磷酸肌酸鈉預(yù)處理對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

王亞光 鐘一 高利麗 蔡宏宇

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1心內(nèi)科，遼寧 錦州 121001；2內(nèi)分泌與代謝疾病科；3腎內(nèi)科)

肺缺血再灌注損傷(LIRI)常導(dǎo)致移植后原發(fā)性移植物功能障礙(PGD)，是導(dǎo)致移植后發(fā)病和死亡的主要原因〔1〕。許多接受肺動(dòng)脈血栓內(nèi)膜切除術(shù)和體外循環(huán)的患者或那些從鐮狀細(xì)胞肺危象中恢復(fù)過來的患者也會(huì)有某種形式的LIRI。通過再灌注，形成活性氧，激活細(xì)胞內(nèi)的一系列有害效應(yīng)〔2，3〕。肺移植后缺血再灌注迅速激活先天免疫系統(tǒng)促進(jìn)炎癥與損傷。LIRI涉及供體肺細(xì)胞與受血者免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的炎癥通訊，導(dǎo)致危及生命的水腫、器官功能障礙和細(xì)胞死亡〔4〕。由于缺血預(yù)處理涉及機(jī)械損傷及倫理，相比較而言，藥物預(yù)處理是更為理想的治療方法，因?yàn)樗粌H無創(chuàng)、安全，最重的是能有效減輕肺缺血再灌注損傷，因而具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。磷酸肌酸作為細(xì)胞內(nèi)的能量載體，能夠維持細(xì)胞的活性及基本功能〔5〕。外源性磷酸肌酸作為重要的能量補(bǔ)充劑，在治療能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的機(jī)體病理變化中發(fā)揮著重要作用。此外，磷酸肌酸的膜穩(wěn)定作用、抗氧化作用、神經(jīng)保護(hù)作用等正逐漸被證實(shí)〔6，7〕。本研究旨在探討磷酸肌酸鈉預(yù)處理對(duì)大鼠肺LIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠32只，體重250～300 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，顯微鏡裝置購(gòu)于日本OLUMPUS公司，全自動(dòng)血?dú)夥治觯?gòu)于美國(guó)Nova biomedical公司，多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)于瑞士TECAN公司，酶標(biāo)儀，購(gòu)于美國(guó)BIOTEK公司，雙垂直蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于北京六一公司。總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)試測(cè)定試劑盒，腫瘤壞死因子(TNF)-α、大鼠白細(xì)胞介素(IL)-1β ELISA檢測(cè)試劑盒。髓過氧化物酶(MPO)試劑盒，購(gòu)于南京建成公司。注射用磷酸肌酸鈉購(gòu)于海口力奇制藥股份有限公司。

1.2大鼠肺缺血再灌注模型 大鼠術(shù)前自由進(jìn)食，自由飲水，在22°C下，12 h光/12 h暗周期，濕度為65%，可自由獲取食物和水，20%烏拉坦(500 μl/100 g)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)剪毛、消毒、鋪巾，取頸前正中切口3 cm，逐層切開分離頸前皮下組織及頸前肌肉組織，暴露、游離氣管，14 G靜脈留置導(dǎo)管氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置為呼吸頻率80次/min，吸呼比1∶2，潮氣量8 ml/kg，右頸靜脈注射肝素(100 IU/kg)抗凝。待動(dòng)物呼吸穩(wěn)定后，取左側(cè)胸部第5肋間隙前外側(cè)切口，切開胸壁皮膚后，切斷胸壁肌肉逐層進(jìn)胸，打開胸腔，精細(xì)游離并暴露左側(cè)肺門，以無損傷血管夾夾閉左肺門45 min后開放(阻斷后肺塌陷，顏色變?yōu)榘底仙?，開放后再次膨脹，顏色變?yōu)榈t色)。再灌注120 min，實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，采用安樂死的方法處死大鼠(靜脈注射3倍麻醉劑量的烏拉坦)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SD大鼠，32只，體重250～300 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，10～15周齡，分籠飼養(yǎng)，自由喂水，統(tǒng)一批次，按籠分層隨機(jī)均分為Sham組、Sham+磷酸肌酸鈉組、LIRI組、LIRI+磷酸肌酸鈉預(yù)處理組各8只。尼可地爾粉劑80 mg充分溶解于100 ml蒸餾水中。Sham組：只進(jìn)行假手術(shù)，開胸后僅游離肺門，不做夾閉處理，其他操作同模型組。Sham+磷酸肌酸鈉組：實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行假手術(shù)，并以40 mg/kg的磷酸肌酸鈉予以大鼠尾靜脈注射。LIRI組：以無損傷血管夾夾閉左肺門45 min后開放(阻斷后肺萎縮，變?yōu)榘底仙?，開放后肺迅速膨脹，顏色恢復(fù)淡紅色)，再灌注120 min后靜脈取血，處死大鼠并收集肺組織。LIRI+磷酸肌酸鈉預(yù)處理組，實(shí)驗(yàn)大鼠在LIRI的操作前15 min以40 mg/kg的磷酸肌酸鈉予以大鼠尾靜脈注射。

1.4檢測(cè)肺組織病理學(xué) 2 h再灌結(jié)束后，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學(xué)變化〔9〕。肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肺損傷評(píng)分表

1.5血?dú)夥治鰴z測(cè)及氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)的計(jì)算 再灌注120 min后，各組大鼠取動(dòng)脈血，測(cè)氧分壓(PaO2)，二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值。OI=PaO2/吸氧濃度(FiO2)。RI=〔肺泡動(dòng)脈氧分壓差(P(A-a)DO2)/PaO2〕。P(A-a)DO2=(大氣壓-PH2O)×FiO2-PaCO2/R-PaO2。其中PH2O為蒸汽壓，取恒值47 mmHg，R=0.8，大氣壓統(tǒng)一采用760 mmHg。

1.6肺干濕比重(W/D)的測(cè)定 首先，大鼠安樂死后采集肺組織，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中短暫沖洗，擦拭，然后稱重以獲得濕重。在80℃干燥72 h后測(cè)定肺的干重，以濕體重除以干體重來計(jì)算W/D。

1.7MDA、SOD的檢測(cè) 取組織進(jìn)行準(zhǔn)確稱取，然后按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入9倍的生理鹽水，冰浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，制備成10%的勻漿上清液。將組織勻漿上清進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。使用MDA、SOD試劑盒測(cè)定其含量。

1.8肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的測(cè)定 2 h再灌注結(jié)束，收集肺泡灌洗液，離心后保存于-20℃冰箱中至實(shí)驗(yàn)使用，肺泡灌洗液600 g經(jīng)過800 r/min離心10 min去除沉淀物。按照試劑盒說明，TMB顯色液顯色，酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光值，以標(biāo)品濃度(pg/ml)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)光密度(OD)為橫坐標(biāo)，運(yùn)用Curve Exert1.3軟件來畫標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸曲線，然后按曲線方程來算出各樣本的濃度值。

1.9MPO活性的測(cè)定 冰浴的條件下進(jìn)行機(jī)械的勻漿，制備成10%勻漿，按照試劑盒說明操作。MPO的活力(U/g組織濕重)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/〔11.3×取樣量(g)〕。

1.10肺組織中細(xì)胞凋亡的測(cè)定 用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色來檢測(cè)肺凋亡率。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、Dunn檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肺組織病理學(xué)變化 2 h再灌注結(jié)束后，用HE染色測(cè)定肺組織損傷的組織學(xué)證據(jù)。Sham組及Sham+磷酸肌酸鈉組肺組織結(jié)構(gòu)及肺泡完整，肺間隔無明顯增厚，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；LIRI組肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，肺泡堵塞，肺泡形態(tài)不完整，大量血液滲出，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)且分布廣泛，部分集結(jié)成團(tuán)；LIRI+磷酸肌酸鈉預(yù)處理組肺組織結(jié)構(gòu)仍有一定變化，肺間隔增厚，有血液滲出，可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組肺質(zhì)傷評(píng)分〔(0.128±0.025)分〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LIRI組肺損傷評(píng)分〔(0.428±0.026)分〕明顯高于Sham組〔(0.122±0.022)分，P<0.01〕。LIRI+磷酸肌酸鈉組肺損傷評(píng)分〔(0.311±0.029)分〕明顯低于LIRI組(P<0.01)。

2.2血?dú)夥治鰴z測(cè)及OI和RI Sham和Sham+磷酸肌酸鈉組pH、PO2、PCO2、OI、RI無顯著差異(P>0.05)。LIRI組PaO2、OI明顯低于Sham組，PaCO2、RI明顯高于Sham組(P<0.01)。LIRI+磷酸肌酸鈉組PaO2、OI均顯著高于LIRI組，PaCO2、RI顯著低于LIRI組(均P<0.05)。見表2。

2.3W/D 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組W/D無明顯差異(4.314±0.312 vs 4.332±0.279，P>0.05)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組W/D顯著降低(5.193±0.342 vs 6.231±0.298，P<0.01)。

2.4氧化應(yīng)激系統(tǒng)的檢測(cè) 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組MDA、SOD含量無明顯差異(P>0.05)，LIRI組MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低(均P<0.01)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組肺組織中MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高(均P<0.01)。見表2。

2.5肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β的測(cè)定 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量無明顯差異(P>0.05)，LIRI組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量明顯升高(P<0.05)。與LIRI組相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β濃度明顯降低(P<0.05)。見表3。

圖1 4組肺組織(HE染色，×100)

表2 各組血?dú)夥治龊秃粑鼌?shù)及MDA、SOD水平比較

表3 磷酸肌酸鈉預(yù)處理對(duì)肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的影響

2.6MPO活性的測(cè)定 與Sham組比較，Sham+磷酸肌酸鈉組在肺組織中MPO活性無明顯差異〔(1.079±0.126) vs (1.150±0.67)U/g,P>0.05〕。與LIRI組〔(2.993±0.149)U/g〕相比，LIRI+磷酸肌酸鈉組MPO〔(2.578±0.161)U/g〕活性明顯降低(P<0.05)。

2.7肺組織中細(xì)胞凋亡的測(cè)定 細(xì)胞核內(nèi)有褐色顆粒的細(xì)胞染色呈陽性，正常細(xì)胞核是藍(lán)色。與Sham組相比，Sham+磷酸肌酸鈉組的比例無明顯差異〔(2.738±1.376)%vs (3.023±1.578)%，P=0.656〕。LIRI組凋亡細(xì)胞比例〔(44.768±15.398)%〕明顯高于Sham組(P<0.01)，LIRI+磷酸肌酸鈉組凋亡細(xì)胞比例〔(27.498±6.178)%〕明顯低于LIRI組(P=0.038)。見圖2。

圖2 4組肺組織TUNEL染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞(×400)

3 討 論

LIRI是一種常見的臨床現(xiàn)象，多見PCI術(shù)后、急性心肌梗死的溶栓治療后、心肺復(fù)蘇和器官移植等血管開通后過程中。肺極容易受到損傷，盡管在免疫抑制方面和手術(shù)的管理的進(jìn)步，而肺移植的結(jié)局往往是固體器官臟器抑制結(jié)局最差的〔10〕。肺移植的成功受的移植肺功能喪失的限制，主要是由LIRI引起，缺血再灌注誘導(dǎo)胞死亡是導(dǎo)致肺功能衰竭和肺組織損傷的重要原因。其機(jī)制與肺泡的損傷和血管通透性有關(guān)。能量代謝障礙是發(fā)病基礎(chǔ)，氧自由基作用是重要發(fā)病環(huán)節(jié)〔11〕。磷酸肌酸是人體內(nèi)源性的高能化合物，通過“肌酸穿梭”機(jī)制完成線粒體氧化磷酸化成三磷酸腺苷(ATP)維持機(jī)體正常的能量代謝〔12〕。在病理情況下(缺血缺氧)，能量產(chǎn)生受阻，磷酸肌酸迅速將其磷酸鍵轉(zhuǎn)移至二磷酸腺苷(ADP)，防止或延遲ATP 的耗盡〔13〕。在腦、心等臟器缺血情況下發(fā)揮巨大作用，尤其在心臟疾病中有廣泛的臨床應(yīng)用，但卻在LIRI中還缺乏基礎(chǔ)及相關(guān)的臨床研究。LIRI是多分子、多機(jī)制、相互影響的病理演變過程，其發(fā)生的機(jī)制可能有：無菌性免疫反應(yīng)(先天性免疫、獲得性免疫)、補(bǔ)體激活、凝血激活、細(xì)胞死亡途徑的激活(凋亡、壞死、自噬)、內(nèi)皮功能異常、自由基氧化作用等有關(guān)〔14〕。強(qiáng)大的氧化應(yīng)激，是迅速發(fā)生再灌注后LIRI的主要啟動(dòng)因子，MDA，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，SOD是重要的抗氧化酶〔15〕。MDA是氧化應(yīng)激所致?lián)p傷的一個(gè)標(biāo)志，而SOD水平通常用于評(píng)估對(duì)細(xì)胞毒性活性氧物種的一級(jí)防御〔16〕。肺細(xì)胞凋亡在LIRI中起著重要作用〔17〕。磷酸肌酸鈉預(yù)處理在 LIRI開始前15 min以40 mg/kg的劑量靜脈注射，可顯著降低肺組織病理學(xué)改變，改善肺功能。肺組織中MDA及肺水腫程度減輕，SOD活性顯著升高。磷酸肌酸鈉預(yù)處理明顯降低肺組織細(xì)胞凋亡率。TNF-α和IL-1β的表達(dá)在肺缺血再灌注早期顯著上調(diào)。中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的激活和積聚是產(chǎn)生肺損傷的重要因素〔18〕，而MPO是中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放的溶酶體，其表達(dá)水平的升高表明白細(xì)胞在肺內(nèi)浸潤(rùn)程度高〔19〕。磷酸肌酸鈉預(yù)處理降低肺組織中MPO含量表達(dá)，降低支氣管肺泡灌洗液的炎癥介質(zhì)表達(dá)，表明尼可地爾可以抑制肺缺血再灌注產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)起到保護(hù)作用。

本研究驗(yàn)證了磷酸肌酸鈉預(yù)處理的有效性，在大鼠肺LIRI模型中，具有肺保護(hù)作用。其次磷酸肌酸鈉預(yù)處理可能的肺保護(hù)機(jī)制。其機(jī)制可能是通過抑制活性氧生成和抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，抑制無菌性免疫炎癥反應(yīng)。這將為擴(kuò)大磷酸肌酸鈉在臨床上的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)，其進(jìn)一步的作用機(jī)制值得更深層次的研究。