飲水中添加復(fù)合酶對黃羽肉雞生長性能、血清抗氧化指標(biāo)、免疫功能和腸道結(jié)構(gòu)的影響

■陳鑫珠 楊雅妮，2 邱水玲，2 靳偉剛 李忠榮* 邱華玲 林海虹 劉 景

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建省畜禽遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350013；2.福建農(nóng)林大學(xué)，福建福州 350001；3.福建福大百特生物科技有限公司，福建福州 350007；4.酶高效表達(dá)國家工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350007）

動(dòng)物對飼料養(yǎng)分的消化、吸收受飼料中諸多抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，如植酸、非淀粉多糖、蛋白酶抑制因子等[1-2]，添加酶制劑可增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性酶的活性[3-5]，合理使用酶制劑能夠降解飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高日糧蛋白質(zhì)利用率，維持腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道健康[6]，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[7-8]。應(yīng)用于飼料的酶制劑產(chǎn)品種類繁多，性質(zhì)差異較大，因此在動(dòng)物中的研究結(jié)果不盡相同[9-10]。蛋白酶在動(dòng)物中的利用研究報(bào)道較多[11-12]。李東東等[9]研究表明，添加外源蛋白酶可提高飼料養(yǎng)分（尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸）的消化率。蛋白酶在禽類中的應(yīng)用較為廣泛，因?yàn)榍蓊惖南辣容^短，通過添加酶制劑可以有效地消化飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，提高利用率和生產(chǎn)性能[13-14]。碳水化合物氧化酶、己糖氧化酶和生物活性肽等因技術(shù)或原料限制，早期成本較高，資源有限，在動(dòng)物應(yīng)用中報(bào)道較少。不同酶單體特性存在差異，對畜禽的應(yīng)用效果不同，因此養(yǎng)殖中更趨向添加復(fù)合酶[15-16]。但不同單體因其特有的生物學(xué)特性，進(jìn)行復(fù)合時(shí)也可能存在相互影響而達(dá)不到相乘的效果，因此，在了解酶的特性同時(shí)，必須以動(dòng)物試驗(yàn)作為最終判定依據(jù)。另外，酶制劑添加方式主要是飼糧添加和飲水添加，然而飼糧加工過程中通常存在高溫工藝導(dǎo)致酶失活以及混合不均勻等問題，飲水添加則能很好地解決了這些問題。本試驗(yàn)通過飲水途徑添加復(fù)合酶，探究2種不同復(fù)合酶對黃羽肉雞生長性能、血清抗氧化指標(biāo)、免疫功能和腸道結(jié)構(gòu)的影響，為復(fù)合酶在黃羽肉雞上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)合酶：復(fù)合酶A是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一種復(fù)合酶，主要含蛋白水解酶（酶活≥8 000 U/g）、半纖維素酶類（酶活≥8 000 U/g）；復(fù)合酶B 是由黑曲霉產(chǎn)生的一種復(fù)合酶，主要含己糖氧化酶（酶活≥2 000 U/g）、生物活性肽等。以上2 種復(fù)合酶由福建某生物科技有限公司提供。

黃羽肉雞：新興黃雞苗，購自莆田溫氏家禽農(nóng)牧有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

5 000 羽1 日齡溫氏黃羽肉雞統(tǒng)一育雛至29 日齡，選取4 000羽隨機(jī)分為5組，每組4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)200 羽（公母各半），各重復(fù)初始平均體重差異不顯著（P＞0.05）。對照組飲水中不添加復(fù)合酶，試驗(yàn)1、2 組飲水中分別添加50、100 mg/L復(fù)合酶A，試驗(yàn)3、4組飲水中分別添加125、175 mg/L 復(fù)合酶B。對照組、試驗(yàn)組飼喂相同日糧（日糧中未添加酶制劑），試驗(yàn)期40 d，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)日糧

參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)營養(yǎng)需要推薦量和《溫氏新興黃雞飼養(yǎng)手冊》等，配制29～45、46～70日齡階段日糧，試驗(yàn)日糧組成與營養(yǎng)水平見表2。

表2 試驗(yàn)日糧組成與營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用封閉式雞舍墊料平養(yǎng)，舍內(nèi)設(shè)置自動(dòng)料線、自動(dòng)飲水線，自由采食顆粒飼料、充足飲水。按《黃羽肉雞飼養(yǎng)管理手冊》進(jìn)行日常管理和免疫等，記錄試驗(yàn)期間疫苗接種情況、疾病發(fā)生及治療情況。

1.5 生長性能測定

以重復(fù)為單位，測定各重復(fù)29日齡、70日齡空腹平均體重，每天記錄各重復(fù)飼料消耗量，計(jì)算各重復(fù)的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）及料重比（F/G）。

1.6 樣品采集與指標(biāo)測定

于70 日齡（禁食12 h 后）每重復(fù)隨機(jī)選取2 只健康、接近平均體重的雞2只（公母各1只），稱取活重后進(jìn)行血清制備。頸部放血處死，立即摘取脾臟、法氏囊、胸腺以及腸道組織，按以下方法進(jìn)行樣品制備及指標(biāo)測定。

1.6.1 血清制備與指標(biāo)測定

翅靜脈采血5 mL，4 ℃冰箱靜置60 min、3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL 冷凍管，-20 ℃冷凍保存?zhèn)錅y。采用UNICO-UV2000型分光光度計(jì)，按各指標(biāo)試劑盒測定方法，分別測定血清總蛋白（TP）、超氧化物歧化酶（SOD）、羥自由基（·OH）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（·O2-）及溶菌酶（LZM）活性。采用酶標(biāo)儀（DG5033A 型）法測定血清中的白蛋白（ALB）和免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）。試劑盒購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司。

1.6.2 免疫器官采集與測定

剖開胸腹腔，摘取內(nèi)臟后依次采集脾臟、法氏囊、胸腺并逐一稱重、記錄，按以下公式計(jì)算免疫器官指數(shù)。胸腺稱重后立即放入液氮中保存?zhèn)溆?，按各指?biāo)試劑盒測定方法分別測定胸腺中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。試劑盒購自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司。

免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官鮮重（g）/宰前空腹活體重（kg）

1.6.3 腸道組織采集與指標(biāo)測定

分別剝離十二指腸、空腸、回腸，進(jìn)行稱重、測量長度。分別截取長度約1 cm 十二指腸、空腸和回腸中段，用生理鹽水將內(nèi)容物沖洗干凈后，放入甲醛固定液中固定。固定狀態(tài)良好后，嚴(yán)格按照病理檢測SOP程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片。使用Eclipse Ci-L（Nikon）拍照顯微鏡對組織目的區(qū)域進(jìn)行40 倍成像，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別測量每張切片上5根完整腸絨毛高度（mm)、5處隱窩深度（mm）和5處黏膜層厚度（mm）。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s 多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。P＞0.05 為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶對29～70日齡黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可見，試驗(yàn)組70日齡平均體重均顯著大于對照組（P＜0.05），29～70 日齡平均日增重顯著高于對照組（P＜0.05），料重比顯著低于對照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組與對照組平均日采食量差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)1、2組之間，試驗(yàn)3、4組之間，即同種酶制劑的不同添加水平之間無顯著（P＞0.05）差異。

表3 復(fù)合酶對29～70日齡黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 復(fù)合酶對黃羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，試驗(yàn)2、3、4組70日齡血清羥自由基含量均顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗(yàn)2 組超氧化物歧化酶活性顯著低于對照組（P＞0.05）。各試驗(yàn)組與對照組血清DPPH 自由基和超氧陰離子自由基含量差異不顯著（P＞0.05）。添加相同復(fù)合酶條件下，試驗(yàn)2組羥自由基顯著高于試驗(yàn)1 組；試驗(yàn)4 組顯著高于試驗(yàn)3 組（P＜0.05）。試驗(yàn)1 組血清DPPH 自由基含量高于其他各組，其中顯著高于試驗(yàn)4組（P＜0.05）。

表4 復(fù)合酶對黃羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 復(fù)合酶對黃羽肉雞免疫功能的影響

由表5可知，試驗(yàn)4組70日齡血清免疫球蛋白A含量、免疫球蛋白M含量和溶菌酶活性顯著高于對照組（P＜0.05），試驗(yàn)2組血清白蛋白含量顯著高于試驗(yàn)4組（P＜0.05）。試驗(yàn)組與對照組血清總蛋白、免疫球蛋白G、胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺中白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8及腫瘤壞死因子-α等免疫指標(biāo)均差異不顯著（P＞0.05）。除試驗(yàn)4組的溶菌酶活性顯著（P＜0.05）高于試驗(yàn)3組外，其余指標(biāo)，同種酶制劑不同添加劑量之間均無顯著差異（P＞0.05）。

表5 復(fù)合酶對黃羽肉雞免疫功能的影響

2.4 復(fù)合酶對黃羽肉雞腸道結(jié)構(gòu)的影響

由表6可知，各試驗(yàn)組與對照組十二指腸長度和隱窩深度無顯著差異（P＞0.05）；試驗(yàn)4 組十二指腸腸重量、腸絨毛高度、黏膜層厚度和腸絨毛高度/隱窩深度顯著高于對照組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組與對照組空腸長度和腸絨毛高度/隱窩深度等均無顯著差異（P＞0.05），試驗(yàn)1組空腸腸絨毛高度和黏膜層厚度、試驗(yàn)2組腸絨毛高度、試驗(yàn)2 組和試驗(yàn)4 組腸隱窩深度均顯著高于對照組（P＜0.05）。各試驗(yàn)組與對照組回腸長度、腸絨毛高度、隱窩深度、腸絨毛高度/隱窩深度、黏膜層厚度等均無顯著差異（P＞0.05），試驗(yàn)4 組回腸重量顯著高于對照組（P＜0.05）。

3 討論

由于機(jī)體內(nèi)源酶分泌不足，應(yīng)用外源性酶制劑補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足越來越受到重視[17-18]。特別在幼齡動(dòng)物，飼料配方中添加外源性酶，可以有效促進(jìn)其對飼料的消化吸收，降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高平均日增重，降低料重比，降低營養(yǎng)性腹瀉發(fā)生率[19]。然而，隨著工藝的發(fā)展以及對酶特性的研究，不同酶的特異性組合，具有相乘效果，且降低成本[20]。王明海等[21]報(bào)道，玉米-豆粕型日糧中添加復(fù)合酶制劑，可以顯著提高肉仔雞蛋白質(zhì)的消化率。本試驗(yàn)復(fù)合酶A主要成分為蛋白酶，蛋白酶是機(jī)體蛋白質(zhì)消化和吸收的關(guān)鍵酶。王旭等[22]報(bào)道，黃羽肉雞基礎(chǔ)日糧中添加適量蛋白酶制劑，降低了肉雞平均日采食量和料重比，提高了日糧中蛋白質(zhì)及氨基酸的消化利用率，促進(jìn)肉雞對飼料中蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)的消化分解，最適添加量為200 mg/kg。為探索性價(jià)比更高的添加方式，本試驗(yàn)采用了飲水方式供給，復(fù)合酶的添加劑量均小于200 mg/kg。

酶制劑降解底物后產(chǎn)生一定量的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)在動(dòng)物機(jī)體中可能起到抗氧化、增強(qiáng)免疫等功能[23-24]。本試驗(yàn)中，肉雞的血清抗氧化指標(biāo)，試驗(yàn)2 組的超氧化物歧化酶活性顯著低于對照組；試驗(yàn)4組羥自由基含量顯著高于試驗(yàn)2 組；試驗(yàn)4 組的DPPH·清除能力顯著低于試驗(yàn)1組。說明復(fù)合酶A和復(fù)合酶B 在這兩方面均有一定的功能，其中復(fù)合酶B 效果更佳。這可能是復(fù)合酶B中含有生物活性肽等物質(zhì)，可對機(jī)體抗氧化活性和免疫功能起直接作用，因此效果較佳。

幼齡動(dòng)物的消化系統(tǒng)發(fā)育不全，酶分泌量不足而導(dǎo)致的腹瀉、消化不良等，通過外源添加酶制劑獲得改善，免疫力提高[25]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)4組的免疫球蛋白A、免疫球蛋白M 含量和溶菌酶活性顯著升高，試驗(yàn)2 組的超氧化物歧化酶活性顯著降低。這與孫顥軒等[26]、周梁等[27]在肉雞上的研究結(jié)果相似。周梁等[27]報(bào)道，蛋白酶能夠促進(jìn)肉仔雞生長前期的小腸發(fā)育，提高蛋白質(zhì)及大部分氨基酸表觀消化率，從而改善生長性能。Xu等[28]報(bào)道，日糧中添加酶制劑可改善其腸道形態(tài)，21 日齡腸絨毛高度、腸絨毛高度與隱窩深度比值顯著增加，十二指腸、空腸、回腸的隱窩深度極顯著降低，42 日齡空腸腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度比值顯著增加，隱窩深度顯著降低。隨著蛋白酶添加水平的提高，8～21日齡肉雞十二指腸和空腸的隱窩深度呈顯著線性升高，十二指腸的絨毛高度/隱窩深度呈顯著線性降低，空腸絨毛高度呈顯著二次曲線升高[26]。本試驗(yàn)亦獲得相似結(jié)果，復(fù)合酶處理黃羽肉雞的腸道形態(tài)均得到改善，試驗(yàn)1組空腸的腸絨毛高度和黏膜層厚度顯著升高，試驗(yàn)2組空腸的腸絨毛高度和隱窩深度顯著升高，試驗(yàn)4組十二指腸的腸絨毛高度、黏膜層厚度和絨毛高度/隱窩深度均顯著升高，空腸的隱窩深度顯著升高。

目前，添加劑的使用方式有飲水型與飼糧型，當(dāng)前較多研究集中在飼糧型添加方面，在飲水型方面的研究較少，兩種方式的應(yīng)用效果報(bào)道也不完全一致。余建等[29]研究表明，飼糧與飲水添加酸化劑均能提高肉雞生長性能，降低肉雞消化道的pH，且飲水添加酸化劑效果要優(yōu)于飼糧添加酸化劑。沈一茹等[30]報(bào)道，飼糧添加和飲水添加酸化劑對肉雞生長性能的促進(jìn)作用與抗生素相當(dāng)，對腸道發(fā)育的促進(jìn)作用優(yōu)于抗生素，然飼糧添加對肉雞生長性能和腸道發(fā)育的改善作用優(yōu)于飲水添加。小劑量添加劑飼糧添加容易產(chǎn)生混合不均勻等問題，飲水添加則能很好地解決這些問題。徐靜等[31]報(bào)道，飲水中添加0.06 mL/L 大蒜精油能夠改善蛋雞腸道組織形態(tài)，增加有益菌的定植，提高蛋雞的生長性能。另外，飲水添加可以避免飼料生產(chǎn)過程當(dāng)中加工條件對酶的影響，更適宜于在養(yǎng)殖現(xiàn)場中進(jìn)行應(yīng)用推廣[32]。荊新堂等[32]報(bào)道，肉雞飲水中全程按100 U/L 添加葡萄糖氧化酶，可提高肉雞的生長性能，增加養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。復(fù)合酶A和復(fù)合酶B在前期進(jìn)行過飼糧添加，效果與本次飲水添加效果一致，但飲水量未做記錄，無法進(jìn)行添加劑量對比分析，后期將對飲水添加與飼糧添加進(jìn)行進(jìn)一步的對比分析試驗(yàn)。

4 結(jié)論

綜上所述，添加復(fù)合酶A和復(fù)合酶B均可顯著提高黃羽肉雞的生長性能，復(fù)合酶B可以提高黃羽肉雞血清抗氧化功能和免疫功能，改善十二指腸及空腸結(jié)構(gòu)，推薦飲水添加劑量以125 mg/L為宜。