高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定紅曲米中10 種真菌毒素含量

朱偉堃，井改革，趙蕊蕊，畢天琛，趙丹彤，王素香，劉延娟

（山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東 菏澤 274000）

紅曲米又名赤曲、紅米、福米等，是我國傳統(tǒng)藥食兩用的代表中藥［1］。紅曲米是以蒸至半熟的粳米為原料，接種曲霉科真菌紫色紅曲霉Monascus purpurenusWent. 等菌種，經(jīng)發(fā)酵而成［2］。研究表明，紅曲米發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生莫納可林類（如洛伐他汀等）、甾醇類、紅曲色素等多種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物具有預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、調(diào)脂等藥理活性［3-5］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、發(fā)酵食品、食品添加劑等領(lǐng)域。紅曲米作為富含淀粉的發(fā)酵類谷物，紅曲米的原料、發(fā)酵過程、貯存運(yùn)輸過程等均面臨著被真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。糧谷類［6-7］及淀粉基質(zhì)的中藥材及其炮制品［8-9］中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、伏馬毒素、T-2 毒素（T-2）等真菌毒素易超出限量標(biāo)準(zhǔn)。通風(fēng)干燥的條件下，薏苡仁中黃曲霉毒素B1（AFB1）和黃曲霉毒素B2（AFB2）含量會(huì)大幅增加；高溫高濕及通風(fēng)干燥的條件下，薏苡仁中ZEN含量迅速增加［10］。真菌毒素具有較強(qiáng)致癌、致畸及肝腎毒性［11-12］，有必要建立高效、準(zhǔn)確的檢測方法以篩查紅曲米中的真菌毒素，確保食用和藥用安全。目前，對(duì)紅曲米中真菌毒素的研究較少，且多集中于桔霉素和赭曲霉毒素等［1，13］。2020 年版《中國藥典（四部）》中列出了真菌毒素單獨(dú)或聯(lián)合測定的分析方法［8］。但中藥基質(zhì)復(fù)雜，不同基質(zhì)樣品會(huì)導(dǎo)致其分析方法不同［14］。參考《中國藥典（四部）》方法［8］，本研究中采用固相萃取柱凈化，建立了同時(shí)測定紅曲米中 AFB1，AFB2，T - 2，DON，ZEN 及黃曲霉毒素 G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、赭曲霉毒素A（OTA）10 種真菌毒素含量的高效液相色譜譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，為紅曲米中真菌毒素的檢測提供了參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司），API4000 型電噴霧三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Finnigan 公司）；XS105 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；PRD -S-Q277 型超聲波清洗器（杭州超聲波有限公司，功率為600 W，頻率為42 kHz）；HY - 4型調(diào)速多用振蕩器（金壇市江南儀器廠）；3K15 型離心機(jī)（德國Sigma 公司）；TTL - DCⅡ型氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；Milli - Q 型超純水儀（美國Merk Millipore公司）。

1.2 試藥

10 種真菌毒素混合對(duì)照品溶液（天津阿爾塔科技有限公司，批號(hào)為S076583，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2，T - 2，DON，OTA，ZEN 的質(zhì)量濃度分別為0.04，0.02，0.04，0.02，0.4，0.4，0.4，10.0，0.04，0.1 μg/ mL，純度為 99.9%，99.3%，99.0%，98.4%，99.0%，98.5%，99.0%，99.9%，99.9%，99.9%）；真菌毒素六合一免疫親和柱（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為O0924AZNOTF，規(guī)格6 mL，柱容量AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 為 300 ng，F(xiàn)B1 和 FB2 為 5 000 ng，T - 2 為 1 000 ng，DON 為 2 000 ng，OTA 為 100 ng，ZEN為1 000 ng）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購于美國Merk 公司；氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、吐溫20、冰醋酸均為分析純，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；玻璃纖維濾紙（英國Whatman 公司，型號(hào)934 - AH，孔徑1.5 μm）；12 批紅曲米及其炮制品（市售，編號(hào)1-3 和編號(hào)7-9 為紅曲米飲片，編號(hào)4-6 為紅曲米藥材，編號(hào)10 - 12 為紅曲米炭；編號(hào)1 - 6 和編號(hào)10-11 產(chǎn)地為福建，編號(hào)7-9 產(chǎn)地為安徽，編號(hào)12產(chǎn)地為河北），經(jīng)山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院趙丹彤副主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A 為 0.01% 甲酸，B 為含 0.1% 甲酸的乙腈 - 甲醇（1∶1，V/V），梯度洗脫（0～2.0 min 時(shí)5%B，2.0～2.1 min 時(shí) 5%B → 40%B，2.1～7.0 min 時(shí)40%B → 55%B，7.0～10.0 min 時(shí) 55%B → 90%B，10.0～10.5 min 時(shí) 90%B → 5%B，10.5～13.0 min 時(shí)5%B）。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測、正負(fù)離子模式掃描；霧化氣：氮?dú)?；霧化氣流速：10.0 L /min；離子源溫度：300 ℃；脫溶劑氣溫度：300 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；碰撞氣：氬氣。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 10種真菌毒素質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry acquisition parameters of 10 mycotoxins

2.2 溶液制備

樣品前處理：精密稱取樣品粉末6.25 g（過2 號(hào)篩），精密加入80%乙腈溶液（含1%乙酸）25 mL，搖床劇烈振蕩（轉(zhuǎn)速為250 r / min）20 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）5 min，移取上清液；向殘?jiān)芯芗尤?0%甲醇溶液25 mL，搖床劇烈振蕩（轉(zhuǎn)速為250 r / min）20 min，離心（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）5 min，移取上清液，合并2次上清液，混勻，精密量取5 mL，加入35 mL 稀釋液（NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 1.16 g），混勻，用玻璃纖維濾紙濾過。精密量取濾液32 mL，緩緩?fù)ㄟ^已處理好的免疫親和柱，依次用0.1%吐溫20水溶液、水各10 mL 洗脫，待液體排干后，用3 mL 含2%甲酸的甲醇溶液洗脫。洗脫方式為先上樣2 mL，堵住親和柱下方出口，靜置3 min，收集洗脫液；再上樣1 mL，堵住親和柱下方出口，靜置3 min，收集洗脫液。合并2次洗脫液，50 ℃下用氮吹儀吹干。

混合對(duì)照品溶液：分別精密量取上述10 種真菌毒素混合對(duì)照品溶液 25，50，125，250，500 μL，分別置5 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液1-5。

空白基質(zhì)溶液：經(jīng)前期測定結(jié)果顯示，樣品（編號(hào)為8號(hào)）未檢出10種真菌毒素，取5份作為空白基質(zhì)，按樣品前處理方法處理空白樣品，精密量取混合對(duì)照品溶液1-5 各2 mL，混勻，用0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別為空白基質(zhì)溶液1-5。

供試品溶液：取樣品，按樣品前處理方法處理，精密加入50%甲醇溶液2 mL，混勻，用0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下空白基質(zhì)溶液1-5，按2.1項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣檢測，典型總離子流圖見圖1，提取離子對(duì)色譜圖見圖2。以10 種真菌毒素的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。詳見表2。

圖1 10種真菌毒素典型總離子流圖Fig.1 Typical total ion chromatograms of 10 mycotoxins

圖2 10種真菌毒素提取離子對(duì)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖Fig.2 HPLC-MS/MS chromatograms of extracted ion pairs of 10 mycotoxins

檢測限和定量限確定：取2.2項(xiàng)下空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋，按3 倍信噪比（S/N）計(jì)算檢測限、10 倍S/N計(jì)算定量限。結(jié)果見表2。

表2 10種真菌毒素線性關(guān)系考察與檢測限及定量限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOD and LOQ of 10 mycotoxins

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取空白基質(zhì)適量，分別加入2.2 項(xiàng)下10 種真菌毒素混合對(duì)照品溶液0.25，0.625，2.5 mL，制成低、中、高3個(gè)濃度的樣品加樣回收試驗(yàn)溶液，按2.1 項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，各平行3 次，結(jié)果10 種真菌毒素的平均加樣回收率均在60%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于6.00%（n= 9），表明方法準(zhǔn)確度良好。詳見表3。

表3 10種真菌毒素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（%，n=9）Tab.3 Results of the recovery test of 10 mycotoxins（%，n=9）

重復(fù)性試驗(yàn)：取加樣回收試驗(yàn)項(xiàng)下中濃度樣品加樣回收試驗(yàn)溶液，平行制備6 份，按2.1 項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2，T-2，OTA，DON，ZEN 的平均含量及RSD分別為2.75，1.87，2.87，1.65，33.60，38.92，38.29，3.79，1 007.23，8.83 μg/ kg，RSD分 別 為 4.89%，3.76%，3.20%，3.80%，1.49%，1.95%，1.81%，4.25%，1.53%，1.51%，表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下空白基質(zhì)溶液3，按2.1 項(xiàng)下檢測條件連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果10 種真菌毒素峰面積的RSD在0.30%～1.97%（n= 5）間，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取加樣回收試驗(yàn)項(xiàng)下中濃度加樣加收試驗(yàn)溶液，于室溫下放置0，6，12，18，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣檢測，記錄10種真菌毒素的峰面積。結(jié)果 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2，T - 2，OTA，DON，ZEN 峰面積的RSD均小于4.0%，分別為2.06%，1.83%，2.98%，1.10%，2.57%，2.06%，1.76%，2.17%，3.00%，2.99%（n= 5），表明待測樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品含量測定

取12 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2 份，按2.1 項(xiàng)下檢測條件進(jìn)樣測定，采用空白基質(zhì)溶液匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算10種真菌毒素的含量。結(jié)果12批樣品中AFB2，AFG1，F(xiàn)B1，T - 2，DON，OTA 6 種真菌毒素均未檢出，AFB1，AFG2，F(xiàn)B2，ZEN 的檢出情況見表4。

表4 12批樣品中真菌毒素含量測定結(jié)果（μg/kg，n=2）Tab.4 Results of the content determination of mycotoxins in the 12 batches of samples（μg/kg，n=2）

3 討論

3.1 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

2020年版《中國藥典（四部）》中，多種真菌毒素的測定方法均以0.01%甲酸為流動(dòng)相A，以乙腈-甲醇（1∶1，V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫［8］。但該條件下AFG2 的響應(yīng)值過低，且DON 出峰時(shí)間過早，峰形較差。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定以0.01%甲酸為流動(dòng)相A，以含0.1%甲酸的乙腈 - 甲醇（1∶1，V/V）為流動(dòng)相B，梯度洗脫，可獲得滿意結(jié)果。

按2020年版《中國藥典（四部）》多種真菌毒素的測定方法提供的質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)OTA 在原負(fù)離子模式下響應(yīng)值過低，不利于檢測，后參考藥典中單獨(dú)測定OTA 的質(zhì)譜條件，正離子模式下OTA 的響應(yīng)值顯著提高，可獲得較好的檢測結(jié)果。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

提取液中加入一定量的鹽，并使提取液pH 保持中性或偏酸性，可提取完全真菌毒素［14］。預(yù)試驗(yàn)中，采用原標(biāo)準(zhǔn)中70%甲醇進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)OTA，DON，ZEN 等的提取效率較低，參考文獻(xiàn)［14-16］和2020年版《中國藥典（四部）》中ZEN 的提取溶劑，采用偏酸性溶液進(jìn)行提取，可獲得較高回收率。

在通過固相萃取柱凈化時(shí)，供試品溶液顏色較深，僅用水無法有效脫去樣品中的色素，影響檢測結(jié)果，采用0.1%吐溫20水溶液可顯著提高洗脫效率，并減少色素雜峰的影響。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

取2.2 項(xiàng)下50%甲醇配制的系列混合對(duì)照品溶液和空白基質(zhì)溶液，分別按2.1 項(xiàng)下檢測條件檢測，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比較基質(zhì)/溶劑2 種標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值來判斷某種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)是增強(qiáng)還是減弱。斜率比值大于1 為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，斜率比值小于1為基質(zhì)效應(yīng)減弱。結(jié)果AFG1 和AFG2 的基質(zhì)效應(yīng)不明顯，AFB1，ZEN，DON呈基質(zhì)減弱效應(yīng)，OTA，AFB2，T-2，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2 均呈基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。可見，超過60%的真菌毒素均受基質(zhì)效應(yīng)的影響，故最終確定以空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

3.4 樣品檢測結(jié)果分析

由檢測結(jié)果可知，雖有部分樣品檢出，但均符合2020 年版《中國藥典》（一部）中的規(guī)定，薏苡仁中AFB1不得過5 μg/kg，AFB1，AFB2，AFG1，AFG2總量不得過10 μg/kg，ZEN 不得過500 μg/kg［17］，谷物及其制品中ZEN 的限量標(biāo)準(zhǔn)不得過 60 μg/kg［18］，12 批樣品中ZEN的殘留量均符合限量要求。我國尚未制訂伏馬毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)嬰幼兒玉米制品中伏馬毒素的總量（含F(xiàn)B1+FB2）不得過200 μg/kg［19］，12 批樣品均符合要求。

紅曲米及其炮制品受真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)較小，但也可能是本研究中收集的樣品量較少、覆蓋范圍較小，今后將擴(kuò)大樣品收集范圍，進(jìn)一步深入研究。本研究中建立的方法可同時(shí)測定紅曲米中10種真菌毒素，為紅曲米及其炮制品加工、運(yùn)輸、貯藏過程中的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和監(jiān)測提供技術(shù)支持。