4 抗菌肽防治羊皮下膿腫病的試驗結(jié)果Table 4 Experimental results of antimicrobial peptides in prevention and treatment of sheep abscess

2.4.2 治療試驗 將220只具有明顯皮下膿腫的育肥羊進行分組飼喂，試驗組飼喂納米抗菌肽，同時結(jié)合簡單外科手術(shù)排膿消毒處理，另一組對照進行常規(guī)飼喂，也結(jié)合外科手術(shù)排膿處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用抗菌肽治療的羊，14 d內(nèi)治愈率為95.5%(105/110)，而對照組羊14 d內(nèi)治愈率為36.4%(40/110)，21 d內(nèi)治愈率為57.3% (63/110)，28 d內(nèi)治愈率為83.6%(92/110)，但是在隨后的3個月時間內(nèi)，對照組羊皮下膿腫病的復發(fā)率為77.3%(85/110)，而試驗組無羊發(fā)生皮下膿腫病(表4)。圖3為試驗組羊皮下膿腫病治療前后的代表性圖片。

a與c.治療前羊皮下膿腫發(fā)病圖；b與d.抗菌肽治療后膿腫明顯減小

3 討 論

羊皮下膿腫病是一種慢性消耗性疾病，嚴重影響著養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。而金黃色葡萄球菌是皮下膿腫病的主要病原之一，2019年張斯旂等[7]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌在羊皮下膿腫組織樣本中的分離率為26.3%，為主要優(yōu)勢菌株，除了可引起羊皮膚化膿性炎癥[8]外，還可引起羊乳房炎、肺炎、偽膜性腸炎等疾病[9]，可導致病癥反復發(fā)作，羊群終身帶?。魂P(guān)于金黃色葡萄球菌在其他動物上的病例報道也比較多，例如家禽關(guān)節(jié)腫脹[10]、肉牛[11]、肉兔皮下膿腫[12]及豬關(guān)節(jié)膿腫病[13]等。此外，該菌還極易產(chǎn)生抗生素耐藥性。筆者前期對從羊皮下膿腫病樣本分離到的金黃色葡萄球菌進行抗生素藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)該菌對青霉素全部耐藥，其次對苯唑西林、頭孢氨芐和氨芐西林，耐藥率均達到44%以上，對慶大霉素的耐藥率也達到22.2%，該結(jié)果同王登峰等[14]以及燕霞[15]關(guān)于金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥情況報道相似。因此，采用抗生素治療羊皮下膿腫病的效果很不理想。在國家號召養(yǎng)殖端減抗、限抗的同時，開發(fā)高效、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代品十分必要。

2018年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定印發(fā)了《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案(2018-2021年)》，明確規(guī)定減少抗菌類藥物及相應藥物飼料添加劑的使用，并于2020年全面禁止藥物飼料添加劑的使用，這勢必導致在養(yǎng)殖端起防病、促生長作用的抗生素退出市場，那么抗生素替代物的研究與應用成為新的熱點。迄今關(guān)于抗生素替代物包括抗菌肽、中草藥[16]和植物精油[17]等，其中抗菌肽具有廣譜抑菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性、綠色無公害，提高機體免疫力和抗應激等優(yōu)勢，引起了社會的廣泛關(guān)注。

抗菌肽被稱為天然的抗生素，具備較高的抗菌活性，其殺菌機制主要是通過靜電吸附與細菌細胞膜作用，通過物理學作用殺滅致病菌，不易產(chǎn)生耐藥性；除了保護機體免遭病原菌侵害之外，還能促進幼齡畜禽的生長發(fā)育。更重要的是，抗菌肽是通過靶向作用于致病菌，而對胃腸道正常菌群具有促進和調(diào)控作用。試驗過程中測得復合納米抗菌肽對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為 3 900 μg/mL，抗菌效價U=1.3×107，同伍小松等[18]測試天蠶素抗菌肽的最小抑菌濃度相似，然而與許君茹等[19]報道的結(jié)果差異較大，可能與抗菌肽的純度、成份以及包被的材料有關(guān)[18]；本試驗中測得抗菌肽抑菌圈為40 mm，該結(jié)果同張麗等[20]報道的結(jié)果一致。在同等條件下，試驗過程中利用復合納米抗菌肽的抑菌圈直徑超過敏感性最高的紅霉素藥敏片的最大抑菌圈直徑，因此，抑菌效果強于普通抗生素。

近年來，有關(guān)抗菌肽應用于畜牧業(yè)中的報道逐漸增多，在飼料添加劑，預防疾病，改善腸道菌群，增強免疫力等方面已經(jīng)取得較好效果。例如經(jīng)過優(yōu)化后的抗菌肽替代豬精液稀釋液中的抗菌藥，解決了多藥耐藥傳播的問題[21]；張萌萌[22]通過對腸道菌群的豐富度以及差異性分析發(fā)現(xiàn)，抗菌肽CC34酵母培養(yǎng)物可促進瘤胃蠕動并增加免疫力；注射抗菌肽使腸絨毛吸收面積增大，提高了飼料的轉(zhuǎn)化率[23]；呂月琴等[24]證明，每只奶牛的混合日糧添加10 g的抗菌肽即可提高奶牛產(chǎn)奶量、控制乳汁體細胞數(shù)量且提升乳制品質(zhì)量。

羊皮下膿腫病發(fā)生于綿羊和山羊，發(fā)病率為2%～7%，部分養(yǎng)殖場可達到20%以上，金黃色葡萄球菌是主要致病菌之一。金黃色葡萄球菌也是兔子皮下膿腫病的罪魁禍首。為了探究抗菌肽在防治動物皮下膿腫病的效果，本試驗除了檢測抗菌肽的體外抑菌活性外，還進行了動物試驗研究，以及實踐應用。從試驗兔皮下膿腫的致病特點及病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，羊皮下膿腫病病原金黃色葡萄球菌在試驗兔與羊皮下膿腫的表現(xiàn)形式一致，均表現(xiàn)為發(fā)病前期膿腫逐漸擴大、腫脹、硬度增大，局部溫度升高，發(fā)病中期具有波動性，發(fā)病后期膿腫出現(xiàn)破潰，因此利用試驗兔進行前期試驗具有可行性。本試驗兔皮下膿腫致病菌量是參照試驗鼠的皮下膿腫模型致病菌量按照體質(zhì)量換算所得，通過預試驗確定使用2×109CFU/mL×1 mL的金黃色葡萄球菌菌量致病，采用后頸部皮下注射的方式注射，從結(jié)果來看，該菌量形成的皮下膿腫發(fā)病率高，且試驗兔沒有出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象。

抗菌肽可以中和內(nèi)毒素，減輕由內(nèi)毒素、磷壁酸引起的炎癥反應。金黃色葡萄球菌致病后16 d的病理切片顯示，皮膚組織炎癥反應和肺組織出血明顯，這可能與金黃色葡萄球菌致試驗兔感染后，皮膚組織結(jié)構(gòu)被破壞以及金黃色葡萄球菌分泌的黏附素、細胞毒素及溶血性外毒素有關(guān)[25]。而通過飼喂抗菌肽進行治療，發(fā)現(xiàn)在皮下膿腫恢復后，病理學切片觀察到的皮膚組織結(jié)構(gòu)也恢復正常。Herath等[26]證明，抗菌肽能夠使內(nèi)毒素炎癥信號分子從單層轉(zhuǎn)為多層聚合體，散失其破壞離子通道的能力，或者干擾內(nèi)毒素與炎癥信號分子的細胞膜受體CD14結(jié)合等機制，抑制炎癥的發(fā)生?？傮w來說，抗菌肽是通過誘導炎癥信號分子失衡減輕病原刺激給機體帶來的損傷。結(jié)合抗菌肽對試驗兔及羊皮下膿腫的防治效果來看，抗菌肽不僅可以預防羊金黃色葡萄球菌發(fā)生皮下膿腫病，同時還具有治療的功能，因此，抗菌肽可以作為飼料添加劑，應用于羊皮下膿腫病的預防和治療。