外泌體非編碼RNA在腫瘤化療耐藥中作用的研究進展

付巖松，董博南 ，耿淑慧 ，孟祥寧 ，朱 靜，*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)中國遺傳資源保護與疾病防控教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081)

癌癥是最兇險的疾病之一，每年威脅著全世界數(shù)千萬人的健康，在過去十幾年中持續(xù)進展。近些年由于人口老齡化、工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的進程逐漸加快，加上慢性感染、不健康生活方式、環(huán)境暴露等原因，癌癥發(fā)病率不斷上升。目前對于癌癥的治療主要包括手術(shù)、放化療和免疫療法等。腫瘤化療耐藥性分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，原發(fā)性耐藥是指初始治療就出現(xiàn)癌癥逃避。臨床上，指在開始治療后腫瘤沒有縮小的無反應(yīng)者，被認為是由于預(yù)先存在的基因突變或未經(jīng)治療的腫瘤內(nèi)耐藥細胞狀態(tài)引起的內(nèi)在耐藥性，或細胞快速適應(yīng)治療的能力，即適應(yīng)性抵抗。獲得性耐藥指最初對治療有反應(yīng)的腫瘤在進行長期治療后出現(xiàn)的耐藥性，也就是說腫瘤經(jīng)抗腫瘤化療藥治療緩解后，由于某些腫瘤細胞基因產(chǎn)生變異，對該抗癌藥不再敏感的特性。腫瘤耐藥是腫瘤化療治療中的一個重大挑戰(zhàn)。腫瘤耐藥新機制、耐藥標(biāo)志物以及逆轉(zhuǎn)耐藥新靶點和新方法的研究是提高腫瘤治療療效的關(guān)鍵。

外泌體是多泡體(multivesicular bodis，MVBs)與細胞膜融合后釋放的納米級細胞外囊泡，粒徑范圍為30~150 nm。外泌體由脂質(zhì)雙層膜和原始細胞的眾多分子組成，存在于血液、尿液、腹水和羊水等體液中。液體活檢是指一種新型無創(chuàng)性的以血液為主的體液標(biāo)本中對細胞及核酸的檢測方式，這種檢測能提供預(yù)后以及對腫瘤治療方案的應(yīng)答性等信息，目前，在癌癥患者的外周血中，對循環(huán)游離核酸(circulating free DNA，cfDNA)、循環(huán)游離微小核糖核酸(circulating free microRNA，cf-miRNA)和外泌體的檢測，成為了主要的液體活檢方法[1]。腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體可以被受體細胞吸收，參與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中腫瘤細胞與其他基質(zhì)細胞間的相互作用過程，包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞。腫瘤來源的外泌體含有大量的核糖核酸，目前發(fā)現(xiàn)的比較重要的成分是微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNA)。這些ncRNA通過參與受體細胞中的相關(guān)信號通路，異常調(diào)節(jié)上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和血管生成相關(guān)分子的表達。一方面，這些被包裝進外泌體的RNA可以破壞次級器官和組織部位的微環(huán)境，促進非惡性組織表現(xiàn)出逐漸增加的致瘤異質(zhì)性，并促進轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成。另一方面，免疫細胞來源的外泌體RNA 在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，它們對T 細胞、B細胞和其他免疫細胞的組成和激活有一定的影響，由于免疫調(diào)節(jié)作用的復(fù)雜性，腫瘤細胞與免疫細胞之間會發(fā)生激烈的對抗，使得腫瘤細胞最終可能會獲得治療耐藥性[2]。外泌體是ncRNA的天然載體，具有體外和體內(nèi)相容性，其運輸ncRNA進入細胞可調(diào)節(jié)耐藥。由于外泌體特殊的膜結(jié)構(gòu)能夠保護其內(nèi)部的RNA 免受酶的降解，因此，外泌體中各類RNA 的含量相對于體液RNA 來說更為穩(wěn)定。來源于外泌體的ncRNA，稱之為外泌體ncRNA。外泌體ncRNA通過參與藥物外排、調(diào)節(jié)信號通路和修飾腫瘤微環(huán)境來影響耐藥。本文就外泌體miRNA、外泌體lncRNA以及外泌體circRNA等在不同腫瘤和不同耐藥反應(yīng)中的作用、耐藥相關(guān)機制以及潛在的臨床應(yīng)用展開綜述。

1 外泌體miRNA介導(dǎo)腫瘤細胞耐藥

miRNAs 是一種約19~24 個核苷酸的非編碼小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions，3′-UTR)互補序列相互結(jié)合，降解mRNA或抑制mRNA翻譯。miRNA介導(dǎo)的基因表達對細胞應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激的反應(yīng)至關(guān)重要，如饑餓、缺氧、藥物處理、氧化應(yīng)激和DNA 損傷，所以miRNA 表達失調(diào)與癌癥的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。研究證明miRNA 可以被外泌體包裹，其進入外泌體的機制目前有4 種：①中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)依賴性途徑；②蘇素化核不均一核糖核蛋白(hnRNPs)依賴性途徑；③miRNA序列3′末端依賴性途徑；④miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISC)相關(guān)途徑[4]。Kosaka 等[4]發(fā)現(xiàn)miRNA的分泌是由神經(jīng)酰胺生物合成緊密調(diào)節(jié)的，包裹在外泌體中的細胞外miRNA 可以被輸送到受體細胞中，作為具有生理功能的分子，通過與細胞內(nèi)miRNA相同的機制發(fā)揮基因沉默作用。目前報道的外泌體miRNA參與介導(dǎo)的腫瘤化療耐藥主要見于細胞毒類藥物，比如作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的順鉑、奧沙利鉑、替莫唑胺，影響核酸形成的5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他濱，作用于有絲分裂M期干擾微管蛋白合成的紫杉醇以及作用于核酸轉(zhuǎn)錄的阿霉素等。

1.1 外泌體miRNA與順鉑耐藥

癌癥相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是位于腫瘤塊內(nèi)或附近的成纖維細胞，是腫瘤基質(zhì)的重要細胞成分，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。順鉑是多種腫瘤化療的核心或一線藥物，但順鉑耐藥是其化療治療中面臨的主要挑戰(zhàn)。Qin等[5]對頭頸癌(head and neck cancer，HNC)順鉑耐藥進行研究，發(fā)現(xiàn)CAFs 以及CAF 來源的外泌體在調(diào)控順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。在hnRNPA1 蛋白等介導(dǎo)下，miR-196a 包裝到CAFs 外泌體。CAFs 外泌體可以轉(zhuǎn)移miR-196a 到受體HNC 細胞，賦予其化療耐藥性和侵襲性。外泌體miR-196a 通過靶向HNC 微環(huán)境中的CDKN1B和ING5促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。而從CAFs中去除外泌體miR-196a則可以恢復(fù)HNC細胞對順鉑的應(yīng)答。此外臨床樣本中血漿外泌體miR-196a 與較差的總生存率和藥物敏感性相關(guān)。因此，外泌體miR-196a 可能成為HNC順鉑耐藥的預(yù)后因子和潛在治療靶點。而在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中，Zhang 等[6]則發(fā)現(xiàn)NSCLC 來源的CAFs 細胞通過轉(zhuǎn)移外泌體miRNA-130a 到受體NSCLC細胞，使其發(fā)生順鉑耐藥。

1.2 外泌體miRNA與奧沙利鉑耐藥

基于奧沙利鉑藥物的聯(lián)合化療是治療晚期結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)等惡性腫瘤的一線化療方案。Liu 等[7]發(fā)現(xiàn)人正常結(jié)直腸黏膜細胞的外泌體可以有效地將miR-128-3p包裹，并將miR-128-3p傳遞到奧沙利鉑耐藥細胞中，提高CRC 細胞對奧沙利鉑的應(yīng)答。miR-128-3p 的過表達上調(diào)E-鈣黏蛋白水平，并通過抑制Bmi1表達，抑制耐藥細胞EMT；同時通過抑制藥物轉(zhuǎn)運體MRP5的表達，降低奧沙利鉑的外排，提高CRC 細胞對奧沙利鉑的敏感性，miR-128-3p 可能是奧沙利鉑基礎(chǔ)化療的一個有前景的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。而在CRC奧沙利鉑化療耐藥性的另一項研究則發(fā)現(xiàn)，CRC細胞分泌外泌體miR-208b，傳遞到T細胞，靶向調(diào)控程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)基因，促進了調(diào)控性T細胞(regulatory T cells，Tregs)的擴增，進一步促進了腫瘤的增殖和奧沙利鉑的耐藥。所以外泌體miR-208b 可能是CRC對奧沙利鉑藥物反應(yīng)的預(yù)測性標(biāo)志物，也是CRC免疫治療的新靶點[8]。

1.3 外泌體miRNA與阿霉素耐藥

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，通過抑制細胞分裂和誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮抗癌作用，抗瘤譜較廣，用于治療血液系統(tǒng)腫瘤和多種實體腫瘤。BLID基因是一種新的腫瘤抑制基因，Liu等[9]證實人胃癌細胞SGC7901/ADR細胞釋放的外泌體miR-501被受體細胞吸收之后，通過下調(diào)BLID 蛋白和失活下游的caspase-9/-3 蛋白來抑制凋亡，以增強受體細胞對阿霉素的耐藥性。并且BLID 下調(diào)導(dǎo)致了Akt 的磷酸化，增強細胞的增殖、遷移和侵襲等能力，從而參與調(diào)控了細胞的惡性表型。

1.4 外泌體miRNA與替莫唑胺耐藥

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是成人最常見也是侵襲性最高的原發(fā)性惡性腦腫瘤之一，初次診斷后半數(shù)生存期很低。替莫唑胺(temozolomide，TMZ)是一種口服烷基化劑，目前作為一種有效的一線化療藥物廣泛應(yīng)用于GBM 患者的治療。Yin 等[10]發(fā)現(xiàn)來自膠質(zhì)母細胞瘤患者的循環(huán)外泌體中的miR-1238 比健康人循環(huán)外泌體中高度富集，外泌體miR-1238 轉(zhuǎn)入受體細胞后，可誘導(dǎo)替莫唑胺敏感細胞中miR-1238 表達水平上調(diào)，通過EGFR-PI3K-Akt-mTOR 通路的激活在體外和體內(nèi)引起替莫唑胺敏感細胞的部分耐藥性。

1.5 外泌體miRNA與5-FU耐藥

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，5-FU 是治療HCC 常用的化療藥物之一，由于肝癌的高復(fù)發(fā)率和對抗癌藥物的耐藥，其治療效果非常低，發(fā)病率和死亡率很高。研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞長期暴露5-FU 藥物后可上調(diào)miR-32-5p的水平，上調(diào)后的miR-32-5p被包入外泌體，然后轉(zhuǎn)移到藥物敏感細胞，敏感細胞接收miR-32-5p 后，miR-32-5P 直接靶向PTEN并激活PI3K/Akt 通路，并通過血管生成和EMT導(dǎo)致肝細胞癌多藥耐藥[11]。

1.6 外泌體miRNA與紫杉醇耐藥

研究發(fā)現(xiàn)，miR-155-5p 在胃癌MGC-803 耐紫杉醇細胞中的表達水平顯著升高，miR-155-5p的下調(diào)可以逆轉(zhuǎn)胃癌MGC-803耐藥細胞的EMT和化療耐藥表型，miR-155-5p通過外泌體從紫杉醇耐藥的胃癌細胞向敏感的癌細胞傳遞，其通過抑制GATA3和TP53INP1基因的表達，誘導(dǎo)了EMT 和化療耐藥表型。因此，靶向miR-155-5p 可能是克服紫杉醇耐藥胃癌的新策略[12]。

1.7 外泌體miRNA與吉西他濱耐藥

胰腺癌是一種高度侵襲性致死腫瘤，5 年生存率很低。20多年來，吉西他濱(gemcitabine，GEM)一直是胰腺癌治療的標(biāo)準藥物，但作為一種單一藥物，GEM 并不能完全治愈胰腺癌，常需與其他藥物進行聯(lián)合治療。Fang 等[13]證明了CAFs 對GEM具有內(nèi)在的抗性，并且CAFs 通過分泌外泌體引起胰腺癌細胞對GEM的抗性。來自CAFs的外泌體miR-106b被鄰近的癌細胞攝取，導(dǎo)致癌細胞中miR-106b 水平的增加，并且顯著抑制腫瘤抑制基因TP53INP1的表達，促進胰腺癌細胞生存和GEM 耐藥性。阻斷外泌體分泌或抑制miR-106b 水平可以逆轉(zhuǎn)化療耐藥性。因此，抑制CAFs衍生的外泌體miR-106b的轉(zhuǎn)移可能是克服胰腺癌對GEM耐藥性的有效策略。

1.8 外泌體miRNA與卡鉑耐藥

卡鉑為基礎(chǔ)的化療是卵巢癌(ovarian cancer，OVCA)患者的標(biāo)準治療方案，單藥或與紫杉醇聯(lián)用均可。Alharbi等[14]研究了miRNA 在異質(zhì)性卵巢癌細胞耐藥及其衍生的外泌體中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p、miR-21-5p和miR-891-5p在細胞中均可以促進OVCA 對卡鉑的耐藥；在機制上，miR-21-5p 通過激活糖酵解，增加ATP結(jié)合盒家族藥物轉(zhuǎn)運體ABCB6和谷胱甘肽合成酶GSHB 的表達，而miR-21-5p 和miR-891-5p 是通過參與DNA修復(fù)機制的蛋白的表達，如核仁素NUCL、XRCC5 和TPD53等。此外，他們發(fā)現(xiàn)這3 種microRNA 在外泌體中顯著富集，OVCA經(jīng)卡鉑治療后復(fù)發(fā)性患者的血漿外泌體miR-891-5p含量水平高于無復(fù)發(fā)患者，提示miR-891-5P 有可能成為卵巢癌患者的血漿標(biāo)志物，作為OCVA對卡鉑的耐藥指標(biāo)。

1.9 外泌體miRNA與甲氨蝶呤耐藥

結(jié)腸癌(colon cancer，CC)是癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因，是由腸上皮內(nèi)的局部腺瘤引起的侵襲性惡性腫瘤，并可能轉(zhuǎn)移到肝臟等器官。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一種具有高細胞毒性的葉酸類似物，目前包括MTX在內(nèi)的聯(lián)合療法用于治療多種腫瘤類型，包括乳腺癌、膀胱癌和頭頸癌、成骨肉瘤和白血病。然而，MTX在大多數(shù)結(jié)腸癌中產(chǎn)生的耐藥限制了治療的有效性。miR-24-3p在許多癌癥中被認為是化療耐藥的關(guān)鍵啟動子[15-20]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌標(biāo)志物CDX2是miR-24-3p 的下游靶基因，miR-24-3p 可以下調(diào)CDX2，CDX2又可以正調(diào)控膜鐵轉(zhuǎn)運輔助蛋白HEPH的表達，提高細胞活力和細胞克隆形成的能力，促進結(jié)腸癌細胞對甲氨蝶呤的耐藥。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-24-3p 可以通過外泌體從CAFs 直接轉(zhuǎn)移到結(jié)腸癌細胞中，導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞中CDX2 和HEPH 的表達顯著降低，促進了受體結(jié)腸癌細胞的耐藥性[21]。

1.10 外泌體miRNA與R-CHOP耐藥

彌漫大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的B細胞淋巴瘤亞型，R-CHOP是DLBCL患者的標(biāo)準治療方法，包括利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松。有研究發(fā)現(xiàn)與R-CHOP 應(yīng)答性DLBCL 患者相比，低應(yīng)答以及復(fù)發(fā)患者的外泌體濃度升高，并且外泌體內(nèi)miR-155表達上調(diào)。然而，與應(yīng)答性患者的血漿相比，低應(yīng)答以及復(fù)發(fā)患者中未觀察到miR-155的表達有顯著差異，這提示外泌體內(nèi)miR-155可能是比循環(huán)miR-155更有價值的生物標(biāo)志物，同時提示miR-155的表達豐度對R-CHOP治療反應(yīng)不佳和不良預(yù)后有重要預(yù)測作用[22]。

2 外泌體lncRNA介導(dǎo)腫瘤細胞耐藥

lncRNA 是長度超過200 個核苷酸的非蛋白編碼RNA 轉(zhuǎn)錄本，根據(jù)lncRNA 在人類基因組中的位置和特征，可以將其分為5 類：順義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、內(nèi)含子lncRNA和基因間lncRNA。lncRNA對所有已知的細胞過程發(fā)揮多種類型的調(diào)節(jié)功能，包括與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，調(diào)控靶基因的表達，越來越多的證據(jù)表明lncRNA在癌癥發(fā)展中的作用，并通過多種機制與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后和化療耐藥密切相關(guān)。lncRNA 可以借助RNA 結(jié)合蛋白等進入外泌體，發(fā)揮生物學(xué)功能。核不均一核糖核蛋白hnRNPA2B1 是一種RNA結(jié)合蛋白，在mRNA的成熟、運輸和代謝以及長鏈非編碼RNA 的基因調(diào)控等許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。hnRNPA2B1 能結(jié)合lncRNA 5′端特異種子序列(GGAG)參與lncRNA 包埋進外泌體[23]。目前研究顯示，lncRNA AGAP2-AS1、lncRNA LNMAT2、lncRNA H19 都是 5′端序列通過與hnRNPA2B1結(jié)合進入到外泌體中[24]。目前報道的外泌體lncRNA參與介導(dǎo)的腫瘤化療耐藥與microRNA 一樣也是主要見于細胞毒類藥物，比如作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的順鉑、奧沙利鉑、替莫唑胺，影響核酸形成的5-FU以及作用于核酸轉(zhuǎn)錄的阿霉素等。

2.1 外泌體lncRNA與奧沙利鉑耐藥

Ren 等[25]在體外和體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)lncRNA H19 可以增強CRC 細胞的干細胞性和奧沙利鉑耐藥性，CAFs 的H19 表達水平明顯高于NFs，并且CAFs可以將lncRNA H19轉(zhuǎn)移到鄰近的CRC 細胞，此外，CAFs 通過分泌含H19 的外泌體激活CRC 細胞的Wnt/β-catenin 信號通路促進CRC 細胞的干細胞性，導(dǎo)致了CRC細胞對奧沙利鉑的耐藥性。Hui等[26]研究表明，PGM5反義lncRNA 1(PGM5-AS1)在結(jié)腸癌中的低表達是由轉(zhuǎn)錄抑制劑GFI1B 誘導(dǎo)的，PGM5-AS1 可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和獲得性奧沙利鉑耐受，其機制一是PGM5-AS1通過招募SRSF3激活可變剪接，下調(diào)PAEP 表達，二是PGM5-AS1 也可以通過對hsa-miR-423-5p發(fā)揮海綿吸附功能上調(diào)NME1的表達。外泌體越來越多地用于藥物或功能性核酸的傳遞，從而提高了癌癥治療的有效性，他們發(fā)現(xiàn)利用外泌體包裹奧沙利鉑給藥并同時包裹PGM5-AS1可逆轉(zhuǎn)受體細胞耐藥性。

2.2 外泌體lncRNA與替莫唑胺耐藥

GBM幾乎對目前所有的治療方案都產(chǎn)生耐藥性，包括化療藥物替莫唑胺、順鉑、依托泊苷等。Li等[27]發(fā)現(xiàn)外泌體傳遞的lnc-TALC 可以重塑GBM 微環(huán)境并促進GBM 對TMZ 的耐藥。lnc-TALC 可以進入外泌體并傳遞到腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)，促進小膠質(zhì)細胞的M2極化。這種M2 極化與補體成分C5/C5a 的分泌有關(guān)，在lnc-TALC 的下游，補體與ENO1結(jié)合，促進p38 MAPK 的磷酸化。此外，C5 促進了TMZ 誘導(dǎo)的DNA 損傷的修復(fù)，導(dǎo)致化療耐藥，靶向C5a的免疫治療或許可以逆轉(zhuǎn)lnc-TALC介導(dǎo)的TMZ耐藥。這表明lnc-talc 介導(dǎo)的GBM 細胞與小膠質(zhì)細胞之間的交叉性可以減弱化療療效，并為克服GBM 中TMZ 耐藥性提供了潛在的聯(lián)合治療策略。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)SBF2-AS1在TMZ耐藥GBM細胞和組織中表達上調(diào)，過表達SBF2-AS1可促進GBM細胞對TMZ的耐藥，抑制SBF2-AS1可使GBM耐藥細胞對TMZ敏感。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1直接與SBF2-AS1啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)控SBF2-AS1 水平，并影響GBM 細胞TMZ 耐藥。SBF2-AS1 作為miR-151a-3p 的ceRNA，導(dǎo)致其內(nèi)源性靶點X射線修復(fù)交叉互補4(XRCC4)的抑制解除，從而增強GBM 細胞中DSB 的修復(fù)。替莫唑胺耐藥GBM 細胞的外泌體具有高水平的SBF2-AS1，并傳播對化學(xué)敏感性的GBM細胞傳播TMZ耐藥性。臨床上，血清外泌體中l(wèi)ncSBF2-AS1的高水平與GBM患者對TMZ 治療的不良反應(yīng)有關(guān)?？偟膩碚f，GBM 細胞通過分泌富含lncSBF2-AS1的外泌體重塑腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤化療耐藥性。因此，人血清中的外泌體lncSBF2-AS1可能作為治療難治性GBM的一個潛在的診斷標(biāo)志物。

2.3 外泌體lncRNA與5-FU耐藥

在Mao 等[29]的研究中測定了來自肺癌細胞的富含F(xiàn)OXD3-AS1的外泌體對肺癌細胞增殖、侵襲和5-FU耐藥的影響。在線生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析顯示FOXD3-AS1 在肺癌進展中表達上調(diào)。實時熒光定量PCR 結(jié)果證實FOXD3-AS1 在肺癌組織和細胞系中表達上調(diào)，并且FOXD3-AS1 在肺癌細胞來源的外泌體中大量富集。此外，F(xiàn)OXD3-AS1與ELAVL1蛋白可以互相結(jié)合并上調(diào)其表達，肺癌細胞來源的外泌體可以促進A549細胞的增殖和侵襲，抑制5-FU 引起的凋亡，在外泌體培養(yǎng)的A549細胞中轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1或si-ELAVL1可以逆轉(zhuǎn)這些作用。機制研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞來源的外泌體激活PI3K/Akt 通路，轉(zhuǎn)染si-FOXD3-AS1 或使用PI3K 抑制劑LY294002 處理可逆轉(zhuǎn)外泌體誘導(dǎo)的PI3K/Akt軸的激活。總之，他們的研究揭示了肺癌細胞來源的外泌體FOXD3-AS1 上調(diào)ELAVL1 的表達并激活PI3K/Akt 通路促進肺癌進展以及對于5-FU 的耐藥性，為肺癌的治療提供了一種新的策略。

2.4 外泌體lncRNA與阿霉素耐藥

H19不僅可以調(diào)控結(jié)直腸癌對奧沙利鉑的耐藥性，也被報道可以參與乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。手術(shù)切除、放射治療和化療已被確立為乳腺癌患者的三種主要治療方式。阿霉素已被廣泛接受為治療乳腺癌的一線藥物，然而，耐藥性的迅速發(fā)展從本質(zhì)上削弱了抗癌藥物的療效。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的親本細胞相比，阿霉素耐藥乳腺癌細胞中H19 表達增加。抑制H19 可通過降低細胞活力、降低集落形成能力和誘導(dǎo)細胞凋亡，從而顯著降低DOX 耐藥性。此外，細胞外的H19 可以通過進入外泌體轉(zhuǎn)移到敏感細胞，用來自耐藥細胞的外泌體處理敏感細胞增加了DOX的耐藥性。他們的研究發(fā)現(xiàn)H19可以通過外泌體傳遞到敏感細胞，導(dǎo)致DOX耐藥性的傳遞，強調(diào)了外泌體H19作為分子治療靶點降低DOX耐藥性的潛力。

2.5 外泌體lncRNA與順鉑耐藥

Xin 等[31]發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE 在胃癌患者的癌組織和腫瘤相關(guān)巨噬細胞中上調(diào)。體外實驗表明，CRNDE富集于M2極化的巨噬細胞來源的外泌體(M2-exo)，并通過外泌體從M2巨噬細胞轉(zhuǎn)移到GC 細胞。沉默M2-exo 中的CRNDE 可以逆轉(zhuǎn)M2-exo對順鉑處理的GC細胞增殖和CDDP處理的裸鼠同種移植瘤生長的促進作用。機制上，CRNDE 促進神經(jīng)前體細胞表達發(fā)育下調(diào)蛋白4-1(NEDD4-1)介導(dǎo)的磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)泛素化。沉默M2-exo 中的CRNDE 可以增強M2-exo 處理的GC 細胞對順鉑的敏感性，而PTEN 敲除則降低了這種敏感性。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了CRNDE在GC細胞順鉑耐藥中的重要作用，并提示CRNDE在GC細胞中的上調(diào)可能歸因于TAM來源的外泌體的轉(zhuǎn)移。

3 外泌體circRNA介導(dǎo)腫瘤細胞耐藥

circRNAs是一類非編碼的長鏈環(huán)形RNA分子，在真核轉(zhuǎn)錄組中具有高度的組織特異性表達，無5′-3′極性，也不包含polyA 尾巴，不易被RNA 外切酶或RNase R 降解，具有相對穩(wěn)定的閉合環(huán)狀框架。環(huán)狀RNA主要由外顯子組成，這些外顯子主要存在于細胞質(zhì)中，并可能具有microRNA 反應(yīng)元件，它們通過與microRNA 或其他分子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)基因表達[32]。Li等[33]首次證明了外泌體中存在大量circRNA，發(fā)現(xiàn)血清外circRNA 可以區(qū)分癌癥患者和健康對照者，并具有作為癌癥診斷的循環(huán)生物標(biāo)志物的潛力。外泌體circRNA 的組成可能受供體細胞中相關(guān)miRNA水平的變化所調(diào)節(jié)，隨后這種分子信息被轉(zhuǎn)移到受體細胞，從而引發(fā)功能性反應(yīng)，并誘導(dǎo)一系列表型變化，甚至調(diào)節(jié)器官功能。研究發(fā)現(xiàn)一些環(huán)狀RNA可以在血清、尿液和腫瘤來源的外泌體中檢測到，并參與細胞生長、血管生成、腫瘤耐藥、EMT和靶向治療的過程[34]。

3.1 外泌體circRNA參與順鉑耐藥

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性癌癥死亡的主要原因之一，也是最致命的婦科癌癥。EOC通常在晚期被診斷，此時腫瘤已遍布腹腔，耽誤了減瘤手術(shù)的最佳時機。EOC是最具化學(xué)反應(yīng)性的腫瘤之一，對順鉑和卡鉑的治療均有良好的反應(yīng)[35]。Luo 等[36]研究發(fā)現(xiàn)在EOC 患者中，尤其是在順鉑耐藥的上皮性卵巢癌患者中，血清循環(huán)型外泌體circFoxp1 表達量顯著增加。circFoxp1 通過miR-22 和miR-150-3p正向調(diào)節(jié)CEBPG和FMNL3的表達，在EOC細胞中產(chǎn)生順鉑抗性。

3.2 外泌體circRNA參與奧沙利鉑耐藥

除了外泌體miRNA影響了胃癌對奧沙利鉑的耐藥性，外泌體circRNA參與奧沙利鉑耐藥也有報道。Zhong等[37]研究揭示了胃癌細胞circ_0032821 通過充當(dāng)SOX9 的內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)來海綿吸附 miR-515-5p，增強SOX9 的表達，從而增強胃癌細胞對奧沙利鉑的抗性，并且驗證了來自奧沙利鉑抗性胃癌細胞的外泌體可以通過轉(zhuǎn)移circ_0032821而賦予敏感胃癌細胞奧沙利鉑抗性。

3.3 外泌體circRNA參與硼替佐米耐藥

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)通常被認為是不可治愈的，但在過去15年患者總生存率有顯著改善。硼替佐米是一種新型蛋白酶體抑制劑，可以通過調(diào)節(jié)bcl-2、caspase-9 和caspase-3誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞死亡，而骨髓間充質(zhì)干細胞衍生的外泌體抑制硼替佐米的功能，導(dǎo)致骨髓瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。Luo等[38]發(fā)現(xiàn)耐藥患者循環(huán)外泌體中circMYC的表達明顯高于非耐藥患者，并且惡性血液病患者的循環(huán)環(huán)狀circMYC 表達上調(diào)，與硼替佐米反應(yīng)和復(fù)發(fā)相關(guān)，表明外泌體circMYC 作為惡性血液病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物具有很大的潛力。

3.4 外泌體circRNA參與阿霉素耐藥

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年最常見的原發(fā)性骨癌，在成人中第三常見，目前骨肉瘤的治療方案是手術(shù)和基于阿霉素的化療。Zhu等[39]發(fā)現(xiàn)circPVT1在OS細胞系中相對于hFOB 1.19表達上調(diào)，尤其是在多藥耐藥OS細胞系中表達顯著升高，敲除circPVT1 的表達可以部分逆轉(zhuǎn)OS 細胞對阿霉素和順鉑的耐藥性，circPVT1表達升高與晚期骨肉瘤、化療耐藥和肺轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。此外，K-M生存分析表明，高表達circPVT1的患者比低表達circPVT1 的患者有更短的總生存期。circPVT1可能作為相關(guān)miRNA海綿促進ABCB1的表達，circPVT1基因敲低可以通過降低ABCB1的表達。多藥耐藥相關(guān)基因ABCB1(MDR1)的高表達可通過P-gp 蛋白泵出細胞內(nèi)藥物，促進化療耐藥[40]。因此，circPVT1 在組織和血清中表達上調(diào)，與不良預(yù)后相關(guān)，是良好的診斷OS的生物標(biāo)志物。

綜上所述，在不同的化療藥物作用下，在不同腫瘤背景中，miRNA、lncRNA以及circRNA等ncRNA在細胞或組織外泌體中表達上調(diào)，通過作用于下游分子靶標(biāo)，直接或間接調(diào)控靶基因表達，影響了細胞耐藥性，將目前報道的部分腫瘤化療耐藥相關(guān)外泌體ncRNA 及其表達情況和作用機制總結(jié)為表1。在腫瘤耐藥細胞中，一些ncRNA 的轉(zhuǎn)錄水平升高，表達量上調(diào)，這些ncRNA 被外泌體包裹，之后通過胞吐作用分泌到細胞外，又被受體細胞攝取。進入受體細胞后，它們可以通過激活PI3K/Akt通路，導(dǎo)致血管生成和EMT促進細胞耐藥；也可以通過激活糖酵解和增加DNA修復(fù)途徑促進耐藥；或者抑制凋亡途徑的執(zhí)行分子bax 和caspase-3/-9 等促進癌細胞的存活，促進細胞耐藥；又或者通過直接促進耐藥相關(guān)基因的表達，激活轉(zhuǎn)運蛋白將藥物泵出細胞外，導(dǎo)致細胞耐藥。我們將耐藥細胞的外泌體ncRNA促進敏感細胞的耐藥性的部分機制總結(jié)成圖1。

圖1 耐藥細胞的外泌體運送ncRNA促進敏感細胞的耐藥性

表1 腫瘤化療耐藥相關(guān)外泌體ncRNA及其表達情況和作用靶點

4 結(jié)論與展望

幾乎所有體液中都有外泌體，越來越多的證據(jù)表明，外泌體在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體的分泌是一種結(jié)構(gòu)性現(xiàn)象，涉及生理和病理過程，其釋放受到一些Rab家族蛋白的調(diào)控，包括Rab27a 和Rab27b。外泌體通過供體細胞的胞吐作用，被靶細胞攝取，可以在局部和遠端細胞間傳遞生物信號。目前，我們可以利用外泌體作為生物標(biāo)志物、疫苗和藥物載體，并對它們進行合理的修飾進行治療干預(yù)。外泌體的變化和外泌體內(nèi)容物的異常表達可以反映機體的病理狀態(tài)，很多研究已經(jīng)表明外泌體和外泌體內(nèi)容物可以作為新型的癌癥生物標(biāo)志物。此外，外泌體ncRNA在腫瘤耐藥中的作用也已逐漸被揭示。外泌體作為天然載體，能夠攜帶和轉(zhuǎn)移參與耐藥的ncRNA和蛋白質(zhì)。本文綜述了外泌體ncRNA在增加腫瘤藥物外排、改變藥物靶點、激活信號通路和調(diào)節(jié)EMT 中的生物學(xué)功能，還討論了外泌體ncRNA 作為生物標(biāo)志物的潛在治療價值。在不同的癌癥中，ncRNA 通過不同的途徑來調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性。但是到目前為止，外泌體ncRNA與腫瘤耐藥的研究主要停留在體外水平，并未有臨床病例的相關(guān)研究報道，將細胞水平的實驗結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床試驗仍然是最困難的挑戰(zhàn)。一方面，使用外泌體治療的前景主要包括控制細胞外信息的交換和藥物的靶向遞送，仍然需要做更多更深入的研究來揭示外泌體ncRNA分泌和傳遞的具體機制；另一方面，外泌體的輸送效率也需要進一步提高。隨著外泌體ncRNA 調(diào)控各種腫瘤耐藥機制研究的深入，我們相信未來將在腫瘤預(yù)后判斷、腫瘤治療監(jiān)測和靶向治療等方面取得令人滿意的進展。