Nec-1和Z-VAD-FMK對(duì)正畸牙移動(dòng)中caspase8、MLKL和RANKL表達(dá)的影響

李 易 王 賀 張 曼 張嚴(yán)勻 張苗苗

正畸牙移動(dòng)(orthodontic tooth movement, OTM)必然伴隨著牙周組織的改建，OTM中壓力側(cè)細(xì)胞的死亡形式以及對(duì)牙周組織改建的影響機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。凋亡和壞死性凋亡均屬于基因控制下的程序性細(xì)胞死亡，caspase8是外源性凋亡途徑的起始caspase，當(dāng)其被抑制或敲除，將激活壞死性凋亡途徑，混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)則是破壞細(xì)胞質(zhì)膜完整性、執(zhí)行壞死性凋亡的效應(yīng)蛋白[1]。壓力側(cè)牙周組織改建主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞性骨吸收，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種與破骨細(xì)胞形成相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand, RANKL)信號(hào)通路在破骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)、激活和存活中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。

近年來(lái)研究表明，OTM中壓力側(cè)的牙周組織細(xì)胞可發(fā)生凋亡，并與破骨細(xì)胞的分化、募集有關(guān)[3,4]。課題組前期實(shí)驗(yàn)首次在壓力側(cè)牙周組織中發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞死亡是由壞死性凋亡介導(dǎo)[5]。雖然目前已對(duì)凋亡和壞死性凋亡信號(hào)通路做了深入研究，但是關(guān)于兩者在OTM中的相互聯(lián)系及對(duì)牙周組織改建的影響機(jī)制尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠OTM模型，分別使用Nec-1和Z-VAD-FMK后觀察caspase8、MLKL和RANKL在壓力側(cè)牙周組織中的變化，初步探討壓力側(cè)牙周組織凋亡和壞死性凋亡的相互聯(lián)系及對(duì)RANKL表達(dá)的影響。

材料與方法

1.主要材料與試劑：鎳鈦螺旋拉簧購(gòu)自北京有研億金新材料有限公司，粘接劑、流動(dòng)樹(shù)脂購(gòu)自美國(guó)3M公司，正畸測(cè)力計(jì)購(gòu)自杭州西湖生物材料有限公司，Nec-1、Z-VAD-FMK購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，即用型正常山羊血清、DAB顯色試劑盒、caspase8、RANKL抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，MLKL抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司，兔二步法試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：80只7周齡健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量為200±10g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，倫理審批號(hào)：2021084]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(C組)、加力組(F組)、加力+Nec-1組(FN組)、加力+Z-VAD-FMK組(FZ組)，每組各20只。

3.動(dòng)物模型的建立：10%的水合氯醛以0.3ml/100g的劑量腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在上頜左側(cè)第一磨牙和2顆上切牙之間用結(jié)扎絲固定1段鎳鈦拉簧，力量50g，建立以上頜2顆切牙為支抗拉左側(cè)第一磨牙近中移動(dòng)模型。C組無(wú)加力裝置，F(xiàn)、FN、FZ組建立OTM模型，C組、F組于加力前半小時(shí)用微量進(jìn)樣器在大鼠上頜左側(cè)第一磨牙頰腭側(cè)牙齦黏膜局部注射50μl 0.9% NaCl溶液，F(xiàn)N組、FZ組以同樣方式分別注射等體積1mmol/L的Nec-1和0.25mmol/L的Z-VAD-FMK，每隔2天注射1次。每天檢查1次加力裝置是否穩(wěn)固，若有松動(dòng)或脫落及時(shí)重新安置。

4.切片制備：獲取上頜磨牙及牙槽骨的組織塊，4%多聚甲醛溶液外固定48h，15%EDTA液(pH值為7.2)脫鈣4周，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚5μm)，光鏡下挑選完整的切片用于蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色及免疫組化染色。

5.免疫組化染色及圖像分析：烤片后進(jìn)行脫蠟水化，抗原修復(fù)，血清封閉，分別滴加MLKL、caspase8、RANKL多克隆抗體4℃過(guò)夜，二抗37℃孵育20min，光鏡下DAB顯色觀察，自來(lái)水沖洗終止，蘇木精復(fù)染，氨水返藍(lán)，脫水透明，封片。光鏡下觀察并截取圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行平均吸光度值測(cè)量。設(shè)定第1、3、5、7、14天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察每組大鼠對(duì)應(yīng)的形態(tài)學(xué)改變，以及caspase8、MLKL、RANKL的免疫組化結(jié)果。

結(jié) 果

1.壓力側(cè)牙周組織的形態(tài)學(xué)改變：HE染色可見(jiàn)C組第一磨牙遠(yuǎn)中根壓力側(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)骨吸收陷窩。加力第1天時(shí)，牙周膜成纖維細(xì)胞排列紊亂；第3天時(shí)，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，形成玻璃樣變；第5天起，出現(xiàn)破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩，玻璃樣變范圍有所減少；第7天時(shí)，玻璃樣變基本清除；第14天時(shí)，成纖維細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)破骨細(xì)胞及骨吸收陷窩(圖1)。

圖1 壓力側(cè)牙周組織的變化(HE染色，×200)A.C組第7天；B.F組第1天；C.F組第3天；D.F組第5天；E.F組第7天；F.F組第14天。R.牙根；PDL.牙周膜；AB.牙槽骨；白色箭頭示玻璃樣變；黑色箭頭示破骨細(xì)胞

2.caspase8的免疫組化結(jié)果：C組各時(shí)間點(diǎn)caspase8的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。F、FN、FZ組第1、3、5、7天的表達(dá)均高于C組(P<0.05)。F組中caspase8的表達(dá)隨加力時(shí)間逐漸增加，第3天達(dá)到高峰，之后減少。FN組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與相應(yīng)F組中的表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與F組和FN組比較，F(xiàn)Z組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2、表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)第一磨牙壓力側(cè)牙周組織caspase8表達(dá)的平均吸光度值

圖2 各組大鼠第3天時(shí)caspase8的表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)A.C組第3天；B.F組第3天；C.FN組第3天；D.FZ組第3天。R.牙根；PDL.牙周膜；AB.牙槽骨

3.MLKL的免疫組化結(jié)果：C組各時(shí)間點(diǎn)MLKL的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。F組第1、3、5天的表達(dá)均較C組增強(qiáng)，加力第1天時(shí)即達(dá)到表達(dá)高峰，隨著加力時(shí)間延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)。FN組第1、3天的表達(dá)較C組增強(qiáng)；第1、3、5天的表達(dá)與相應(yīng)F組中的表達(dá)比較顯著降低(P<0.05)。FZ組第1、3、5天的表達(dá)均較C、F、FN組增強(qiáng)(P<0.05)。第7、14天各組MLKL的表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)第一磨牙壓力側(cè)牙周組織MLKL表達(dá)的平均吸光度值

圖3 各組大鼠第1天時(shí)MLKL的表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)A.C組第1天；B.F組第1天；C.FN組第1天；D.FZ組第1天；R.牙根；PDL.牙周膜；AB.牙槽骨

4.RANKL的免疫組化結(jié)果：C組各時(shí)間點(diǎn)RANKL的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。F組RANKL表達(dá)隨加力時(shí)間逐漸增加，第5天達(dá)到高峰，之后減少，各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均高于C組(P<0.05)。FN組第1、3、5、7天的表達(dá)較F組減少，但較C組增多(P<0.05)。FZ組第3、5、7天的表達(dá)較F、FN組減少(P<0.05)。第14天時(shí)，F(xiàn)、FN、FZ組RANKL的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于C組(P<0.05),詳見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組大鼠第5天時(shí)RANKL的表達(dá)情況(免疫組化染色，×200)A.C組第5天；B.F組第5天；C.FN組第5天；D.FZ組第5天。R.牙根；PDL.牙周膜；AB.牙槽骨

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)第一磨牙壓力側(cè)牙周組織RANKL表達(dá)的平均吸光度值

討 論

凋亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡與caspase家族活化密切相關(guān)，caspase8是外源性凋亡途徑的啟動(dòng)caspase，進(jìn)而激活下游caspase3執(zhí)行凋亡活動(dòng)。MLKL是壞死性凋亡發(fā)生的關(guān)鍵，磷酸化的MLKL發(fā)生寡聚并轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜，破壞質(zhì)膜完整性導(dǎo)致細(xì)胞壞死[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察到牙周組織在加力第1天時(shí)即出現(xiàn)明顯的caspase8表達(dá)，第3天時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，MLKL同樣在加力第1天時(shí)出現(xiàn)明顯表達(dá)，之后便呈降低趨勢(shì)，提示牙周組織細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡主要發(fā)生在正畸加力初期。同時(shí)，caspase8的表達(dá)也說(shuō)明了壓力側(cè)牙周組織凋亡可以通過(guò)外源性凋亡途徑激活。但一些研究觀察到caspase3在牙齒移動(dòng)7天后仍有增加，由于caspase3是多條凋亡途徑下游共同的效應(yīng)蛋白酶，因此細(xì)胞凋亡可能存在于整個(gè)OTM過(guò)程中且涉及多條凋亡信號(hào)通路，而外源性凋亡途徑可能主要介導(dǎo)了牙齒移動(dòng)早期的凋亡發(fā)生[7]。

研究表明，Z-VAD-FMK在抑制caspase8活性阻斷凋亡發(fā)生的同時(shí)可以增強(qiáng)壞死性凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)使用Z-VAD-FMK后，caspase8表達(dá)早期明顯降低，MLKL表達(dá)明顯升高，這一結(jié)果與上述研究一致。Nec-1通過(guò)變構(gòu)抑制受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein1, RIP1)激酶活性從而有效抑制壞死性凋亡，但是否影響凋亡目前的研究仍有爭(zhēng)議[9]。本實(shí)驗(yàn)使用Nec-1后，MLKL水平明顯降低，caspase8水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明Nec-1可以抑制MLKL的表達(dá)而對(duì)caspase8的表達(dá)無(wú)影響，但由于凋亡信號(hào)通路復(fù)雜，且本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)有限，僅caspase8的表達(dá)不足以完全反映凋亡水平，因此Nec-1對(duì)OTM牙周組織細(xì)胞凋亡的影響仍需進(jìn)一步研究。

RANKL是一種來(lái)自腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor, TNF)家族的膜相關(guān)細(xì)胞因子，在牙周組織中可以由成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞以及成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌，與破骨前體細(xì)胞表面的核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB, RANK)結(jié)合，通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)等下游信號(hào)通路誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟[10～14]。研究表明，壓應(yīng)力可以上調(diào)牙周組織中RANKL的表達(dá)水平，并與caspase3的表達(dá)呈正相關(guān)[4]。Kaplan等[3]利用雙磷酸鹽類(lèi)似物IG9402抑制骨細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)會(huì)阻礙破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的形成，認(rèn)為牙周膜細(xì)胞凋亡和骨細(xì)胞凋亡在OTM骨吸收中發(fā)揮了同等重要的作用。本實(shí)驗(yàn)正畸加力后觀察到RANKL表達(dá)以時(shí)間依賴(lài)性的方式增加，加力第5天時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，隨后逐漸減少。使用凋亡抑制劑Z-VAD-FMK后，第1、3、5、7天的RANKL表達(dá)較加力組顯著減少，提示牙周組織細(xì)胞凋亡可以上調(diào)RANKL表達(dá)以促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。

不同于凋亡，壞死性凋亡使質(zhì)膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)而啟動(dòng)非感染性炎性反應(yīng)，此外RIP1和RIP3也可直接產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[15]。本實(shí)驗(yàn)使用壞死性凋亡抑制劑Nec-1后，第1、3、5、7天的RANKL表達(dá)較加力組明顯減少，說(shuō)明壞死性凋亡參與了壓力側(cè)牙周組織上調(diào)RANKL的過(guò)程，這可能與壞死性凋亡介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。據(jù)報(bào)道，炎性細(xì)胞因子如TNF-α，既可以刺激間充質(zhì)細(xì)胞分泌RANKL，又可以協(xié)同RANKL作用于RANK，增強(qiáng)破骨細(xì)胞生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16,17]。抑制壞死性凋亡可以通過(guò)減輕炎性反應(yīng)進(jìn)而削弱破骨細(xì)胞的形成能力。然而，壞死性凋亡對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)控作用似乎是有限的，因?yàn)镕Z組盡管增強(qiáng)了壞死性凋亡，但RANKL表達(dá)均較F組和FN組減少，可能是由于抑制凋亡后牙周組織發(fā)生過(guò)多壞死，致使分泌RANKL的細(xì)胞來(lái)源減少。這也進(jìn)一步說(shuō)明了破骨細(xì)胞分化必須存在RANKL和RANK，雖然壞死性凋亡引起了炎性反應(yīng)增加，但是在缺乏RANKL和RANK的條件下炎性細(xì)胞因子無(wú)法獨(dú)立誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[17]。

綜上所述，OTM中壓力側(cè)牙周組織可同時(shí)發(fā)生凋亡和壞死性凋亡，抑制凋亡可以促進(jìn)壞死性凋亡。此外，兩者均可引起壓力側(cè)牙周組織RANKL高表達(dá)，參與牙周組織改建，為進(jìn)一步研究正畸力作用下細(xì)胞死亡對(duì)牙周組織改建的影響機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。