食品中農(nóng)藥殘留的新型生物檢測技術(shù)研究進(jìn)展

雷豆豆 ， 馬潤然 ， 王伽伯 ， 孔維軍

1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137

農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用一段時(shí)間后未被完全分解而殘留于生物體、農(nóng)產(chǎn)品、土壤、水、大氣中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱［1］。目前，農(nóng)藥的不合理施用現(xiàn)象普遍存在，農(nóng)藥殘留是影響我國食品業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人們身心健康的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)全國23個(gè)大中城市的大型蔬菜批發(fā)市場中，有47%的蔬菜中農(nóng)藥殘留超出國家標(biāo)準(zhǔn)。

農(nóng)藥殘留的靈敏與準(zhǔn)確檢測是保障食品質(zhì)量和安全的重要手段。隨著科技的快速發(fā)展，我國在食品農(nóng)殘檢測及新技術(shù)開發(fā)等方面已取得了巨大進(jìn)步，特別是在利用生物技術(shù)進(jìn)行農(nóng)殘精準(zhǔn)檢測方面，不僅能保證農(nóng)殘檢測的質(zhì)量與效率，也能為人們的生命安全保障作出積極貢獻(xiàn)，促進(jìn)我國社會和諧穩(wěn)定發(fā)展［2］。本綜述分析了食品中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)狀，強(qiáng)化了農(nóng)殘檢測的意義，并且詳細(xì)總結(jié)了近年來生物技術(shù)在食品農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為相關(guān)領(lǐng)域的農(nóng)藥殘留分析提供參考。

1 食品農(nóng)藥殘留及檢測技術(shù)現(xiàn)狀

近年來，食品中農(nóng)藥殘留情況不僅涉及領(lǐng)域廣，而且發(fā)生率和殘留量較高，超標(biāo)現(xiàn)象非常嚴(yán)重。土豆、菠菜、西紅柿、西瓜、蘋果等各類瓜果蔬菜中均能檢測出農(nóng)藥殘留。2017—2019年，吉林省286份出售蔬菜中農(nóng)藥殘留總檢出率為69.93%，超標(biāo)率為5.94%［3］。2019—2021年，江蘇省25 197份蔬菜中農(nóng)殘檢出率為24.2%，超標(biāo)率為0.84%［4］。2022年，重慶9個(gè)區(qū)縣778份蔬菜中農(nóng)殘檢出率為55.53%，超標(biāo)率為2.83%，327批水果檢出率為42.20%，超標(biāo)率為1.22%［5］。食品中農(nóng)藥污染及殘留超標(biāo)已成為人們普遍關(guān)注的問題。

我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，兩者均居世界首位［6］。我國施用農(nóng)藥面積在2.8×108hm2以上，每年用量50～60萬t，除30%左右被作物等吸收外，大部分農(nóng)藥流失在土壤、水體、農(nóng)產(chǎn)品和空氣中，使它們遭受不同程度的污染［7］。此外，隨著用藥量和用藥次數(shù)增加，食品中農(nóng)藥的殘留量也進(jìn)一步提高，不僅影響食品質(zhì)量和安全，還會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害。此外，農(nóng)藥殘留還會影響食品出口貿(mào)易，因此，需要對農(nóng)殘的限量及農(nóng)殘檢測技術(shù)提出更高的要求，從而進(jìn)一步提高我國食品的質(zhì)量，保障人民飲食安全，同時(shí)還可以更好地推動我國食品對外貿(mào)易的發(fā)展［8］。當(dāng)前，各級政府及質(zhì)檢部門高度重視食品安全問題，制定了100余種農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)，并出臺了一系列農(nóng)藥殘留檢測的方法和技術(shù)手段，為農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測提供了技術(shù)支持。傳統(tǒng)質(zhì)譜法和色譜法被視為農(nóng)藥殘留檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在設(shè)備笨重、樣品前處理復(fù)雜、成本較高、對操作人員要求嚴(yán)苛等缺點(diǎn)，難以滿足現(xiàn)場快速、大批量樣品檢測的需求，這也促進(jìn)了新型生物技術(shù)的發(fā)展及其在食品中農(nóng)藥殘留檢測方面的應(yīng)用。

2 基于生物技術(shù)的食品農(nóng)殘檢測

近年來，免疫分析和生物傳感器等生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用吸引了全世界的廣泛關(guān)注，不僅檢測速度快、操作簡便，而且靈敏度和精確度較高，可滿足現(xiàn)場快速、大批量樣品的檢測需求。

2.1 免疫分析技術(shù)

免疫分析是農(nóng)殘檢測的重要方法之一，其利用抗原-抗體的特異識別反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)對待測物的定性定量檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)，已在食品的農(nóng)殘檢測中得到廣泛應(yīng)用［9］，主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、熒光免疫分析法（fluorescence immunosorbent assay，F(xiàn)LISA）、生物條形碼免疫法（bio-barcode immunoassay，BCIA）等。

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附測定法 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是目前最常用的免疫測定方法之一，其基于抗原-抗體識別反應(yīng)特異性和酶高效催化底物的特性，通過酶作用后顯色的深淺來達(dá)到定性或定量檢測的目的［10］，具有操作簡單、預(yù)處理速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確度高、易普及、成本低、可高通量分析、對工作人員的專業(yè)技能要求不高等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大量樣本的快速篩查［11］。

近年來，研究者們對ELISA技術(shù)在食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測方面開展了大量研究。Navarro等［12］將毒死蜱（chlorpyrifos）和倍硫磷（fenthion）農(nóng)藥的2種單獨(dú)ELISA試驗(yàn)整合開發(fā)了雙聯(lián)ELISA法，實(shí)現(xiàn)了天然和商業(yè)橘汁樣品中2種有機(jī)磷殺蟲劑（organophosphorous insecticides，OPPs）的殘留檢測（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的雙聯(lián)ELISA測定，通過簡單的樣品稀釋，沒有額外的樣品清理程序，在40 min內(nèi)即可完成。對毒死蜱和倍硫磷的檢測限（limits of detection，LODs）分別為0.20±0.04 μg·L-1和0.50±0.06 μg·L-1，回收率在95%～106%之間。邢瑋瑋和陳燕敏［13］通過ELISA技術(shù)測定食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，同時(shí)對比氣相/液相色譜法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ELISA測定結(jié)果的可靠性更高，且操作更簡便。Hongsibsong等［14］開發(fā)了一種室內(nèi)間接競爭性ELISA法（ic-ELISA）用于檢測來自泰國部分地區(qū)菜市場采集的蔬菜樣品中的毒死蜱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法對毒死蜱的IC50為0.80 μg·kg-1，敏感性較高，對其他有機(jī)磷農(nóng)藥的交叉反應(yīng)較低，對毒死蜱的加標(biāo)回收率范圍為95.3%～117.8%（平均值為102.9%）。他們的結(jié)果顯示，黃瓜、芫荽和牽?；ㄖ卸舅莉鐨埩羲阶罡撸謩e為275、145和35.3 μg·kg-1，陽性樣品中毒死蜱的最高中位數(shù)水平為大白菜（332 μg·kg-1）、黃瓜（146.3 μg·kg-1）和羽衣甘藍(lán)（26.95 μg·kg-1）。同時(shí)，所有的陽性樣品均經(jīng)氣相色譜-火焰光度檢測法（gas chromatography-flame photomebric detection， GC-FPD）驗(yàn)證。

圖1 雙聯(lián)ELISA法檢測毒死蜱和倍硫磷[12]Fig. 1 Detection of chlorpyrifos and fenthion by double ELISA[12]

雖然ELISA是當(dāng)下較為理想的食品農(nóng)殘檢測的重要技術(shù)之一，但其對試劑的選擇性高，對結(jié)構(gòu)相似的化合物易出現(xiàn)不同程度的交叉反應(yīng)。未來需要從抗體研發(fā)入手，加速不同ELISA檢測試劑盒的研發(fā)，更好地普及和推廣ELISA檢測技術(shù)。

2.1.2熒光免疫分析法 熒光免疫分析法（FLISA）是一種將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性和熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的分析方法?；驹硎且詿晒馑貥?biāo)記抗原或抗體，再與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)，于熒光顯微鏡下觀察，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮熒光，從而實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測。常用的FLISA可分為直接熒光法和間接熒光法，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在專一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好、操作簡單快捷、檢測成本適中等［15］。

廖蕓等［16］建立了一種基于CdSe/ZnS量子點(diǎn)（QDs）的快速、簡便、靈敏的FLISA法以檢測農(nóng)藥三唑磷。他們以CdSe/ZnS QDs作為攜帶單克隆抗體（mAb）的探針，游離的三唑磷分子和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）修飾的半抗原競爭性結(jié)合探針表面的mAb，通過記錄探針的熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)三唑磷的快速檢測。結(jié)果表明，該方法對三唑磷的 線 性 響 應(yīng) 范 圍 為0.01～25.00 μg·L-1，檢 測 限（IC10）為0.508 ng·L-1，加 標(biāo) 樣 品 的 回 收 率 在82.6%～96.6%之間，為食品、農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境樣品中痕量三唑磷農(nóng)藥的靈敏檢測提供了可靠的方法。為了實(shí)現(xiàn)多種農(nóng)藥殘留的同時(shí)檢測，姜名荻等［17］建立了一種可同時(shí)檢測3種農(nóng)藥的仿生熒光免疫分析方法（biomimetic FLISA）。他們以2-（二乙氧基磷酸）乙酸為模板分子，F(xiàn)e3O4@SiO2為支撐材料，制備了具有多個(gè)識別位點(diǎn)和較高吸附能力的超順磁性核殼類分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）。進(jìn)而以Fe3O4@SiO2@MIP作為仿生抗體，QDs為標(biāo)記物，可實(shí)現(xiàn)甲基對硫磷、毒死蜱和敵百蟲等3種有機(jī)磷農(nóng)藥的仿生熒光免疫檢測。在優(yōu)化條件下，該方法對甲基對硫磷、毒死蜱和敵百蟲的最低檢出限分別為0.21±0.021 μg·L-1、0.44±0.069 μg·L-1和0.32±0.033 μg·L-1，在添加了靶標(biāo)農(nóng)藥的蘋果和柑橘樣品中回收率為73.1%～119.3%，并可用于梨、胡蘿卜、獼猴桃和香蕉樣品中3種農(nóng)藥的檢測，且分析結(jié)果與氣相色譜法結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

2.1.3生物條形碼免疫法 生物條形碼免疫法（BCIA）是將具有信號放大作用的寡聚核苷酸鏈作為探針，以一定的方式結(jié)合到納米材料（如金納米顆粒，AuNPs）表面，形成多級放大體系，在外加磁場作用下以磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）分離，將生物條形碼解離下來，測定其含量，從而將目標(biāo)物的檢測轉(zhuǎn)換為探針檢測，間接得到待測物的含量，顯著提高了檢測的靈敏性［18］，因其靈敏度高、操作簡單、檢測時(shí)間短、成本低、重復(fù)性好等優(yōu)勢，已被用于農(nóng)殘的檢測。

Wang等［19］首次將熒光定量PCR技術(shù)引入競爭性生物條形碼免疫分析法中，以檢測農(nóng)藥等小分子化合物（圖2A）。他們將抗體與烷基硫醇封端DNA（捕獲DNA）和生物編碼DNA組裝到AuNPs上，制備了生物條形碼AuNPs探針。然后將MNPs和OVA與小分子半抗原結(jié)合，制備磁性納米粒子探針。由于顆粒富集，少量靶標(biāo)可以轉(zhuǎn)換為大量條形碼，從而實(shí)現(xiàn)對三唑磷農(nóng)藥的高靈敏分析，LOD為0.02 ng·mL-1，比ELISA法低10～20倍。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)又開發(fā)了一種基于多修飾AuNPs和熒光信號放大的競爭型生物條形碼擴(kuò)增免疫分析法檢測三唑磷農(nóng)藥［20］（圖2B）。他們采用單克隆抗體和6-羧基熒光素標(biāo)記的單鏈硫醇寡核苷酸（6-FAM-SH-ssDNAs）修飾AuNPs，6-FAM熒光被AuNPs淬滅。然后將OVA連接的半抗原包被在微孔板底部，與樣品中的三唑磷競爭性結(jié)合AuNPs探針上的抗體。研究所監(jiān)測到的熒光強(qiáng)度與分析物濃度成反比。在最佳條件下，鹽漬過程縮短到1 h，每個(gè)AuNP上可固定166±9條ssDNA，然后采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）取代復(fù)合物上的6-FAM-SH-ssDNA，通過記錄釋放的熒光信號實(shí)現(xiàn)對三唑磷的檢測。該方法對三唑磷的LOD低至6 ng·L-1，相比上一項(xiàng)研究，其靈敏度得到顯著提升，不僅能實(shí)現(xiàn)水、大米、黃瓜、卷心菜和蘋果樣品中三唑磷的靈敏測定，且與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）之間具有良好的相關(guān)性［19］。張秀宛等［21］開發(fā)了基于反復(fù)DNARNA雜交循環(huán)和核糖核酸酶H（RNase H）分解熒光團(tuán)的生物條形碼多殘留免疫分析法用于檢測三唑磷農(nóng)藥（圖2C）。他們將附著在AuNPs上的mAbs涂上DNA寡核苷酸作為信號發(fā)生器，并使用互補(bǔ)的熒光RNA進(jìn)行信號放大。通過DNA-RNA雜交和RNase H分解熒光基團(tuán)生成檢測信號。而RNase H只分解DNA-RNA雙鏈，不裂解單鏈或雙鏈DNA。因此，通過反復(fù)的DNA-RNA雜交循環(huán)可以獲得足夠強(qiáng)的信號，用于定量檢測三唑磷殘留。在優(yōu)化條件下，該方法對三唑磷展現(xiàn)了較寬的線性范圍（0.01～100 ng·mL-1）和較高的靈敏度（LOD為0.003 2 ng·mL-1），且具有穩(wěn)定性和重復(fù)性好、殘留檢測可靠等優(yōu)點(diǎn)，為食品和農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏檢測提供了一種新方法。

圖2 生物條形碼免疫法檢測三唑磷[19-21]Fig. 2 Detection of triazophos by biological bar code immunoassay[19-21]

免疫分析方法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，非常適于大批量食品中農(nóng)藥殘留的快速篩查和定量分析，但是在特異性多元化檢測方面仍然存在局限性，未來可通過制備群選型抗體和提高抗原抗體的親和力等手段實(shí)現(xiàn)食品中多種農(nóng)藥的同時(shí)高靈敏檢測。

2.2 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是由生物感受器（識別元件）和換能器及信號放大裝置構(gòu)成的一種分析檢測工具［21］。作為一種新型農(nóng)殘檢測技術(shù)，其利用生物活性物質(zhì)（如酶、微生物、細(xì)胞等）來實(shí)現(xiàn)食品中農(nóng)藥殘留的檢測。含靶標(biāo)農(nóng)藥的樣品溶液擴(kuò)散后與生物識別元件匯集，傳感器的生物敏感層迅速和待測農(nóng)藥會以酶-底物、抗原-抗體、核酸-互補(bǔ)片段等方式進(jìn)行特異性識別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生顏色、電流、熒光等信號變化，由換能器轉(zhuǎn)換成可定量處理的信號形式，經(jīng)特定儀表放大處理后被記錄，從而獲得待檢靶標(biāo)農(nóng)藥的數(shù)量和濃度信息［22-23］。

識別元件是構(gòu)建生物傳感器的關(guān)鍵，通常情況下按識別元件可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、DNA/適配體（aptamer）傳感器和細(xì)胞傳感器等。生物傳感技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，如操作簡單、可重復(fù)性好、傳感反應(yīng)速度快、靈敏性高、檢測成本低且易于實(shí)現(xiàn)快速的現(xiàn)場檢測等，近年來在食品農(nóng)殘檢測方面被廣泛研究和利用。

2.2.1電化學(xué)生物傳感器 電化學(xué)傳感器是生物傳感器發(fā)展史上首個(gè)報(bào)告的商業(yè)化生物傳感器［24］。其工作原理是以固體電極（如金電極、玻碳電極等）為基礎(chǔ)電極，將生物敏感分子（如抗體、適配體等）固定于電極表面，進(jìn)而選擇性地識別目標(biāo)分子并將其捕獲到電極表面，基礎(chǔ)電極作為信號傳導(dǎo)器將電極表面發(fā)生的識別反應(yīng)信號導(dǎo)出，變成可測量的電信號（如電流、阻抗等），從而對待測物進(jìn)行定性定量分析。電化學(xué)生物傳感器直接將物理技術(shù)與生物技術(shù)相結(jié)合，兼具物理學(xué)的高靈敏性、高準(zhǔn)確率和生物學(xué)的特異選擇性，其以靈敏度高、設(shè)備簡單、操作簡便、成本低、可在線分析等優(yōu)點(diǎn)［25］在食品農(nóng)藥殘留檢測中備受青睞。

Kaur等［26］將自行制備的農(nóng)藥馬拉硫磷抗體固定在聚乙烯二氧噻吩-羧基化多壁碳納米管（PEDOT-c-MWCNTs）修飾的氟-氧化錫（fluorine tin oxide，F(xiàn)TO）電極上構(gòu)建了可檢測馬拉硫磷的電化學(xué)免疫傳感器。當(dāng)待測溶液中存在馬拉硫磷時(shí)，抗體特異捕獲馬拉硫磷，使電極的阻抗發(fā)生變化，信號探針鐵離子的電化學(xué)信號也隨之變化，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)馬拉硫磷的靈敏檢測，LOD為1.1 fM。所制備的電化學(xué)免疫傳感器成功應(yīng)用于萵苣等食品的農(nóng)殘檢測，回收率高于液相色譜法。但該研究以活體家兔制備抗體，過程繁瑣且成本較高，同時(shí)所得到的抗體易受多種實(shí)驗(yàn)條件的影響，在一定程度上限制了電化學(xué)免疫傳感器的發(fā)展。

在檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥的電化學(xué)酶抑制型生物傳感器中，常以乙酰膽堿作為底物。如Chen等［27］制備了MWCNTs/鄰苯二甲酸酯的絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed electrode，SPE）固定乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE），進(jìn)而開發(fā)了電化學(xué)AChE傳感器以實(shí)現(xiàn)毒死蜱農(nóng)藥的原位檢測。該復(fù)合電極對硫代乙酰膽堿的氧化具有催化作用，在放大其氧化的電化學(xué)信號的同時(shí)，可以降低檢測時(shí)電位窗口的干擾。同時(shí)，所制備的修飾電極對AChE具有良好的親和性，顯著提升了傳感器的穩(wěn)定性。在優(yōu)化條件下，該傳感器對毒死蜱的LOD低至0.05 μg·L-1，可用于蔬菜樣品中低濃度毒死蜱的檢測。但值得注意的是，AChE的穩(wěn)定性較差，可能會影響檢測結(jié)果的可靠性。為此，研究者們致力于合成生物相容性好的高穩(wěn)定性復(fù)合材料以提升傳感器的穩(wěn)定性。如Hu等［28］制備了一種新型圖形化結(jié)構(gòu)的AChE傳感器檢測有機(jī)磷農(nóng)藥?；诙趸仯═iO2）和殼聚糖（chitosan，CS）良好的生物相容性，他們以TiO2-CS溶膠的凝膠復(fù)合物修飾玻碳電極組裝生物傳感器。該溶膠-凝膠復(fù)合物中存在大量的孔隙，有利于AChE酶的粘附和電子轉(zhuǎn)移，大大增強(qiáng)了傳感器的穩(wěn)定性。該傳感器首次采用了圖形化的新型結(jié)構(gòu)，對敵敵畏的檢測范 圍 為1.13 nmol·L-1～22.6 μmol·L-1，LOD 為0.23 nmol·L-1，為蔬菜汁中敵敵畏農(nóng)藥的高靈敏檢測提供了一條新途徑。電化學(xué)酶抑制型傳感器具有技術(shù)較成熟、響應(yīng)快、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，但易受重金屬及其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的影響，特異性較低。此外，酶的穩(wěn)定性較差，其活性易受外界環(huán)境的干擾，在一定程度上限制了該類型生物傳感器在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用。

適配體對靶分子的高特異性和親和力使電化學(xué)適配體傳感器逐漸成為食品中農(nóng)藥殘留檢測的熱點(diǎn)。在另一項(xiàng)研究中，F(xiàn)an等［29］基于六氰基鐵酸鎳納米顆粒（NiHCF NPs）和電化學(xué)還原氧化石墨烯（electrochemical reduction of graphene oxide，ERGO），在 玻 碳 電 極（glassy carbon electrode，GCE）上設(shè)計(jì)了一種用于檢測阿特拉津的無標(biāo)記電化學(xué)適配傳感器。他們首先將NiHCF NPs固定在ERGO/GCE電極上作為信號探針，然后利用電沉積AuNPs固定適配體提高電極的導(dǎo)電性和穩(wěn)定性。樣品中存在的待測阿特拉津分子被傳感器表面的適配體捕獲形成“阿特拉津-適配體”復(fù)合物，阻礙電子轉(zhuǎn)移和導(dǎo)電性檢查，使電化學(xué)信號降低，記錄電化學(xué)信號的變化可定量檢測阿特拉津。該電化學(xué)適配體傳感器對阿特拉津表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏度（LOD低至0.1 pmol·L-1）。為了提高農(nóng)藥的檢測通量，Zhu等［30］基于碳納米角/蒽醌-2-羧酸/金納米顆粒（CNHs/AQ/AuNPs）復(fù)合物的比率型電化學(xué)適配體傳感器同時(shí)檢測馬拉硫磷（malathion， MAL）和 氧 化 樂 果（omethoate，OMT）。他們通過室溫方法合成的CNHs/AQ/AuNPs復(fù)合材料用作基底以產(chǎn)生參比信號（IAQ）并放大響應(yīng)信號，然后在該基底上固定發(fā)夾DNA（hDNA），以提供獨(dú)立和特異的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)一步吸附亞甲基藍(lán)標(biāo)記的MAL適配子（MB-Apt1）和二茂鐵（Fc）標(biāo)記的OMT適配體（Fc-Apt2）。當(dāng)樣品存在的MAL或OMT與適配體結(jié)合后使MB-Apt1或Fc-Apt2從傳感器表面釋放下來，導(dǎo)致MB或Fc的電流信號（IMB或IFc）降低，而參比信號保持不變?；诖耍ㄟ^記錄并計(jì)算（IMB/IAQ或IFc/IAQ）可同時(shí)定量待測食品中MAL和OMT的殘留水平。CNHs/AQ/AuNPs具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大的比表面積，hDNA具有穩(wěn)定的二維結(jié)構(gòu)，使該電化學(xué)適配體傳感器具有較高的靈敏度、選擇性和可靠性，對MAL和OMT的LODs分別低至1.3和2.8 pg·mL-1，在萵苣和西紅柿樣品中的加標(biāo)回收率分別為95.0%～105.0%和93.0%～101.2%，為實(shí)際樣品中馬拉硫磷和氧化樂果的低濃度殘留檢測提供了較好的技術(shù)支撐。作為一小段DNA或RNA序列，適配體的生物化學(xué)性質(zhì)較酶和抗體更穩(wěn)定，且合成簡單、易修飾，可標(biāo)記或修飾多種電化學(xué)活性物質(zhì)。但是，目前報(bào)道的農(nóng)藥適配體序列有限，尚不能較好地滿足大量不同種類農(nóng)藥檢測的需求。隨著篩選技術(shù)的發(fā)展和成熟，越來越多的農(nóng)藥分子都可以篩選出對應(yīng)的適配體，使適配體傳感器在實(shí)際大量檢測中應(yīng)用成為可能。

隨著納米材料合成技術(shù)的發(fā)展和提高，電化學(xué)生物傳感器在識別元件使用壽命有限、非特異性吸附明顯、在微型化和納米界面的高通量檢測中缺乏研究等方面的問題也將逐漸得到完善，從而在食品的農(nóng)藥殘留檢測中得以廣泛應(yīng)用。

2.2.2光學(xué)生物傳感器 光學(xué)生物傳感器是一類以酶、抗體、適配體等生物材料為感應(yīng)元件，通過光學(xué)信號的變化將生物識別事件顯示出來以檢測對象的生物傳感器。其具有操作簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)速度快、非破壞性測量和受干擾小等特點(diǎn)，已被廣泛用于食品農(nóng)殘的檢測［31-32］。

基于氮雜二苯乙烯（azastilbene）探針的熒光特性及其與啶蟲脒、吡蟲啉等農(nóng)藥之間形成絡(luò)合物而濃度依賴性地淬滅其熒光的現(xiàn)象，Narayanan等［33］建立了一種turn-off型氮雜二苯乙烯熒光傳感器檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹硫磷與氮雜二苯乙烯之間形成了最穩(wěn)定的農(nóng)藥熒光團(tuán)絡(luò)合物，其熒光淬滅效率最高（淬滅常數(shù)為2.5×103L·mol-1），可用于卷心菜樣品中喹硫磷農(nóng)藥殘留的準(zhǔn)確檢測。

基于適配體對靶標(biāo)識別的高特異性和強(qiáng)親和力，Lin等［34］以適配體為識別元件構(gòu)建了一種新型turn-on熒光傳感器，用于啶蟲脒的定量和成像檢測。將ZnS：Mn QDs與啶蟲脒適配體偶聯(lián)制備ZnS：Mn適配體熒光探針，與MWCNTs之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移后，該探針的熒光被MWCNTs淬滅。當(dāng)樣品中存在的啶蟲脒被探針中的適配體捕獲后，探針的熒光被恢復(fù)?；诒O(jiān)測和記錄的熒光恢復(fù)強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中啶蟲脒的定量檢測。研究結(jié)果表明，該傳感器具有較高的特異性和靈敏度，對啶蟲脒的線性檢測范圍為0～150 nmol·L-1，LOD低至0.7 nmol·L-1，在卷心菜葉樣品中的加標(biāo)回收率為90%～95%，且操作簡單，為復(fù)雜食品基質(zhì)中啶蟲脒殘留的痕量檢測提供了參考方法。隨后，基于AuNPs對熒光碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）的內(nèi)濾效應(yīng)（inner filter effect，IFE），Wang等［35］構(gòu)建了一種新型熒光適體傳感器檢測啶蟲脒。此傳感器以啶蟲脒的S-18適配體作為特異性識別元件，CDs作為信號探針，表面包裹S-18適配體序列的AuNPs處于分散狀態(tài)，與CDs之間通過發(fā)生IFE而淬滅其熒光。當(dāng)樣品中存在啶蟲脒時(shí)，其會被游離的S-18適配體捕獲，使AuNPs失去了適配體的保護(hù)而發(fā)生聚集，進(jìn)而CDs的熒光得到恢復(fù)?；谠摶謴?fù)的熒光強(qiáng)度可定量測定啶蟲脒，LOD低至1.08 μg·L-1，在番茄、黃瓜和卷心菜中的平均回收率為92.6%～102.6%，與LC-MS的測定結(jié)果相一致。

分子印跡技術(shù)是一種重要的分子識別技術(shù)，其通過制備的分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）對靶標(biāo)分子具有高特異性的識別和吸附能力，體現(xiàn)了與抗體和適配體類似或更優(yōu)的性能?；诖?，Xie等［36］結(jié)合熒光分析、表面分子印跡、離子液體和磁分離的優(yōu)點(diǎn)，以Fe3O4@SiO2為載體，熒光離子液體（ionic liquid，IL）為功能單體，開發(fā)了一種新型磁性分子印跡熒光傳感器（Fe3O4@SiO2@MIPIL）。該傳感器能夠?qū)料x啉（imidacloprid，IMD）特異性響應(yīng)，最低LOD為0.3 nmol·L-1，且具有靈敏度高、表面吸附容量大、水溶性和選擇性好、聚合物和靶標(biāo)分離富集快速、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在蘋果、大米和卷心菜等食品樣品IMD痕量分析中具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

集光學(xué)、生物、化學(xué)和材料學(xué)等為一體的光學(xué)傳感器為深入推進(jìn)食品領(lǐng)域的痕量農(nóng)藥殘留檢測提供了新平臺。但是，目前開發(fā)和應(yīng)用的熒光傳感材料的選擇性和熒光強(qiáng)度有限，在復(fù)雜基質(zhì)和特殊環(huán)境中可能受到某些酸類物質(zhì)的干擾。此外，已報(bào)道的熒光傳感器大多只能檢測單一農(nóng)藥殘留，同時(shí)檢測多種農(nóng)藥的熒光探針和傳感平臺較少。未來可合成更多不同類型的識別元件及熒光報(bào)告分子，進(jìn)而需要開發(fā)多模式的熒光傳感平臺，滿足食品中多種農(nóng)藥的高通量檢測技術(shù)體系。

2.2.3壓電生物傳感器 壓電生物傳感器又稱石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM），是一種高精度的質(zhì)量傳感儀器。其以壓電介質(zhì)激發(fā)聲波，介質(zhì)表面固定生物敏感膜，膜上固定生物識別分子，能與待測物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合。通過聲波與環(huán)境的相互作用，傳感器將反應(yīng)過程中環(huán)境介質(zhì)的物理、化學(xué)變化轉(zhuǎn)換成相應(yīng)傳感檢測信號，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測。該傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低、無需標(biāo)記、能同時(shí)感應(yīng)外界環(huán)境的機(jī)械變化和電特性變化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測和疾病診斷等領(lǐng)域［37-38］。

Liu等［39］制備了一種高選擇性和高靈敏度的石英晶體微天平，該天平通過與聚氯乙烯和原位固定在壓電石英晶體（piezoelectric quartz crystal，PQC）芯片上的分子印跡聚合物微球（molecularly imprinted polymer microspheres， MIPMs）混 合 實(shí)現(xiàn)，作為農(nóng)藥硫丹的識別元件，最低檢測限（lowest detection limit，LDL）為5.59 ng·mL-1，在水和牛奶樣品中的加標(biāo)回收率分別為96.0%～104.1%和101.8%～108.0%。該MIPMs QCM制備和操作簡單、選擇性好、價(jià)格低廉，且可重復(fù)使用，是硫丹農(nóng)藥殘留的可靠分析方法。Prasad和Jauhari［40］開發(fā)了一種基于雙模板印跡仿生樹枝狀納米纖維的壓電傳感器，用于同時(shí)分析實(shí)際樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）和六氯苯（hexachlorobenzene，HCB）的殘留水平（圖3A）。他們先通過Au-S鍵將2，5-噻吩二酰氯分子固定在金石英晶體表面，再共價(jià)連接到樹突分子單體上，加入靶標(biāo)分析物、交聯(lián)劑和引發(fā)劑后通過自組裝得到分子印跡樹狀大分子納米纖維。在優(yōu)化的條件下，該壓電生物傳感器對待測農(nóng)藥DDT和HCB的特異性較強(qiáng)，無交叉反應(yīng)LODs分別為0.75和0.69 ng·mL-1，在各自的濃度范圍5.0～150.0 ng·mL-1和5.0～75.0 ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系較好，為實(shí)際食品樣品中多農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測提供了可靠的技術(shù)支撐。近期，基于抗體對靶標(biāo)農(nóng)藥的特異識別能力，F(xiàn)ernández-Benavides等［41］首次開發(fā)了一種新型鉍基（95BNT-2.5BKT-2.5BT）無鉛壓電陶瓷免疫傳感器（圖3B），能夠檢測到濃度低至0.03 μg·L-1的西維因農(nóng)藥，顯著低于高頻和低頻石英晶體商用諧振器；同時(shí)，可定量西維因的最低含量為0.11 μg·L-1，明顯低于任何商用石英生物傳感器，可用于食品中西維因農(nóng)藥痕量殘留的高選擇性、高靈敏快速檢測。通過優(yōu)化其他關(guān)鍵因素，如采用先進(jìn)的制造技術(shù)生產(chǎn)添加劑、更復(fù)雜的鈣鈦礦或優(yōu)化單相鈣鈦礦的結(jié)構(gòu)和微觀化學(xué)性質(zhì)等，可大大地拓展BNT-BKT-BT壓電免疫傳感器的傳感能力及在食品農(nóng)殘檢測的空間。此外，將壓電傳感器與其他技術(shù)（如電化學(xué)、光學(xué)等）結(jié)合，可以獲得更多的樣品檢測信息。

圖3 基于壓電傳感器檢測農(nóng)藥[40-41]Fig. 3 Pesticide detection based on piezoelectric sensor[40-41]

與ELISA等檢測技術(shù)相比，生物傳感器技術(shù)具有操作更簡單便捷、靈敏度更高、樣品檢出限更低、分析樣品速度更快等優(yōu)點(diǎn)，未來需要開發(fā)制備特異性更好的識別元件和新型壓電介質(zhì)，以促進(jìn)其食品中農(nóng)藥殘留檢測方法的變革與創(chuàng)新，提高其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

3 展望

農(nóng)殘的分析方法多種多樣且各有優(yōu)勢，這為不同種類農(nóng)藥檢測提供了多樣化的選擇。隨著人們對食品安全的高度重視及對檢測技術(shù)便捷性、靈敏度、準(zhǔn)確性、快速高效的追求，生物技術(shù)如免疫分析和傳感器等憑借自身優(yōu)勢逐漸在食品的農(nóng)殘檢測中備受關(guān)注且得到廣泛應(yīng)用。雖然生物技術(shù)具有靈敏度高、檢測快速、準(zhǔn)確性好、能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測及現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，但免疫分析技術(shù)和免疫傳感器法存在抗體制備難度大、對結(jié)構(gòu)類似化合物有一定的交叉反應(yīng)、只適用于單一靶標(biāo)農(nóng)藥測定等問題，開發(fā)新型特異性識別的生物識別分子（如適配體、分子印跡聚合物、納米抗體、改良的生物大分子等）有望解決這一問題。此外，穩(wěn)定性和重復(fù)性仍是部分生物傳感器亟待解決的問題，尤其是酶生物傳感器。微型化設(shè)計(jì)檢測系統(tǒng)，以開發(fā)出穩(wěn)定可重復(fù)使用的簡單、便攜、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的生物傳感器系統(tǒng)，尤其是無線通信集成的光學(xué)、電化學(xué)生物傳感器在食品農(nóng)殘檢測中應(yīng)用的前景非?？捎^。基于新型納米材料和納米技術(shù)的光學(xué)、電化學(xué)生物傳感器正推動著農(nóng)殘檢測設(shè)備向簡單化、小型化、集成化和高通量發(fā)展。此外，后續(xù)研究亦可將光學(xué)、電化學(xué)、光譜學(xué)等技術(shù)相結(jié)合、互為補(bǔ)充，開發(fā)出新型生物傳感器，從而實(shí)現(xiàn)更快速、更靈敏、特異性更強(qiáng)的食品農(nóng)殘檢測。

為了促進(jìn)食品中農(nóng)殘檢測與生物技術(shù)之間的結(jié)合，還需開展大量的研究和創(chuàng)新工作，合成特異性更高的識別元件，制備更微型化的便攜設(shè)備，提升檢測質(zhì)量和效率，滿足現(xiàn)場快速、大批量食品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測需求，以更好地保障食品安全，避免農(nóng)藥殘留超標(biāo)的不安全食品流入市場，對保障人們的身體健康和促進(jìn)社會發(fā)展具有重要意義。