雜交鲌(翹嘴鲌♀×黑尾近紅鲌♂)消化系統(tǒng)形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征研究

吉哲慧，李 清，蔣 明，孫艷紅，陸 星，陳 見(jiàn)，李 佩，魏輝杰，李明光，王貴英

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，武漢 430207；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；3.武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，武漢 430207)

雜交鲌(國(guó)審水產(chǎn)新品種名稱：雜交鲌“先鋒1號(hào)”)是以經(jīng)選育的丹江口水庫(kù)翹嘴鲌(Erythroculterilishaeformis，♀)與長(zhǎng)江上游黑尾近紅鲌(Ancherythroculternigrocauda，♂)通過(guò)屬間雜交的子代，其具有生長(zhǎng)速度快，飼料最適蛋白質(zhì)含量低、飼料成本低，肉質(zhì)好，抗應(yīng)激、性情溫順、起捕率高，易活魚(yú)上市等優(yōu)良特點(diǎn)[1,2]，已經(jīng)成為我國(guó)鲌類養(yǎng)殖新品種。當(dāng)前對(duì)雜交鲌營(yíng)養(yǎng)消化生理的研究還較為缺乏，對(duì)其食性也還存在不同的爭(zhēng)議。

消化系統(tǒng)是魚(yú)類消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)的生理結(jié)構(gòu)[3]。目前，國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于魚(yú)類消化道形態(tài)解剖和組織結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道[4,5]，通過(guò)對(duì)魚(yú)體消化器官形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、組織化學(xué)等進(jìn)行探索研究，有助于深入了解魚(yú)類對(duì)攝食餌料的選擇、分解、消化和吸收的內(nèi)在機(jī)制[6,7]，還可以為人工餌料開(kāi)發(fā)[8-9]及苗種培育技術(shù)提供理論依據(jù)[10-11]。硬骨魚(yú)類的消化道結(jié)構(gòu)與其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收特點(diǎn)相適應(yīng)，與食性具有極高的相關(guān)性，且不同魚(yú)種間存在差異。因此，本研究通過(guò)掃描電鏡技術(shù)、石蠟包埋切片及HE染色等方法，對(duì)雜交鲌消化道全長(zhǎng)及其各消化器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，旨在查明雜交鲌消化道形態(tài)學(xué)和組織學(xué)特征，為其營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究以及人工養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和科學(xué)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用雜交鲌來(lái)源于武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司，體質(zhì)量為(192.04±40.45) g。樣品采集前，魚(yú)體饑餓24 h。

1.2 樣品采集及處理

采用80 mg/L MS 222將31尾雜交鲌麻醉，用2 mL注射器抽取尾靜脈血樣置于1.5 mL離心管中，4 ℃下靜置4 h后以3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃保存用于血清生化指標(biāo)測(cè)定。對(duì)樣本外部形態(tài)包括全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、吻長(zhǎng)、口咽腔長(zhǎng)、口裂長(zhǎng)和寬進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)。然后自肛門(mén)沿腹中線縱剪至下頜，向左側(cè)背方橫剪至椎體附近，再向前縱剪至鰓蓋后部；取下左側(cè)體壁并剪去左側(cè)鰓蓋骨，打開(kāi)魚(yú)體腔和口咽腔，對(duì)其消化系統(tǒng)中各組織進(jìn)行拍照并測(cè)量食道和消化道長(zhǎng)度，記錄鰓耙數(shù)目和咽齒數(shù)目。另取各段消化道組織用4%多聚甲醛固定。

組織HE染色切片的制作：取唇、口咽腔、食道、腸(前、中、后)、肝胰臟、膽囊組織，分別固定于多聚甲醛溶液，固定時(shí)間24 h，組織固定后用70%乙醇清洗多余的多聚甲醛溶液，再保存于70%乙醇中備用。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，連續(xù)石蠟切片，切片厚度為5～7 μm，HE染色，中性膠封片，Olympus顯微鏡下觀察拍照。

掃描電鏡切片的制作：取前、中、后腸部分，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定后，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定，之后酒精梯度濃度脫水，真空冷凍干燥、鍍金后，于HITACHI Regulus 8100 型掃描電鏡下觀察并拍攝。

1.3 數(shù)據(jù)處理

消化道組織學(xué)特征包括黏膜褶數(shù)量、黏膜褶高度、黏膜褶寬度、肌層厚度測(cè)量；隨機(jī)選取7張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量。杯狀細(xì)胞密度：分別計(jì)數(shù)每一視野中(50×50) μm2范圍內(nèi)粘液細(xì)胞的總數(shù)，作為粘液細(xì)胞的密度。

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)差異分析(SPSS Chicago IL，USA)。將所有數(shù)據(jù)分組后，進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)組間差異顯著(P<0.05)時(shí)，采用Tukey檢驗(yàn)比較不同處理間的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交鲌外部形態(tài)學(xué)和消化系統(tǒng)生物學(xué)性狀

雜交鲌生物學(xué)性狀的相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1；表2列出了雜交鲌消化系統(tǒng)生物學(xué)性狀的相關(guān)指標(biāo)。

表1 雜交鲌外部形態(tài)學(xué)測(cè)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.1 External morphological measurement of the hybrid culter(Mean ± SEM，n=31)

表2 雜交鲌消化道生物學(xué)性狀的測(cè)量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.2 Measurement of biological traits in the digestive indexes of hybrid culter(Mean±SEM，n=31)

2.2 消化系統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征

雜交鲌消化系統(tǒng)由消化道及其所粘附的各種消化腺組成，主要包括口、咽、食道、腸、肛門(mén)、肝胰臟和膽囊。其腹腔內(nèi)有大量脂肪堆積，大部分消化道被脂肪覆蓋(圖1-1)。

口：雜交鲌口位屬亞上位，口裂較大，無(wú)須。

口咽腔(圖1-2)：雜交鲌口腔和咽腔無(wú)明顯分界，上下頜之間關(guān)節(jié)靈活，口腹面可觀察到骨間有褶疊的皮膜，口可張開(kāi)較大并向前伸出成管狀，口腔容積較大?？谇粌?nèi)上下皮層光滑，有色素分布，無(wú)顎褶。舌不明顯，僅基舌骨稍突出，結(jié)締組織和口腔黏膜稍增厚?？谇豁敱谟袃商幇咨琴|(zhì)凸起。上下顎均無(wú)牙齒，有五對(duì)鰓弓，鰓耙粗短而疏但很尖，鰓耙數(shù)約 13～14枚，第五鰓弓內(nèi)側(cè)具有咽齒；口咽腔與腹腔之間由一層薄膜隔開(kāi)。

食道：雜交鲌食道直而粗短，管壁厚而具有彈性，是連接咽與腸的管道；食道背壁有肌肉層與體壁相連，內(nèi)壁有縱行黏膜褶，末端與腸連接處有一環(huán)形括約肌，當(dāng)吞咽食物時(shí)可借黏膜褶擴(kuò)大或縮小食道的孔徑。

腸(圖1-3)：腸道呈z字形盤(pán)于腹腔中，以折疊位置為節(jié)點(diǎn)可將腸道大致分為三部分：前腸、中腸、后腸。通過(guò)掃描電鏡觀察(圖2所示)，雜交鲌腸道黏膜縱向隆起，形成黏膜初褶，其表面分布有大量次級(jí)黏膜褶。腸道粘膜表面有很多呈洞穴狀的分泌小孔(SP)和一些分泌的蛋白顆粒(P)。前腸的分泌小孔較少，表面上皮細(xì)胞形態(tài)邊界不明顯，微絨毛(MV)長(zhǎng)度也較短，整體比較平整。中腸整體結(jié)構(gòu)與前腸相似，表面上皮細(xì)胞(EC)呈多邊形，細(xì)胞邊界不明顯，但分泌小孔大而多，微絨毛較長(zhǎng)。后腸黏膜的表面上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的多邊形態(tài)，分泌小孔小而密集，微絨毛短而粗。

圖1 雜交鲌解剖觀察圖Fig.1 Anatomical observation of hybrid culter1：全魚(yú)解剖圖；2：口咽腔解剖圖；3：腹腔解剖圖；SN：吻部；M：系膜；LP：脂肪；UO：口腔上顎；DO：口腔下顎；GB：膽囊；L：肝臟；G：腸；LP：脂肪；A：肛門(mén)。

圖2 雜交鲌前腸、中腸、后腸掃描電鏡圖Fig.2 Hybrid culter foregut，midgut，and hindgut scanning electron microscopy1、4、7、10：前腸；2、5、8、11：中腸；3、6、9、12：后腸；MF：黏膜褶；SMF：次級(jí)黏膜褶；P：蛋白顆粒；SP：分泌小孔；EC：上皮細(xì)胞；MV：微絨毛。

肝臟：雜交鲌肝臟呈淡紅色，位于腹腔前端，由腹腔隔膜將其與頭部隔開(kāi)。肝臟借少數(shù)系膜連接并覆蓋住整個(gè)食道與部分前腸，半側(cè)游離于腹腔內(nèi)。膽囊緊貼其肝腹面右側(cè)，呈金綠色橢球狀裸露結(jié)構(gòu)，外觀上無(wú)明顯獨(dú)立的胰臟結(jié)構(gòu)。

2.3 消化系統(tǒng)組織學(xué)特征

圖3為雜交鲌消化系統(tǒng)的HE染色切片，各部位組織結(jié)構(gòu)特征如下。

唇(圖3，1)：由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成，細(xì)胞排列緊密、整齊、圓形細(xì)胞核在細(xì)胞中央；有部分色素沉著。

口咽腔(圖3，3-5)：口腔內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)可分為漿膜、肌層和黏膜層。最外層有一層角化細(xì)胞。口腔內(nèi)分布有味蕾，較多粘液細(xì)胞。咽部固有膜基部也可見(jiàn)味蕾結(jié)構(gòu)(圖3，5)；肌層比口腔內(nèi)更厚，肌纖維排列較為緊密，也為橫紋肌；漿膜層稍發(fā)達(dá)，分布大量粘液細(xì)胞。肌層中都為橫紋肌，黏膜層由復(fù)扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成。

食道(圖3，6)：其壁由內(nèi)向外分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜。黏膜上皮為復(fù)層鱗狀上皮，上皮細(xì)胞間夾有大量杯狀細(xì)胞，固有層向內(nèi)凸起，形成褶皺；肌層較發(fā)達(dá)，由骨骼肌構(gòu)成，可分為內(nèi)部縱肌層和外部環(huán)肌層，外部環(huán)肌層較內(nèi)縱基層厚；最外層為漿膜，由結(jié)締纖維細(xì)胞及單層扁平上皮細(xì)胞組成。食道內(nèi)粘液細(xì)胞的密度顯著高于前腸、中腸和后腸(表3)。

表3 雜交鲌食道和前、中、后腸形態(tài)學(xué)特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=31)Tab.3 Morphological features of the esophagus and anterior，middle and posterior intestines of the hybrid culter(Mean ± SEM，n=31)

腸道(圖3，7-12、15)：腸道組織同樣由粘膜層、粘膜下層、肌肉層和漿膜層構(gòu)成。粘膜層向管腔內(nèi)伸出形成豐富的褶皺；肌層可分為內(nèi)部環(huán)肌層和外部縱肌層。前腸、中腸和后腸結(jié)構(gòu)相似但數(shù)量不同。在黏膜褶最外層的上皮細(xì)胞間有大量的杯狀細(xì)胞，它們?cè)诎欛揄敳?、中部與基部均有分布，形狀有梨形、圓形與橢圓形等，染色多呈空泡狀且靠近表層。

從食道、前腸、中腸到后腸其管腔直徑和肌層厚度均呈依次降低的變化趨勢(shì)；褶皺長(zhǎng)度和褶皺寬度也逐漸減小。

肝臟(圖3，14、16)：HE切片顯示20倍鏡下可觀察到肝小葉，但邊緣不清晰，組織中的中央靜脈及分布大量毛細(xì)血管，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央；40倍鏡下觀察到一些彌散的胰腺細(xì)胞。

膽囊(圖3，13)：HE切片顯示20倍鏡下可觀察到多個(gè)管狀腺結(jié)構(gòu)。

肛門(mén)(圖3，2)：肛門(mén)處呈近似圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，周?chē)∪獍l(fā)達(dá)，由較厚的內(nèi)部縱肌和外部環(huán)肌構(gòu)成。

3 討論

3.1 消化系統(tǒng)形態(tài)組織結(jié)構(gòu)與攝食的關(guān)系

魚(yú)類對(duì)物質(zhì)消化吸收能力的強(qiáng)弱與其消化道表面結(jié)構(gòu)特征以及腸腺的分泌能力有關(guān)[12]。粘液細(xì)胞會(huì)分泌不同的物質(zhì)導(dǎo)致其在HE染色后呈現(xiàn)不同形態(tài)[13]。根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)類消化道粘液細(xì)胞的分類研究[13-15]，可將本研究中雜交鲌消化道內(nèi)觀察到的粘液細(xì)胞分為三種類型：Ⅰ型細(xì)胞HE染色后呈顏色較淺的橢圓形空泡狀；Ⅱ型粘液細(xì)胞個(gè)體較大，在HE染色狀態(tài)下呈顏色較淺的杯狀空泡；Ⅲ型粘液細(xì)胞在HE染色狀態(tài)下其分泌的顆粒物質(zhì)著色較深?？谘是皇鞘澄镞\(yùn)輸?shù)闹匾ǖ?，是消化系統(tǒng)與環(huán)境接觸的第一通道。雜交鲌口、咽部有味蕾結(jié)構(gòu)和大量粘液細(xì)胞，這表明雜交鲌可以對(duì)攝入進(jìn)腸道消化的食物進(jìn)行選擇和鑒別[16-17]。在口、咽部大部分為Ⅰ類粘液細(xì)胞，它可以與上皮細(xì)胞一起分泌中性黏液物質(zhì)[18]起到潤(rùn)滑作用，此外口、咽部的上皮細(xì)胞還能分泌含硫糖蛋白和唾液酸糖蛋白以增加分泌物的粘性[19]，更大程度保護(hù)了消化道黏膜免受機(jī)械損傷和細(xì)菌感染[20]。雜交鲌食道中的I型粘液細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于腸道，這大大增加了食道內(nèi)的潤(rùn)滑程度。此外食道內(nèi)壁有很多縱行黏膜褶，當(dāng)吞咽食物時(shí)，可以借助這些縱行黏膜褶擴(kuò)大或縮小食道內(nèi)徑，使食物快速通過(guò)。食道肌層厚度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腸道，這不僅極大地避免了攝入物帶來(lái)的機(jī)械損傷，還能增強(qiáng)食道蠕動(dòng)幫助吞咽[21]。當(dāng)咽部和食道前端的味蕾感覺(jué)有異時(shí)，食道發(fā)達(dá)的外部環(huán)肌可以有力收縮將異物拋出口外。最后通過(guò)環(huán)肌的波狀收縮，可以將食物與黏液充分混合并將初步擠壓形成的食靡推向腸道深處。

圖3 雜交鲌消化道HE染色切片圖Fig.3 Hybrid culter gastrointestinal HE slice

腸道是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要部位，腸道的絨毛長(zhǎng)度、黏膜厚度及肌層厚度是衡量腸道消化吸收功能的重要指標(biāo)[22-23]。有研究表明，腸黏膜厚度和腸肌層厚度會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[24]，與腸道的節(jié)律性收縮運(yùn)動(dòng)和食糜的機(jī)械消化效率也密切相關(guān)[25]。相比于食道，雜交鲌腸道的肌層厚度顯著下降，這減緩了食靡向腸道深處移動(dòng)的速度，增加了消化吸收的時(shí)間。前腸中Ⅱ類粘液細(xì)胞較多。這些夾在上皮細(xì)胞之間，開(kāi)口于絨毛表面的粘液細(xì)胞具有分泌潤(rùn)滑液、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)大分子、輔酶因子、抵御外來(lái)致病因子等作用[20]，其分泌的粘液還可以使上皮細(xì)胞免受一些消化酶的破壞[6]。另外由固有層向內(nèi)凸起形成的黏膜褶可以增加腸道對(duì)食物的消化、吸收接觸表面積，從而增強(qiáng)對(duì)食物的消化、吸收能力[26]。不同魚(yú)類的絨毛形態(tài)變化較大，絨毛長(zhǎng)度一般由前向后逐漸降低[27]。前腸部分的黏膜褶高度顯著大于中腸和后腸，黏膜褶數(shù)量也較多，這表明雜交鲌的前腸可能是消化吸收的主要場(chǎng)所，中腸和后腸黏膜褶數(shù)量雖有所降低但也有一定的消化和吸收能力。黏膜褶最外層是一層上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞游離面的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)深處的微細(xì)指狀突起形成了微絨毛，可增加吸收面積15～20倍[28]。這些微絨毛在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收中起重要作用。相比前腸和后腸，電鏡下中腸的分泌孔大而密，微絨毛沿分泌孔伸出，與其消化酶的分泌與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收有密切聯(lián)系。后腸黏膜上皮存在大量的黏液細(xì)胞，且肌層占比率逐漸增大[29]，可便于食物殘?jiān)呐懦鯷19]和對(duì)水分及鹽分的吸收[30]。

3.2 消化道系數(shù)與食性的關(guān)系

腸道系數(shù)作為一個(gè)重要的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，已經(jīng)被廣泛用于劃分魚(yú)類的營(yíng)養(yǎng)類型。魚(yú)類腸道的長(zhǎng)短一般與其攝取食物的易消化程度相關(guān)[31]。一般來(lái)說(shuō)，肉食性或者掠食性魚(yú)類腸道系數(shù)值低，而雜食性魚(yú)類則為中間數(shù)值，草食性魚(yú)類腸道系數(shù)最高[32]。有研究指出，肉食性金頭鯛(Sparusaurata)腸道系數(shù)為0.5～0.6，哲羅魚(yú)(Huchotaimen)、鲇(Silurusasotus)兩種肉食性魚(yú)類腸道系數(shù)分別為0.47和0.78，雜食性的小口脂鯉科魚(yú)類(Leporinusfriderici和L.taeniofasciatus)腸道系數(shù)分別為1.25和1.14[13]。雜交鲌腸道系數(shù)為0.94±0.09，比腸重為0.98±0.14，符合雜食性偏肉食性魚(yú)類特征。另外，根據(jù)目前大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)肉食性魚(yú)類口腔長(zhǎng)/頭長(zhǎng)的比值一般大于雜食性、草食性和濾食性魚(yú)類[33-34]。本研究中雜交鲌口咽腔長(zhǎng)/頭長(zhǎng)比值為0.21±0.05，與雜食性魚(yú)類比值接近。

4 結(jié)論

基于腸道系數(shù)和口咽腔長(zhǎng)/頭長(zhǎng)的值，可判定雜交鲌屬于雜食性魚(yú)類。雜交鲌的腸道分為三段，前腸，中腸和后腸的組織結(jié)構(gòu)存在一定差異。前腸是營(yíng)養(yǎng)吸收的主要部位，中腸內(nèi)食靡進(jìn)一步分解，后腸吸收營(yíng)養(yǎng)成分的能力減弱。