非生殖器皮膚疣的HPV分型與臨床特征分析

戴海蓉 凌宏忠 曹光玲 歐樹玉 謝繼璜 周暉

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，廣州 510080

人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染皮膚黏膜導(dǎo)致局部上皮良性增生形成疣，臨床上常見有尋常疣、扁平疣、跖疣和尖銳濕疣等。迄今已發(fā)現(xiàn)150 余種HPV 型別，不同HPV 型別與不同病毒疣相關(guān)［1-6］。目前，國內(nèi)外對于尖銳濕疣的HPV 分型研究較多［7-12］，而對于非生殖器皮膚疣（尋常疣、扁平疣和跖疣）的研究相對較少。北京市、貴州省、江蘇省等小樣本報(bào)道中，HPV 型別分布差異較大，提示可能存在區(qū)域性差異［13-15］。僅有一項(xiàng)研究分析了廣東省內(nèi)一家醫(yī)院診治的96 例扁平疣的HPV 基因型感染情況［16］。本研究則更進(jìn)一步分析尋常疣、扁平疣和跖疣等非生殖器皮膚疣的HPV 感染的型別特點(diǎn)和規(guī)律，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

資料與方法

1.研究對象

入組2019 年7 月至2020 年11 月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科就診的116 例非生殖器皮膚疣患者開展隊(duì)列研究，男63 例，女53 例，年齡（38±12.41）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴依據(jù)《中國臨床皮膚病學(xué)》對疣的臨床分類，結(jié)合病史和典型皮損作出診斷，包括發(fā)生在非生殖器部位皮膚的尋常疣、扁平疣和跖疣（足底尋常疣）［17］。⑵患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴生殖器疣；⑵皮膚鏡檢查排除雞眼、胼胝、疣狀皮膚結(jié)核、汗管瘤、點(diǎn)狀掌跖角化病等；⑶其他排除標(biāo)準(zhǔn)包括人類免疫缺陷病毒陽性，器官移植或骨髓移植，活動(dòng)性感染（細(xì)菌、真菌、病毒、結(jié)核等），惡性腫瘤或不典型增生，明確的自身免疫性疾病，治療前1 個(gè)月內(nèi)口服免疫抑制或免疫增強(qiáng)藥物，年齡小于16歲或大于60歲。

2.臨床資料采集

采集的臨床資料包括：⑴年齡、性別等基本資料；⑵病毒疣病史，起病年齡、病程等；⑶病毒疣臨床表現(xiàn)、皮損部位、皮損形態(tài)、大小、數(shù)目等；⑷起病前皮損史、生活方式、密切接觸史；⑸合并疾病和既往病史；⑹治療史。

3.疣體組織HPV分型檢測

⑴試劑與儀器：主要試劑包括基因組DNA 提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）Master Mix試劑盒、通用引物、型特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker和皮膚型HPV 分型檢測試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）等（廣東潮州凱普生物化學(xué)有限公司）。主要儀器包括玻璃組織研磨器、電子微量天平、微型振蕩器、渦旋混合器、電熱恒溫水槽、深低溫冰箱、臺(tái)式低溫離心機(jī)、穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀、PCR 擴(kuò)增儀（Bioer Life Express PCR 儀，博日公司）和導(dǎo)流雜交儀（HHM-2，凱普公司）等。

⑵主要方法：征得患者同意后，采集疣體組織標(biāo)本。用組織剪剪取或直接用刀片刮取適量疣體組織，加無菌生理鹽水用研磨器磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，以12 000 r∕min離心3 min，采用基因組DNA 提取試劑盒，按照說明書步驟提取制備DNA 模板，裝入配置好的PCR 管內(nèi)。采用通用引物MY09∕11擴(kuò)增HPV 保守序列，目的片段長度450 bp，引物序列為5'-CGTCC（AC）A（AG）（AG）GGA（T）ACTGATC-3'（正向引物）和5'-GC（AC）CAGGG（AT）CATAA（CT）AATGG-3'（反向引物）；擴(kuò)增程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)40，再延伸72 ℃ 5 min?；驍U(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳回收陽性條帶，采用型特異性引物進(jìn)一步擴(kuò)增目的片段；擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 9 min，變性95 ℃ 20 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)40，再延伸72 ℃ 5 min，4 ℃冷卻停止。采用Sanger 測序檢測HPV DNA 堿基序列。最后在Genebank上做blast比對，判定HPV型別。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

HPV 檢出率、各部位皮膚疣的性別構(gòu)成比、3 種皮膚疣（尋常疣、扁平疣和跖疣）的構(gòu)成比以及HPV 型別所占比例等計(jì)數(shù)資料采用例（%）形式表示，患者年齡、皮膚疣病程、皮損數(shù)目等符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。百分比參數(shù)比較采用卡方檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS for win 20。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.一般臨床資料

116 例非生殖器皮膚疣患者中，男性63 例，女性53 例；年齡16～54（38.00±12.41）歲；病程2～62 個(gè)月，中位時(shí)間17 個(gè)月；皮損數(shù)目1～21（6.00±1.32）個(gè)。其中HPV 陽性105例，HPV檢出率為90.50%。

2.不同部位皮膚疣的比較

105 例HPV 陽性患者的皮膚疣分別位于頭面部（15 例）、軀干部（9 例）、手部及指甲周（24 例）、足部及足底（57 例）。各部位皮膚疣患者的性別、年齡、病程、疣體數(shù)目以及皮損形狀等情況見表1。

手部疣患者以女性為主（16∕24，66.7%），足部疣患者以男性為主（41∕57，71.9%）。手部疣患者年齡明顯低于頭面部疣患者（t=2.86，P=0.006 0）和軀干部疣患者（t=2.29，P=0.027 0）；足部疣患者年齡明顯低于頭面部疣患者（t=3.34，P=0.002 0）和軀干部疣患者（t=2.68，P=0.010 0）。手部疣患者病程明顯長于頭面部疣患者（t=8.97，P＜0.000 1）和軀干部疣患者（t=6.16，P＜0.000 1）；足部疣患者病程明顯長于頭面部疣患者（t=8.32，P＜0.000 1）和軀干部疣患者（t=5.45，P＜0.000 1）；軀干部疣患者病程也長于頭面部疣患者（t=4.19，P=0.000 2）。頭面部以菜花狀、丘疹狀為主，軀干部以乳頭狀和丘疹狀為主，手部多為丘疹狀，足部主要為斑塊狀。見表1。

表1 105例HPV陽性非生殖器皮膚疣患者的臨床特征

3.不同類型皮膚疣的HPV型別分析

105 例HPV 陽性患者中，跖疣、尋常疣、扁平疣分別占51.43%（54∕105）、32.40%（34∕105）和16.20%（17∕105）。基因測序檢出HPV 型別包括HPV 1、HPV 2、HPV 4、HPV 5、HPV 6、HPV 18、HPV 27、HPV 41、HPV 57、HPV 58、HPV 94 等共11 種。11 種HPV 型別中，以HPV 1（53.33%）、HPV 27（37.14%）、HPV 2（29.52%）和HPV 4（23.81%）為主，其他依次為HPV 94、HPV 41、HPV 57、HPV 6、HPV 5、HPV 18 和HPV 58。3 例尋常疣中檢出高危型HPV 18，1 例扁平疣中檢出高危型HPV 58，其余均為低危型HPV 型別。尋常疣、扁平疣和跖疣的HPV 型別基本上均以HPV 1、HPV 2、HPV 4和HPV 27為主，其中HPV 1型最多。與尋常疣比較，跖疣組織中HPV 27明顯多于HPV 2和HPV 4。見表2。

表2 105例HPV陽性非生殖器皮膚疣患者不同類型皮膚疣的HPV亞型分析

105 例陽性標(biāo)本中，48 例（45.71%）為單一HPV 型別感染，57 例（54.29%）同時(shí)存在雙重或多重HPV 型別感染。僅發(fā)生單一感染而未合并其他HPV 型別的是HPV 18、HPV 58 和HPV 94，其余型別均存在合并感染。合并感染中，絕大多數(shù)存在HPV 1 型，以HPV 1+HPV 4（14 例）、HPV 1+HPV 2（11 例）、HPV 1+HPV 27（10 例）為主，其次為HPV 2+HPV 27（5例）、HPV 1+HPV 4+HPV 27（5例）。見圖1。

圖1 105例HPV陽性非生殖器皮膚疣患者HPV亞型單一感染、雙重感染和多重感染情況。A：HPV亞型單一感染；B：HPV亞型雙重感染；C：HPV亞型多重感染

4.不同部位皮膚疣的HPV型別分析

頭面部疣、軀干部疣、手部疣和足部疣的患者，雙重∕多重HPV 感染所占比例分別為26.67%（4∕15）、33.33%（3∕9）、58.33%（14∕24）和63.16%（36∕57）。比較各組患者中雙重∕多重HPV 感染所占比例，手部疣明顯高于頭面部疣（58.33%比26.67%，χ2=3.836，P=0.050），足部疣明顯高于頭面部疣（63.16%比26.67%，χ2=6.500，P=0.018）；其余兩組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 105例HPV陽性非生殖器皮膚疣患者不同部位皮膚疣的HPV亞型分析（例）

5、不同部位皮膚疣患者的生活方式和相關(guān)病史

頭面部、軀干部、手部和足部皮膚疣患者中，許多患者有熬夜、失眠和學(xué)習(xí)工作壓力大等生活方式特點(diǎn)；頭面部疣、手部和足部皮膚疣患者多有局部皮損史、局部出汗多等誘因，手部和足部皮膚疣患者多合并手足癬和濕疹等疾病，并具有密切接觸史。此外，軀干部疣多發(fā)生于四肢，尤以下肢、前臂多見；手部疣患者尤以家庭主婦長期接觸水及生魚、肉為多；足部疣多發(fā)皮損中以青壯年男性居多，且多自己進(jìn)行不規(guī)范處理，皮損逐漸擴(kuò)大融合。見表4。

表4 105例HPV陽性非生殖器皮膚疣患者的誘因、生活方式和相關(guān)病史（例）

討論

目前關(guān)于非生殖器皮膚疣HPV型別的研究較少?，F(xiàn)有研究結(jié)果提示：非生殖器皮膚疣的HPV型別與黏膜、生殖器疣的HPV 型別存在較大差異，并且不同國家和地區(qū)之間也存在比較明顯的差異，明確特定地區(qū)的HPV 感染型別規(guī)律有助于更深入了解皮膚疣特點(diǎn)。本研究中的105 例皮膚疣患者全部來自廣東地區(qū)，發(fā)現(xiàn)HPV 型別是以HPV 1、HPV 27、HPV 2 和HPV 4 為主，其他依次為HPV 94、HPV 41、HPV 57、HPV 6、HPV 5、HPV 18 和HPV 58，這與現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果不盡相同。荷蘭246例患者的744份皮膚疣標(biāo)本中，最多見的HPV 型別依次為HPV 2、27、57、4、1，其他頻率較低的包括HPV 3、7、10、28、65、88、95、41 等［18］。約旦200 例皮膚疣標(biāo)本中，常見HPV 型別為HPV 2（36%）、HPV 27（28%）、HPV 57（21%）［19］。捷克人皮膚疣標(biāo)本中HPV 6 占72%［20］。日本尋常疣主要感染型別為HPV 1、4、65［21］。我國不同地區(qū)的HPV 型別也存在較大差異：北京市48例尋常疣常見HPV 型別依次為HPV57、1、27、2［13］；江蘇省48 例尋常疣則以HPV 7 為主［14］；貴州省尋常疣常見型別為HPV 2、1，扁平疣主要型別為HPV 2、10、3、1［15］。各個(gè)地區(qū)報(bào)道的HPV 感染型別有所不同，也可能跟研究者設(shè)計(jì)或使用的檢測試劑對HPV 各基因型的覆蓋和檢測效能等不同有關(guān)。與文獻(xiàn)報(bào)道比較，本研究HPV 1 比例明顯較高，而HPV 57 比例較低。另外我們觀察到，本研究中扁平疣患者的常見HPV 型別與尋常疣、跖疣患者的常見HPV 型別基本相同，以HPV 1、HPV 2、HPV 4 和HPV 27 為主，區(qū)別于以HPV 3、10、28、41 為主的報(bào)道［22］。這些研究發(fā)現(xiàn)提示廣東地區(qū)HPV 感染的流行病學(xué)特點(diǎn)可能與其他地區(qū)不同，值得進(jìn)一步調(diào)查研究。

皮膚疣中HPV 常以合并感染的形式存在。荷蘭744 份皮膚疣標(biāo)本中，單一型別感染占79%，HPV 多重感染占16%，普遍合并感染的型別是HPV63［23］。北京48 例尋常疣患者雙重感染僅占8.3%，主要是HPV1 合并其他型別［13］。本研究中雙重或多重HPV 型別感染的比例較高，占54.3%，可能的解釋是：⑴這可能是廣東地區(qū)HPV 感染的流行病學(xué)特點(diǎn)之一；⑵作者單位是廣東地區(qū)最大的三甲醫(yī)院之一，收治的皮膚疣患者病情可能比基層醫(yī)院的復(fù)雜一些。圖1 可以看出，雙重或多重感染中，多數(shù)合并存在HPV 1，雙重感染以HPV 1 合并HPV 4、或HPV 2、或HPV 27 等為主，多重感染以HPV 1 合并HPV4、HPV 27 為主；除HPV 18、58、94 之外，其余型別均存在合并感染。國外研究發(fā)現(xiàn)，HPV 1 感染的皮膚疣具有獨(dú)特的臨床特征，包括患者年齡＜12 歲、跖疣、病程＜6 個(gè)月、皮損部位少于4 個(gè)［23-25］。本研究絕大多數(shù)患者存在HPV 1 感染，與皮膚疣臨床特征的關(guān)系不明顯。但有研究表明，身體不同部位HPV 1 感染可導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)的皮膚疣［18，26-27］。因此，HPV 1與非生殖器皮膚疣臨床特征的關(guān)系值得進(jìn)一步研究明確。此外，國外研究發(fā)現(xiàn)68 例希臘兒童皮膚疣組織中，33%檢測到高危型HPV 16［28］；中國臺(tái)灣61 例皮膚疣組織中HPV 16 占8%［29］。本研究3例尋常疣中檢出高危型HPV 18，1例扁平疣中檢出高危型HPV 58。目前隨訪期內(nèi)我們尚不能明確這與臨床預(yù)后的相關(guān)性，但檢測結(jié)果促使我們更加關(guān)注這幾例患者的隨訪，以期提前發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)變的可能。

皮膚疣發(fā)病是多種誘因、生活方式、合并疾病以及密切接觸史等多種因素綜合所致［3］。本研究發(fā)現(xiàn)：皮膚疣患者中，學(xué)習(xí)工作壓力大、熬夜、失眠等占很大比例。通過對頭面部、軀干部、手部和足部等不同部位的皮膚疣患者分析發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律。頭面部疣病程最短，平均4 個(gè)月，疣體數(shù)目最少，這可能與頭面部疣體最能影響美容，患者發(fā)病后常能及時(shí)就診有關(guān)。其他誘因還包括面部多汗、合并手足癬、濕疹等。手部疣體數(shù)目多，女性患者占比70%，這可能與女性患者長期接觸水及生魚、肉等機(jī)會(huì)更多，皮膚接觸面積大容易播散等有關(guān)。此外，手部多汗、合并手部濕疹、手足癬以及密切接觸史等也是手部疣的重要誘因。足部疣病程長、疣體數(shù)目多，這可能與足部對美容影響小、患者就診不及時(shí)有關(guān)。多數(shù)患者具有足部多汗史，一半患者有明確的足底皮損史，經(jīng)常光腳、合并手足癬和濕疹等也是重要誘因［31］。此外，我們發(fā)現(xiàn)手足部疣體的雙重∕多重HPV 感染比例占60%左右，明顯高于頭面部（26.67%），這可能與手足皮膚局部環(huán)境以及與外界環(huán)境接觸等有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院非生殖器皮膚疣患者的常見感染型別以HPV 1、27、2、4 為主，HPV 1 比例較高而HPV 57 比例較低；雙重∕多重HPV 感染較多，特別是手足部疣，多數(shù)合并HPV 1；頭面部、軀干部、手部、足部等不同部位的皮膚疣具有明顯不同的誘因、病史和臨床表現(xiàn)。對比國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，以上研究結(jié)果提示廣東地區(qū)非生殖器皮膚疣的HPV型別可能與其他地區(qū)不同，值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究，并進(jìn)一步分析常見HPV型別與臨床表現(xiàn)和治療預(yù)后的相關(guān)性。

作者貢獻(xiàn)聲明戴海蓉：研究實(shí)施，論文撰寫；凌宏忠、曹光玲 ：研究指導(dǎo)，經(jīng)費(fèi)支持歐樹玉、謝繼璜 ：標(biāo)本與數(shù)據(jù)采集；周暉：研究指導(dǎo)，論文修改。