P因子介導(dǎo)的C5a/C5aR軸活化在IgA腎病腎臟足細(xì)胞損傷中的作用

丁苗慧，張 穎，李 遠(yuǎn)，周雅麗，邢國(guó)蘭

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州450052

IgA腎病是導(dǎo)致終末期腎衰的常見原發(fā)性腎小球疾病[1-2]。蛋白尿是影響IgA腎病進(jìn)展及預(yù)后的最主要因素之一，也是臨床治療的重點(diǎn)。目前大量糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的應(yīng)用副作用大，且并未收到很好療效。既往有研究[3]顯示腎小球疾病的蛋白尿與足細(xì)胞損傷有直接關(guān)系；有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞足突融合、去分化及脫落是導(dǎo)致蛋白尿、腎小球硬化及濾過衰竭的主要原因。因此，研究足細(xì)胞損傷機(jī)制對(duì)于延緩IgA腎病進(jìn)展及改善預(yù)后意義重大，也有望為IgA腎病蛋白尿的治療提供新思路。近年大量研究[5]證實(shí)補(bǔ)體激活參與IgA腎病的發(fā)病及進(jìn)展。目前補(bǔ)體激活在足細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制研究主要集中在膜攻擊復(fù)合物C5b-9相關(guān)的分子途徑[6-7]。依庫(kù)珠單抗是一種結(jié)合C5的單克隆抗體，可以抑制C5的裂解進(jìn)而減少C5b-9的形成。既往有研究[8]報(bào)道快速進(jìn)展的IgA腎病患者在接受依庫(kù)珠單抗治療后蛋白尿減少、腎功能好轉(zhuǎn)。P因子是補(bǔ)體活化的正向調(diào)節(jié)因子 ，有研究[9]發(fā)現(xiàn)75%～100%的IgA腎病患者腎組織中有P因子沉積。近年研究[10]顯示，糖尿病腎病患者腎臟的足細(xì)胞上C5aR表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明C5a/C5aR軸活化在腎臟足細(xì)胞損傷中發(fā)揮了重要作用，因此推測(cè)C5a/C5aR過度活化也參與了IgA腎病足細(xì)胞損傷的發(fā)生。本研究將從P因子介導(dǎo)C5a/C5aR軸活化這個(gè)新視角揭示IgA腎病足細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制，為IgA腎病大量蛋白尿的臨床治療開拓新的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2014年9月至2019年9月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的IgA腎病患者，均經(jīng)腎穿刺活檢病理結(jié)果(包括光鏡和電鏡)證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有急性(亞急性)腎小管損傷、急性(亞急性)間質(zhì)性腎炎。②合并有其他原發(fā)性、繼發(fā)性及遺傳性腎小球疾病。③合并自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤、感染、妊娠、藥物等與補(bǔ)體活化相關(guān)的疾病。④既往曾應(yīng)用激素及免疫抑制劑治療。共入選60例患者，再根據(jù)24 h尿蛋白定量分為少量蛋白尿IgA腎病組(24 h尿蛋白定量<1 g)、中量蛋白尿IgA腎病組(24 h尿蛋白定量1～3.5 g)、大量蛋白尿IgA腎病組(24 h尿蛋白定量>3.5 g)各20例(取腎穿刺活檢后的剩余標(biāo)本進(jìn)行本次研究)。

同時(shí)收集在本院行腎臟腫瘤切除術(shù)的20例患者的遠(yuǎn)離腫瘤組織5 cm以上、病理診斷為正常的腎組織作為對(duì)照1組。選取20例體檢健康的成人血清及尿液樣本作為對(duì)照2組。本研究獲得該醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 大量蛋白尿IgA腎病組腎組織中足細(xì)胞損傷程度的電鏡檢查將大量蛋白尿IgA腎病組患者腎組織和對(duì)照1組的標(biāo)本用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛固定4 h，PBS浸洗；體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定90 min，PBS浸洗；丙酮脫水、浸透，包埋、切片。將厚70 nm的切片置于銅網(wǎng)上，于醋酸鈾染液中室溫染25 min，蒸餾水洗凈后濾紙吸干，再置于檸檬酸鉛染液中室溫染20 min；蒸餾水洗凈濾紙吸干透射電鏡下觀察。

1.3 腎組織中足細(xì)胞凋亡的Tunel與裂隙膜蛋白Nephrin的共染觀察將石蠟固定的腎組織按3 μm厚連續(xù)切片，60 ℃烤片，常規(guī)脫蠟、水化，PBS浸洗，50 mg/L蛋白酶K消化，室溫濕盒中放置10 min，PBS浸洗；滴加兔抗人Nephrin多克隆抗體(按1∶50稀釋，英國(guó)Abcam公司)，4 ℃過夜，PBS浸洗；加二抗Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(按1∶50稀釋，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，37 ℃避光孵育1 h；滴加Tunel反應(yīng)液(長(zhǎng)沙愛科博生物科技有限公司)在37 ℃濕盒中避光孵育1 h；加2×SSC溶液終止反應(yīng)，PBS浸洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 大量蛋白尿IgA腎病組腎組織中P因子或C5aR、C5b-9與Nephrin共表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)將石蠟固定的腎組織按3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，PBS浸洗，高溫高壓熱修復(fù)，胰酶修復(fù)；同時(shí)滴加小鼠抗人P因子或C5aR、C5b-9單克隆抗體(均按1∶50稀釋，美國(guó)Santa Cruz公司)、兔抗人Nephrin多克隆抗體(按1∶50稀釋，英國(guó)Abcam公司)，4 ℃濕盒過夜，滴加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG(均按1∶50稀釋，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)37 ℃避光孵育1 h，PBS浸洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 血清及尿液中P因子水平的ELISA法測(cè)定血清標(biāo)本采集后立即在4 ℃下1 500×g離心10 min，收集上清液于EP管中，與尿液均置于-80 ℃冰箱備用。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒(荷蘭Hycult Biotech公司)說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定(由于尿P因子水平受尿液濃縮稀釋因素影響，因此利用尿肌酐對(duì)尿液P因子水平進(jìn)行校正)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組血清、尿液中P因子水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大量蛋白尿IgA腎病組腎臟組織中足細(xì)胞形態(tài)的電鏡觀察結(jié)果見圖1。由圖1可知，電鏡下可見大量蛋白尿IgA腎病患者腎組織中足細(xì)胞足突彌漫融合。

A：對(duì)照1組；B～D：大量蛋白尿IgA腎病組，紅色箭頭示足細(xì)胞足突融合，黃色三角示系膜區(qū)電子致密物沉積

2.2 各組腎組織中足細(xì)胞凋亡的共染結(jié)果見圖2。凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光灶，Nephrin陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光灶。由圖2可知，大量蛋白尿IgA腎病組腎組織中Nephrin免疫熒光強(qiáng)度減弱，提示存在足細(xì)胞損傷；大量蛋白尿IgA腎病患者腎組織的凋亡足細(xì)胞較對(duì)照1組增多。

圖2 各組腎組織Tunel與Nephrin免疫熒光共染結(jié)果

2.3 大量蛋白尿IgA腎病組和對(duì)照1組腎組織中P因子或C5aR、C5b-9與Nephrin共染結(jié)果見圖3～5。

圖3 大量蛋白尿IgA腎病組與對(duì)照1組腎組織中P因子與Nephrin免疫熒光共染結(jié)果

圖4 大量蛋白尿IgA腎病組與對(duì)照1組腎組織中C5aR與Nephrin免疫熒光共染結(jié)果

圖5 大量蛋白尿IgA腎病組與對(duì)照1組腎組織中C5b-9與Nephrin免疫熒光共染結(jié)果

綠色熒光標(biāo)記的P因子或C5aR、C5b-9與紅色熒光標(biāo)記的Nephrin在腎小球足細(xì)胞上重合為黃色熒光，結(jié)果表明P因子或C5aR、C5b-9與Nephrin在大量蛋白尿IgA腎病患者腎組織的足細(xì)胞上存在共定位，足細(xì)胞上P因子或C5aR、C5b-9的沉積明顯強(qiáng)于對(duì)照1組。

2.4 各組血清、尿液中P因子水平的比較結(jié)果見表1。由表1可知，大量蛋白尿IgA腎病組血清P因子水平高于對(duì)照2組、少量及中量蛋白尿IgA腎病組。少量及大量蛋白尿IgA腎病組尿液P因子/尿肌酐水平高于對(duì)照2組，大量蛋白尿IgA腎病組升高的更為明顯。

表1 各組血清、尿液中P因子水平的比較

3 討論

IgA腎病起病隱匿，臨床表現(xiàn)多種多樣，目前發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，約40%的IgA腎病患者在發(fā)病20 a后進(jìn)展為終末期腎病[11]。蛋白尿是影響IgA腎病進(jìn)展及預(yù)后的最主要因素之一。腎小球?yàn)V過屏障是由排列在毛細(xì)血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞組成，足細(xì)胞是腎小球中高度特化的上皮細(xì)胞，足細(xì)胞裂隙膜蛋白是調(diào)節(jié)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的多蛋白復(fù)合體，可以影響腎小球?yàn)V過膜的通透性及蛋白尿的產(chǎn)生。目前較為公認(rèn)的IgA腎病發(fā)病機(jī)制是IgA1免疫球蛋白與其抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物并在腎小球系膜區(qū)聚積，通過激活補(bǔ)體旁路途徑或凝集素途徑引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成腎臟損傷[12-13]。

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，P因子是補(bǔ)體旁路途徑的唯一正向調(diào)節(jié)因子，能穩(wěn)定補(bǔ)體旁路途徑激活過程中的C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb，C3bBb可裂解C3為C3a和C3b，C3b參與形成C5轉(zhuǎn)化酶，進(jìn)一步裂解C5形成C5a和C5b。C5a是補(bǔ)體活化過程中產(chǎn)生的主要致炎物質(zhì)，C5a與其特異性受體C5aR結(jié)合，從而促進(jìn)腎組織中炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[14-15]；C5b則與另外4種補(bǔ)體蛋白(C6、C7、C8、C9)結(jié)合形成膜攻擊復(fù)合物C5b-9，C5b-9通過破壞細(xì)胞的完整性引起細(xì)胞損傷和組織炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟損傷。

Nephrin是一種重要的足細(xì)胞裂隙膜蛋白，本研究結(jié)果顯示大量蛋白尿IgA腎病患者腎臟組織中足細(xì)胞足突彌漫融合，足細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，證實(shí)IgA腎病確實(shí)存在足細(xì)胞損傷和凋亡。

P因子可以作為血清、尿液或腎組織中IgA腎病的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)可能發(fā)展為大量蛋白尿或嚴(yán)重腎功能不全的IgA腎病患者[16]。免疫熒光染色結(jié)果顯示：大量蛋白尿IgA腎病患者腎組織中足細(xì)胞上P因子的沉積增強(qiáng)，說(shuō)明P因子參與了IgA腎病足細(xì)胞的損傷。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：大量蛋白尿IgA腎病患者血清及尿液中的P因子水平均高于對(duì)照2組，提示在全身循環(huán)系統(tǒng)及腎臟局部均有補(bǔ)體旁路途徑的過度活化。

依庫(kù)珠單抗是一種選擇性抑制C5的單克隆抗體，能抑制C5a釋放和C5b-9形成，目前已有一些使用依庫(kù)珠單抗治療IgA腎病的成功案例[17]；Avacopan又稱CCX168，是一種口服給藥的選擇性C5aR抑制劑，通過與C5aR結(jié)合阻止破壞性炎癥細(xì)胞對(duì)C5a激活產(chǎn)生反應(yīng)，研究顯示C5aR抑制劑與大劑量糖皮質(zhì)激素具有類似的療效，可以用于治療ANCA相關(guān)性血管炎腎損害[18]；Zhang等[19]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制C5aR可能是治療IgA腎病的有效措施。

免疫熒光染色結(jié)果還顯示：大量蛋白尿IgA腎病患者腎組織足細(xì)胞上C5aR的表達(dá)和C5b-9的沉積較對(duì)照1組增強(qiáng)，表明補(bǔ)體C5a/C5aR活化與IgA腎病足細(xì)胞損傷密切相關(guān)；C5a單克隆抗體和C5aR抑制劑可以減輕由C5a-C5aR軸活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而延緩IgA腎病的進(jìn)展。

綜上所述，C5a/C5aR軸過度活化可能參與了IgA腎病腎臟足細(xì)胞損傷的發(fā)生。以上研究提示補(bǔ)體抑制治療可能是預(yù)防和減少IgA腎病中腎小球足細(xì)胞損傷的潛在治療方案，后續(xù)我們也將試驗(yàn)性應(yīng)用依庫(kù)珠單抗治療難治性IgA腎病。