宏基因組測序診斷沃林斯基分枝桿菌所致感染性心內(nèi)膜炎一例

于鳳儀，劉志煜，呂 炎，鄭穎穎，唐俊楠，張金盈

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052 2)河南省心臟損傷修復(fù)重點實驗室 鄭州 450052

感染性心內(nèi)膜炎(infective endocarditis,IE)是發(fā)生在心臟內(nèi)膜表面的感染性疾病，30 d內(nèi)病死率約為20%[1]，1 a可達(dá)37.1%[2]。其臨床癥狀不典型，但常伴隨多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如心力衰竭、膿毒血癥、贅生物血栓形成等，血栓脫落可導(dǎo)致肺、腦、脾等器官血管栓塞，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[3]。因此，及時明確診斷、盡早有效治療至關(guān)重要。血培養(yǎng)是感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但對苛養(yǎng)菌和罕見致病菌不敏感。因此， PCR、宏基因組測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)等基因檢測手段在IE診斷中逐漸得到應(yīng)用。mNGS是一種廣譜病原學(xué)篩查技術(shù)，理論上可以對樣本中全部DNA或RNA序列進(jìn)行無差別混合測序，在罕見病原體及重癥感染的診斷中具有明顯優(yōu)勢[4]?，F(xiàn)報道應(yīng)用mNGS診斷罕見病原菌沃林斯基分枝桿菌所致IE一例，以供臨床參考。

1 臨床資料

1.1 一般資料患兒，女，3歲，于2019年9月因發(fā)熱就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)及腫瘤超早期篩查圖形均提示急性淋巴細(xì)胞白血病。此后1 a間規(guī)律返院化療，10次行中心靜脈置管(peripherally inserted central catheter,PICC)。2020年3月5日超聲顯示心內(nèi)結(jié)構(gòu)及功能無明顯異常。

2020年8月11日以“確診急性淋巴細(xì)胞白血病1 a，發(fā)熱1 d”入院，查白細(xì)胞計數(shù)0.77×109個/L(參考范圍3.50×109～9.50×109個/L)，紅細(xì)胞計數(shù)3.76×1012個/L(參考范圍4.30×1012～5.80×1012個/L)，血紅蛋白102 g/L(參考范圍130～175 g/L)，血小板計數(shù)106×109個/L(參考范圍125×109～350×109個/L)，中性粒細(xì)胞百分比4%(參考范圍40%～75%)，C反應(yīng)蛋白127 mg/L(參考范圍0～5 mg/L)，降鈣素原0.304 μg/L(參考范圍0.000～0.046 μg/L)，肌酸激酶同工酶21 U/L(參考范圍0～24 U/L)；心臟超聲提示三尖瓣贅生物形成(圖1A、B)；心電圖示竇性心動過速(圖2)；血培養(yǎng)結(jié)果顯示為非結(jié)核分枝桿菌，革蘭陽性桿菌?？紤]為非結(jié)核分枝桿菌引起的膿毒血癥及IE。

A、B:2020年8月18日影像，提示贅生物形成；C、D：2021年2月24日影像，提示贅生物增大

圖2 沃林斯基分枝桿菌所致IE患兒竇性心動過速心電圖

1.2 治療方法入院給予頭孢吡肟聯(lián)合利福霉素經(jīng)驗性抗感染方案，2020年8月12日同時聯(lián)用左氧氟沙星、阿奇霉素，患兒無明顯好轉(zhuǎn)，輔以地塞米松抗炎治療，患兒體溫降至正常，但仍間斷發(fā)熱。經(jīng)?？茣\后于2020年8月29日起給予阿米卡星每日1次，每次90 mg，靜脈滴注；頭孢西丁鈉每日1次，每次480 mg，靜脈滴注；莫西沙星每日1次，每次120 mg，靜脈滴注。應(yīng)用后患兒體溫降至正常。10 d后停用莫西沙星，繼續(xù)阿米卡星聯(lián)合頭孢西丁鈉方案。2020年9月8日拔除PICC。2020年9月10日再次發(fā)熱，背部可見散在淡紅色皮疹。院內(nèi)復(fù)查血培養(yǎng)陽性，復(fù)查CT示：兩肺輕度感染，程度較2020年8月1日加重。繼續(xù)給予上述抗感染治療方案后，患兒體溫穩(wěn)定，未再發(fā)熱。2020年10月12日家屬要求出院?；純涸和庖?guī)律口服克拉霉素每日2次，每次125 mg，發(fā)熱2次，無咳嗽、咳痰、腹瀉、皮疹等癥狀，給予物理降溫后體溫恢復(fù)正常。

2020年12月31日因發(fā)熱2 d返院，查白細(xì)胞計數(shù)0.77×109個/L，C反應(yīng)蛋白42 mg/L，降鈣素原1.260 μg/L，血紅蛋白75 g/L，血小板計數(shù)56×109個/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶237 U/L(參考范圍0～40 U/L)，總蛋白44 g/L(參考范圍60～85 g/L)，D-二聚體6.04 mg/L(參考范圍0.00～0.55 mg/L)；血培養(yǎng)回示假分枝桿菌；血液mNGS結(jié)果回示沃林斯基分枝桿菌，檢出序列數(shù)1 437，相對豐度20.6%；復(fù)查心臟超聲示三尖瓣贅生物形成，三尖瓣中重度關(guān)閉不全，未提示明顯變化。院內(nèi)多學(xué)科會診后，IE診斷及病原菌均明確，根據(jù)以往用藥經(jīng)驗給予阿米卡星聯(lián)合頭孢西丁鈉、克拉霉素抗感染治療，輔以利尿、補(bǔ)充白蛋白、成分輸血、維持水電解質(zhì)平衡等對癥支持治療，患兒體溫穩(wěn)定，心功能、體循環(huán)淤血改善。告知家屬血栓形成、惡性心律失常、遷移性膿腫等風(fēng)險，建議外科手術(shù)治療，家屬拒絕。復(fù)查炎癥指標(biāo)：C反應(yīng)蛋白17 mg/L，降鈣素原0.257 μg/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶77 U/L，D-二聚體1.10 mg/L。2021年1月26日給予三聯(lián)鞘內(nèi)注射1次預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。2021年1月28日再次發(fā)熱，熱峰38.6 ℃，復(fù)查白細(xì)胞計數(shù)11.71×109個/L，血紅蛋白75 g/L，血小板計數(shù)294×109個/L，中性粒細(xì)胞絕對值9.47×109個/L。繼續(xù)予以原方案鞏固治療，隨后患兒體溫穩(wěn)定，未再訴發(fā)熱等不適，于2021年2月9日出院。

2021年2月24日，患兒因發(fā)熱5 d返院，院內(nèi)繼續(xù)給予阿米卡星聯(lián)合頭孢西丁鈉、克拉霉素抗感染及利尿、給予白蛋白等對癥支持治療。復(fù)查心臟超聲示贅生物較前增大(圖1C、D)，CT示雙肺感染較前好轉(zhuǎn)。2021年3月6日于心外科行“三尖瓣贅生物清除術(shù)+三尖瓣生物瓣膜置換術(shù)”。贅生物病理結(jié)果(圖3)回示：三尖瓣贅生物纖維組織中見多量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，伴壞死及鈣化，呈局灶黏液樣。贅生物mNGS結(jié)果為沃林斯基分枝桿菌，檢出序列數(shù)2 726 246，相對豐度97.19%。

圖3 患兒心臟贅生物組織HE染色結(jié)果(×10)

1.3 結(jié)果患兒術(shù)后當(dāng)天即出現(xiàn)多臟器功能衰竭、嚴(yán)重感染，且凝血功能差，考慮合并DIC。經(jīng)評估患兒死亡風(fēng)險較高，經(jīng)反復(fù)溝通后家屬于2021年3月9日要求出院，患兒出院數(shù)日后于院外死亡。

2 討論

非結(jié)核分枝桿菌是一種廣泛存在于土壤、水源中的微生物，大部分屬于快速生長型分枝桿菌(rapidly growing mycobacteri,RGM)，即其傳代時間通常在7 d以內(nèi)，生長速度明顯快于其他類型分枝桿菌。沃林斯基分枝桿菌是一種臨床罕見的RGM，于1999年首次發(fā)現(xiàn)并歸類為恥垢分枝桿菌[5]。沃林斯基分枝桿菌感染人體的臨床資料較為缺乏。IE在兒童中發(fā)病率較低，1歲以內(nèi)嬰兒約為3.3/100 000，較大兒童和青少年為(0.3～0.8)/100 000[6]，但病死率可達(dá)1%～5%[7]，常見的嚴(yán)重并發(fā)癥如心力衰竭、膿毒血癥、腦梗死等可明顯增加死亡風(fēng)險。絕大多數(shù)IE患兒高危因素明確，如先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、PICC及其他心臟裝置植入等。本例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒長期處于免疫抑制狀態(tài)，院內(nèi)治療需要反復(fù)置入PICC，機(jī)會感染及IE風(fēng)險明顯高于一般人群[8]。

血培養(yǎng)是感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，對臨床用藥具有指導(dǎo)意義。但細(xì)菌培養(yǎng)耗時長，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且無法檢出病毒感染。研究[9]表明，血培養(yǎng)陰性IE占IE患者的35%。送檢前使用抗生素治療、病原菌培養(yǎng)條件苛刻或生長速度緩慢等均是可能的原因[10]。因此，當(dāng)發(fā)熱患者血培養(yǎng)結(jié)果為陰性時，臨床醫(yī)生仍無法確定患者是否由未能檢出的病原體引發(fā)感染。

為了提高病原體診斷的速度和準(zhǔn)確性，基因測序已成為感染性疾病診斷中繼血生化和血培養(yǎng)之后的重要方法。但由于PCR只能根據(jù)人工設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增，只能在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)對病原體進(jìn)行檢測，罕見病原體感染或重癥感染病例仍然難以確診，可能導(dǎo)致患者病程增長、所受治療不充分乃至病死率升高等一系列不良后果。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，mNGS在感染性疾病診斷、病原體進(jìn)化跟蹤和耐藥性評估中逐漸發(fā)揮重要作用。研究[11]發(fā)現(xiàn)，以血培養(yǎng)和PCR綜合結(jié)果作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)時，Illumina測序的敏感度和特異度分別為79.2%、90.6%。但mNGS在IE診斷中應(yīng)用尚不充分，文獻(xiàn)報道較少。有研究[12]表明，mNGS對IE患者瓣膜組織的測序敏感度可達(dá)100%，有利于指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥。本病例mNGS測出瓣膜組織中沃林斯基分枝桿菌序列數(shù)2 726 246，相對豐度97.19%，與血培養(yǎng)結(jié)果一致，且顯著高于外周血結(jié)果。mNGS在敏感捕捉病原體基因序列的同時，也將對混入標(biāo)本的人體DNA、RNA或環(huán)境污染微生物序列進(jìn)行無差別擴(kuò)增，健康標(biāo)本也可出現(xiàn)陽性結(jié)果。測序過程中可通過多種手段降低干擾，如設(shè)立對照組、將結(jié)果與人類基因組比對、對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制等。但即便如此，臨床醫(yī)生在解讀測序結(jié)果時也應(yīng)當(dāng)慎重，不能單純根據(jù)測序豐度或序列比例判斷致病菌，而應(yīng)將測序結(jié)果與患者病情、其他檢查結(jié)果、當(dāng)?shù)爻Ｒ娢廴疚⑸锓N類等各方面因素結(jié)合后進(jìn)行綜合判斷，準(zhǔn)確區(qū)分致病菌和背景菌，從而制定精準(zhǔn)有效的抗生素治療方案。

各國指南推薦的IE抗感染療程通常為4～6周[13]，兒童與成年人的治療原則基本一致[14]。沃林斯基分枝桿菌臨床資料較少，暫無標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，其對大環(huán)內(nèi)酯類藥物及阿米卡星敏感，符合本例中的經(jīng)驗性用藥方案，且用藥后患兒體溫和多項指標(biāo)有好轉(zhuǎn)，說明抗生素治療有效。本例患兒3次因IE入院，阿米卡星聯(lián)合頭孢西丁鈉方案療程分別為44、40、14 d。除末次入院外，所用抗生素療程基本符合IE要求，但仍短于既往大多數(shù)合并沃林斯基分枝桿菌感染的病例?；純涸谥委熯^程中存在外科手術(shù)指征，但關(guān)于IE患者能否從早期手術(shù)獲益這一問題，過去數(shù)十年間的回顧性研究[15]未能得到統(tǒng)一的結(jié)論，可能與統(tǒng)計學(xué)方法不同、未能矯正幸存者偏倚等原因有關(guān)。第2次抗生素治療期間，綜合心外科評估后建議其手術(shù)治療，家屬拒絕，手術(shù)延遲至2021年3月6日?；純盒g(shù)后預(yù)后較差，可能與手術(shù)時機(jī)、綜合病情復(fù)雜等原因有關(guān)。

綜上所述，及時、合理的抗生素應(yīng)用是IE治療中必不可少的一環(huán)。對于持續(xù)感染、血培養(yǎng)陰性的IE患者而言，mNGS是一種較為高效的診斷方式。其檢測時間短、敏感度高，對于快速診斷病原體及制定精準(zhǔn)用藥方案有一定意義。但由于mNGS在IE患者中應(yīng)用尚不廣泛，其診斷優(yōu)勢和局限仍待進(jìn)一步探索。