PRPS1基因突變致綜合征性耳聾一家系遺傳學(xué)分析

任增果，楊 科， 秦利濤， 雷星星， 郭謙楠， 張 冰， 婁桂予， 王 莉

1)河南大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州 450003

耳聾是嚴(yán)重的致殘性疾病，可導(dǎo)致言語(yǔ)交流障礙，影響全球0.1%～0.3%的嬰兒[1]。據(jù)第2次全國(guó)殘疾人抽樣調(diào)查報(bào)告，我國(guó)聽力殘疾者有2 780萬人，占?xì)埣踩丝倲?shù)的33.51%[2]。中國(guó)7歲以下的耳聾患兒約有80萬，且以每年3萬例的速度增長(zhǎng)[3]。耳聾的病因復(fù)雜，包括遺傳因素和環(huán)境因素，其中遺傳因素約占60%以上。根據(jù)是否伴隨其他系統(tǒng)癥狀，遺傳性耳聾又可分為綜合征性耳聾和非綜合征性耳聾，其中綜合征性耳聾約占30%。綜合征性耳聾除具有耳聾表現(xiàn)外，還存在其他器官或系統(tǒng)的異常，如視網(wǎng)膜或眼底病變、腎功能減退、皮膚色素異常、肌肉骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)異常等。目前已報(bào)道的綜合征性耳聾有400余種[4]，常見的有Waardenburg綜合征、鰓耳腎綜合征、Pendred綜合征、Usher綜合征、Alport綜合征等。綜合征性耳聾具有高度復(fù)雜的遺傳異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)差異大，且尚有一些致病基因未被鑒定，大大增加了臨床診療難度，因此明確耳聾的分子病因及致病機(jī)制，可以為患者及其家屬提供準(zhǔn)確的遺傳咨詢和有效的干預(yù)手段。本研究通過對(duì)一個(gè)遺傳性耳聾家系進(jìn)行基因檢測(cè)，明確其致聾原因，并為家系遺傳咨詢及高危胎兒的產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象該家系來自河南省人民醫(yī)院遺傳咨詢門診，共收集3代7位成員的相關(guān)資料。其中耳聾患者5人，年齡2～56歲，耳聾程度輕到重度不等，家系圖見圖1。先證者(Ⅲ-2)，女，2歲，6個(gè)月余發(fā)現(xiàn)聽力異常、頭圍小、追視差；Ⅲ-1為男性早產(chǎn)兒，11個(gè)月時(shí)出現(xiàn)納差、嗜睡、雙耳耳聾、眼球震顫、發(fā)育遲緩，后夭折；家系中Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅱ-3均為先天性耳聾患者，無其他臨床表現(xiàn)。家系中耳聾患者均無耳外傷、中耳炎、噪音接觸史、耳毒性藥物使用史，耳郭、外耳道、鼓膜均未見明顯異常，且家系中患者的父母均非近親結(jié)婚，父母孕前期及母親孕期均未接觸致畸或致聾藥物。本研究經(jīng)過河南大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者及其家屬的同意,均簽署知情同意書。

圖1 綜合征性耳聾家系圖

1.2 聽力檢測(cè)小于6歲或不能配合純音測(cè)聽檢查的耳聾患兒(Ⅲ-2)行聽性腦干反應(yīng)檢查，根據(jù)文獻(xiàn)[5]推薦的矯正值，計(jì)算患兒預(yù)估聽力閾值：預(yù)估聽力閾值(dB eHL)=聽性腦干反應(yīng)閾值(dB nHL)-矯正值。家系中6歲以上且能配合純音測(cè)聽檢查的耳聾患者(Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅱ-3)進(jìn)行純音測(cè)聽檢查。按照WHO發(fā)布的聽力損失分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]，將耳聾分為輕度、中度、中重度、重度、極重度、全聾、單側(cè)聾。

1.3 DNA提取用EDTA-K2抗凝管抽取家系成員外周靜脈血各2 mL備用。所有樣本均使用北京天根DNA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書提取基因組DNA，-20 ℃保存。

1.4 二代測(cè)序及數(shù)據(jù)分析使用Qubit dsDNA HS Assay Kit對(duì)先證者DNA進(jìn)行定量，按照Agilent公司SureSelectXT Target Enrichment System實(shí)驗(yàn)流程，采用探針捕獲方法對(duì)基因組全部外顯子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)Illumina Nextseq500二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。序列比對(duì)參考基因組為UCSC hg19 refGene.txt.gz(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/golden Path/hg19/database/)。對(duì)檢測(cè)基因的堿基變異進(jìn)行篩選，與dbSNP、HapMap和1000Gene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，排除已報(bào)道過的非致病性單核苷酸多態(tài)性；在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk)、ClinVar(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)和相關(guān)文獻(xiàn)中檢索是否為已經(jīng)明確的致病性突變；并用相關(guān)軟件(sift、Polyphen2、MutationTaster、REVEL等)對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.ucsc.edu/)查詢變異位置氨基酸的保守性。

1.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果，對(duì)家系相關(guān)成員進(jìn)行驗(yàn)證。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取相關(guān)基因的DNA序列，利用Primer 5.0軟件針對(duì)可疑突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)in silico PCR驗(yàn)證引物序列的可靠性。PCR法擴(kuò)增此家系成員該候選位點(diǎn)所在的DNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.6 致病性評(píng)判根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(the American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)更新的變異解讀指南[7]，對(duì)檢測(cè)到的基因突變進(jìn)行致病性評(píng)判。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢測(cè)結(jié)果聽性腦干反應(yīng)測(cè)聽結(jié)果顯示先證者左耳73 dB nHL，右耳77 dB nHL，矯正后的預(yù)估聽力閾值為左耳58 dB eHL，右耳62 dB eHL，為雙耳中重度耳聾。純音測(cè)聽結(jié)果提示：Ⅰ-2為雙耳輕度耳聾(左耳35.0 dB，右耳29.0 dB)；Ⅱ-2為雙耳輕度耳聾(左耳34.3 dB，右耳26.5 dB)；Ⅱ-3為雙耳極重度耳聾(左耳85.8 dB，右耳83.3 dB)。

2.2 基因測(cè)序結(jié)果先證者X染色體的PRPS1基因(NM_ 002764.3)存在c.46 T>C變異，該突變?cè)谖靼嘌兰蚁抵袌?bào)道過[8]。聽力異常的Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅱ-3也存在相同突變，表型正常者(Ⅰ-1、Ⅱ-1)未見該突變?；驕y(cè)序結(jié)果見圖2。

箭頭所示為PRPS1基因c.46 T>C突變；Ⅲ-2、Ⅱ-2：突變型；Ⅱ-1：野生型

2.3 致病性評(píng)判根據(jù)ACMG指南[7]，PRPS1基因c.46 T>C為致病性(PS1+PM1+PM2 +PP3+PP1)。PS1：與已確定的致病變異相同，或者有相同的氨基酸改變；PM1：錯(cuò)義突變位于深入研究的無良性變異的外顯子功能域；PM2：低頻變異；PP3：兩種統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測(cè)出變異對(duì)基因產(chǎn)物有影響；PP1：該家系成員中支持共分離。

3 討論

隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，全外顯子組測(cè)序已廣泛應(yīng)用于臨床，很多疑難、罕見的遺傳性疾病得以明確診斷。全外顯子組測(cè)序即采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)人類全部外顯子區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)分析，因高通量、高效、高準(zhǔn)確率等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)遺傳性耳聾致病基因的重要手段之一。本研究采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)一個(gè)3代耳聾家系進(jìn)行致病基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該家系為PRPS1基因突變所致耳聾，為家系的遺傳咨詢及后續(xù)高危胎兒的產(chǎn)前診斷提供了有力依據(jù)。

PRPS1基因位于X染色體長(zhǎng)臂，長(zhǎng)約36 000 bp，由7個(gè)外顯子組成，編碼磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRS1)。PRS1是核苷酸合成的關(guān)鍵酶，參與嘌呤、吡啶和嘧啶核苷酸的合成以及許多重要的細(xì)胞功能[9]，如能量代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[11]證明PRPS1基因在小鼠耳蝸和毛細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)內(nèi)耳的發(fā)育和維持起著重要作用。

PRPS1基因突變可導(dǎo)致PRS1六聚體晶體結(jié)構(gòu)改變，下游代謝產(chǎn)物對(duì)其活性調(diào)控發(fā)生異常，使PRS1活性異常增高或降低，最終引起疾病發(fā)生[12]?；钚栽龈呖梢疠p重度PRS1超活性(MIM#300661)；臨床表現(xiàn)可有尿酸增高、痛風(fēng)，也可伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如感音神經(jīng)性耳聾、肌張力下降、共濟(jì)失調(diào)等[13]?；钚越档涂蓪?dǎo)致非綜合征性耳聾DFN2(MIM#304500)、腓骨肌萎縮癥(Charcot-Marie-tooth disease,CMT)-X5(MIM#311070)、Arts綜合征(MIM#301835)。有研究[12]表明PRS1活性降低程度與臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度明顯相關(guān)，其他學(xué)者[8]在西班牙家系中也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。DFN2患者的PRS1活性降低程度最輕，患者多表現(xiàn)為先天性或語(yǔ)后進(jìn)展性感音神經(jīng)性耳聾；CMT-X5的PRS1活性降低程度較DFN2患者重，除聽力異常外,還有視力障礙和周圍神經(jīng)病等表現(xiàn)；Arts綜合征的PRS1活性降低程度最重，除上述表現(xiàn)外，還存在早發(fā)性肌張力低下、智力低下、運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后、共濟(jì)失調(diào)及感染風(fēng)險(xiǎn)增加等。這3種PRS1活性降低疾病的表型可有一定交叉，其中耳聾為唯一共同的癥狀，可作為發(fā)現(xiàn)此類疾病的關(guān)鍵。PRPS1基因突變所致疾病為X連鎖隱性遺傳，累及患者多為男性，女性攜帶者可無癥狀或出現(xiàn)不同程度的癥狀。而男性Arts綜合征患者多易受感染，尤其是上呼吸道感染，多在5歲之前夭折，故臨床中男性Arts綜合征患者少見。

本研究測(cè)序結(jié)果顯示先證者的PRPS1基因存在c.46 T>C突變，此變異曾在一西班牙耳聾家系中報(bào)道過[8]。該突變靠近蛋白質(zhì)N端結(jié)構(gòu)域，可導(dǎo)致第16位絲氨酸被脯氨酸取代，此位點(diǎn)在人、獼猴、小鼠、褐家鼠、牛、狼、原雞等多物種中高度保守。根據(jù)ACMG指南[7]，該變異為致病性的。有學(xué)者[14]在一個(gè)英國(guó)家系中發(fā)現(xiàn)了該基因第16位氨基酸變異。PRPS1基因突變所致疾病具有明顯的異質(zhì)性，同一突變或同一氨基酸位點(diǎn)突變的臨床表現(xiàn)不同。已報(bào)道的西班牙家系中患者均為女性，同時(shí)有Arts綜合征及CMT-X5綜合征的部分臨床表現(xiàn)，如視神經(jīng)萎縮、視野狹窄、視網(wǎng)膜色素變性、視力損傷等視力異常及聽力受損、輕度發(fā)育遲緩、肌張力減退、周圍神經(jīng)病變、共濟(jì)失調(diào)等癥狀。本家系先證者具有Arts綜合征的典型表現(xiàn)：感音神經(jīng)性耳聾、視力異常、發(fā)育遲緩等，符合該綜合征的臨床診斷。Ⅰ-2、Ⅱ-2僅表現(xiàn)為輕度耳聾，Ⅱ-3表現(xiàn)為極重度耳聾，無其他臨床表現(xiàn)。經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證，Ⅰ-2、Ⅱ-2、Ⅲ-3均為PRPS1基因c.46 T>C突變攜帶者。家系中患者的臨床表現(xiàn)差異可能與PRS1活性降低的程度不同有關(guān)。本家系中已夭折的Ⅲ-1存在雙耳耳聾、眼球震顫、視力異常、發(fā)育遲緩、腹脹等癥狀，雖未能對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)驗(yàn)證，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，推測(cè)為Arts綜合征。本家系中除Ⅲ-1外，其他患者均為女性，且均有不同程度的癥狀。該情況可能為X染色體隨機(jī)失活，亦可能為男性胎兒孕期致死所致。

綜上，本研究通過對(duì)1個(gè)遺傳性綜合征性耳聾家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其致病原因?yàn)镻RPS1基因c.46 T>C突變，先證者的臨床表現(xiàn)符合Arts綜合征的診斷，與PRPS1基因突變所致疾病一致。基因檢測(cè)為耳聾家系的臨床診斷、遺傳咨詢以及后續(xù)的產(chǎn)前診斷提供了有力依據(jù)。